三种脐带间充质干细胞的分离与培养

摘要

本实验方案描述了从脐动脉、脐静脉及华通胶中分离和培养间充质干细胞的方法。

摘要

脐带间充质干细胞（UC-MSCs）是再生医学的重要细胞来源。UC-MSCs 可从脐带华通胶、脐动脉和脐静脉中分离获得。它们分别被称为来源于脐动脉的血管周围干细胞（UCA-PSCs）、来源于脐静脉的血管周围干细胞（UCV-PSCs）以及来源于华通胶的间充质干细胞（WJ-MSCs）。UCA-PSCs 和 UCV-PSCs 是来源于血管周围区域的周细胞，属于间充质干细胞的前体细胞。这三类细胞的分离与培养是研究干细胞移植与修复的重要来源。本实验方案重点介绍通过机械分离法、贴壁培养法以及细胞爬出法进行细胞的分离与培养。通过该技术，可获得三种不同类型的干细胞。采用流式细胞术检测细胞表面标志物，并通过成脂、成骨及类神经分化检测干细胞的多向分化潜能，结果符合间充质干细胞的表型特征。本实验方案拓展了UC-MSCs的来源，同时，该细胞分离方法为再生医学及其他应用的深入研究提供了基础。

引言

人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）因其操作无创、免疫原性低且无伦理争议，被广泛应用于再生医学领域¹。许多研究表明，从华通胶（Wharton's jelly, WJ）中分离出的UC-MSCs能够贴壁生长，具有多向分化潜能，并表达间充质干细胞（MSCs）的标志物²。然而，几乎所有MSCs均起源于血管周围区域³。周细胞作为血管周围细胞的一个亚群，是MSCs的前体细胞⁴。因此，可从脐带华通胶（WJ）、脐动脉（UCAs）和脐静脉（UCV）中分别分离出UC-MSCs，即分别为UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs⁵。本方法旨在分离并培养这三种不同类型的干细胞。UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs的分离与培养对于拓展MSCs的来源具有重要意义。

本研究描述了脐带动脉间充质干细胞（UCA-PSCs）、脐带静脉间充质干细胞（UCV-PSCs）和华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）的分离、培养及其未来应用。这些细胞具有细胞黏附特性，表达间充质干细胞标志物，并具备多向分化潜能。分离得到的干细胞通过显微镜观察，并进行细胞培养、传代、冷冻保存及复苏。该技术的原理基于细胞从组织中爬出的现象。与以往复杂且昂贵的方法（如流式细胞术或免疫磁珠法....

方案

所有实验程序均经苏州大学附属第三医院临床研究伦理委员会批准。已从人类受试者获得知情书面同意。本研究纳入了经阴道顺产或剖宫产分娩的个体，以获取脐带组织。脐带来源于健康新生儿，无性别偏向。新生儿Apgar评分为8–10分。Apgar评分是在新生儿出生后不久进行的一项快速评估，用于检查婴儿的肌张力、心率及其他生命体征，以判断是否需要额外的医疗干预或紧急处理⁷。另一方面，患有重大疾病（如心脏、肝脏、肾脏疾病或其他传染性疾病）的个体被排除在本研究之外。

1. 人类脐带的采集

1. 将新生儿脐带放入磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 4 °C 条件下运输。
   注意：本研究使用了来自三位供体的三条脐带。
2. 在无菌条件下立即清除脐带血，沿脐带血管长轴切开约 20 cm。分离出约 20 cm 长的脐动脉和脐静脉，并小心去除表面的华通胶。
   注意：从每个区域获取组织块培养物，将其剪切成小块（1–2 mm³），以避免三种干细胞之间的交叉污染。
3. 将脐动脉、脐静脉和华通胶剪切成 1–2 mm³ 大小，并接种至 100 mm 细胞培养皿中。使用镊子按照先前发表的文献方法⁵进行脐动脉、脐静脉和华通胶的接种。无需预先包被 100 mm 培养皿。
   &....

结果

从脐带中分离和培养脐动脉PSCs、脐静脉PSCs及华通胶MSCs
将脐动脉、脐静脉和华通胶从脐带中机械分离，并切割成2-3 cm³的小块。动脉、静脉或华通胶组织块之间的距离约为1 cm，呈梅花状排列（图1A-C）。采用组织贴壁培养法分离这三种干细胞⁵。贴壁培养约1周后，可见细胞呈放射状爬出，形态为细长梭形，并快速增殖（图1D-F）。约2周时细胞融合度达到70%-80%，传代后生长速度加快。细胞呈现均匀的梭形、平行排列或漩涡状生长（图1G-I）。此外，CCK-8检测结果显示不同干细胞的增殖趋势相似（补充图1）。然而，在.......

讨论

本研究从脐动脉、脐静脉和华通胶中分离出三种不同类型的细胞。脐带属于分娩废弃物，其使用简便、安全，且不存在伦理争议⁵。脐带间充质干细胞（UC-MSCs）具有原始性，且分化能力较强¹。既往研究表明，采用胶原酶、胰蛋白酶和透明质酸酶消化法从脐带中分离的UC-MSCs数量并不充足；约70%的样本中干细胞无法进行多次传代，难以满足临床需求¹⁰。其他UC-MSCs分离方法，如流式细胞术或免疫磁珠技术，操作复杂且成本较高¹¹。贴壁分离法⁶可快速、大量地分离UC-MSCs，其体外分化与增殖能力强于胶原酶消化法所获得的细胞in vitro¹²，并可迅速扩增以获得足够的间充质干细胞，满足临床治疗的需求^13,14。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
成脂分化试剂盒	Gibco	A1007001	多向分化
茜素红染色液	Sigma	A5533	多向分化
抗CD13抗体	Thermo Fisher Scientific	MA1-12034	流式分析
抗CD34抗体	BD Biosciences	560942	流式分析
抗CD45抗体	BD Biosciences	561865	流式分析
抗CD73抗体	BD Biosciences	940294	流式分析
抗HLA-DR抗体	BD Biosciences	555560	流式分析
抗荧光淬灭剂	Abcam	AB103748	免疫荧光
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	多向分化
ATRA	STEMCELL Technologies	302-79-4	细胞培养
bFGF	Gibco	13256029	多向分化
BSA	Sigma	V900933	免疫荧光
细胞培养箱	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 240i	细胞培养
细胞计数试剂盒-8	Dojindo	CK04	细胞增殖
离心机	Thermo Fisher Scientific	Sorvall™ MTX-150	细胞培养
DAPI	Sigma	10236276001	免疫荧光
DMSO	Sigma	D1435	细胞培养
FBS	Gibco	10099141	细胞培养
FITC小鼠抗人IgG	BD Biosciences	560952	流式分析
流式细胞仪	Thermo Fisher Scientific	A24864	流式分析
荧光显微镜	Thermo Fisher Scientific	IM-5	流式分析
明胶	Sigma	48722	多向分化
Leica显微镜	Leica	DM500	多向分化
低糖DMEM培养基	Gibco	11-885-084	细胞培养
酶标仪	Thermo Fisher Scientific	A51119500C	细胞增殖
神经元诱导试剂	Gibco	A1647801	多向分化
油红O溶液	Sigma	O1516	多向分化
成骨诱导试剂	Cyagen	HUXXC-90021	多向分化
多聚甲醛	Sangon Biotech	30525-89-4	免疫荧光
巴斯德吸管	Biosharp	BS-XG-03L	细胞培养
PBS（磷酸盐缓冲液）	Hyclone	SH30256.LS	细胞培养
青霉素-链霉素	Hyclone	SV30010	细胞培养
抗NSE一抗	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	多向分化
SPSS 22.0	IBM	SPSS 22.0	统计分析
细胞爬片	CITOTEST Scientific	80346-0910	多向分化
TritonX-100	Sangon Biotech	9002-93-1	免疫荧光
胰蛋白酶	Gibco	25300120	细胞培养