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方法文章

三种脐带间充质干细胞的分离与培养

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DOI：

10.3791/64065

⸱

2022年8月23日

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案描述了从脐动脉、脐静脉及华通胶中分离和培养间充质干细胞的方法。

摘要

脐带间充质干细胞（UC-MSCs）是再生医学的重要细胞来源。UC-MSCs 可从脐带华通胶、脐动脉和脐静脉中分离获得。它们分别被称为来源于脐动脉的血管周围干细胞（UCA-PSCs）、来源于脐静脉的血管周围干细胞（UCV-PSCs）以及来源于华通胶的间充质干细胞（WJ-MSCs）。UCA-PSCs 和 UCV-PSCs 是来源于血管周围区域的周细胞，属于间充质干细胞的前体细胞。这三类细胞的分离与培养是研究干细胞移植与修复的重要来源。本实验方案重点介绍通过机械分离法、贴壁培养法以及细胞爬出法进行细胞的分离与培养。通过该技术，可获得三种不同类型的干细胞。采用流式细胞术检测细胞表面标志物，并通过成脂、成骨及类神经分化检测干细胞的多向分化潜能，结果符合间充质干细胞的表型特征。本实验方案拓展了UC-MSCs的来源，同时，该细胞分离方法为再生医学及其他应用的深入研究提供了基础。

引言

人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）因其操作无创、免疫原性低且无伦理争议，被广泛应用于再生医学领域1。许多研究表明，从华通胶（Wharton's jelly, WJ）中分离出的UC-MSCs能够贴壁生长，具有多向分化潜能，并表达间充质干细胞（MSCs）的标志物2。然而，几乎所有MSCs均起源于血管周围区域3。周细胞作为血管周围细胞的一个亚群，是MSCs的前体细胞4。因此，可从脐带华通胶（WJ）、脐动脉（UCAs）和脐静脉（UCV）中分别分离出UC-MSCs，即分别为UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs5。本方法旨在分离并培养这三种不同类型的干细胞。UCA-PSCs、UCV-PSCs和WJ-MSCs的分离与培养对于拓展MSCs的来源具有重要意义。

本研究描述了脐带动脉间充质干细胞（UCA-PSCs）、脐带静脉间充质干细胞（UCV-PSCs）和华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）的分离、培养及其未来应用。这些细胞具有细胞黏附特性，表达间充质干细胞标志物，并具备多向分化潜能。分离得到的干细胞通过显微镜观察，并进行细胞培养、传代、冷冻保存及复苏。该技术的原理基于细胞从组织中爬出的现象。与以往复杂且昂贵的方法（如流式细胞术或免疫磁珠法）相比6，采用贴壁分离与细胞爬出法可大规模获取脐带来源的间充质干细胞（US-MSCs）；此方法已在先前研究中使用5。对所获得的干细胞进行流式细胞术分析，以检测其是否表达间充质干细胞标志物。通过诱导干细胞的多向分化，检测这三种细胞是否具有分化为脂肪细胞、成骨细胞和神经前体细胞的潜能。从脐带中分离和培养这三种类型的干细胞，对于临床应用具有重要意义，并为研究人员开展多种未来的应用提供了帮助。

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方案

所有实验程序均经苏州大学附属第三医院临床研究伦理委员会批准。已从人类受试者获得知情书面同意。本研究纳入了经阴道顺产或剖宫产分娩的个体，以获取脐带组织。脐带来源于健康新生儿，无性别偏向。新生儿Apgar评分为8–10分。Apgar评分是在新生儿出生后不久进行的一项快速评估，用于检查婴儿的肌张力、心率及其他生命体征，以判断是否需要额外的医疗干预或紧急处理7。另一方面，患有重大疾病（如心脏、肝脏、肾脏疾病或其他传染性疾病）的个体被排除在本研究之外。

1. 人类脐带的采集

  1. 将新生儿脐带放入磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在 4 °C 条件下运输。
    注意：本研究使用了来自三位供体的三条脐带。
  2. 在无菌条件下立即清除脐带血，沿脐带血管长轴切开约 20 cm。分离出约 20 cm 长的脐动脉和脐静脉，并小心去除表面的华通胶。
    注意：从每个区域获取组织块培养物，将其剪切成小块（1–2 mm3），以避免三种干细胞之间的交叉污染。
  3. 将脐动脉、脐静脉和华通胶剪切成 1–2 mm3 大小，并接种至 100 mm 细胞培养皿中。使用镊子按照先前发表的文献方法5进行脐动脉、脐静脉和华通胶的接种。无需预先包被 100 mm 培养皿。
    ​注意：脐动脉、脐静脉或华通胶之间的间距约为 1 cm。细胞分离前过长的收集时间可能影响细胞活力和数量。建议立即从脐带中分离动脉和静脉。总收集时间不超过 4 小时。

2. UCA-PSCs、UCV-PSCs 和 WJ-MSCs 的分离与培养

  1. 将细胞培养皿倒置，在5% CO₂培养箱中孵育3小时2 在添加培养基之前，将培养皿置于37 °C培养箱中孵育，以确保脐动脉、脐静脉及华通胶组织紧密贴附于细胞培养皿。
    1. 3小时后，将细胞培养皿恢复至正常放置位置。加入5 mL细胞培养基（LG-DMEM，10% FBS，100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素，参见 材料表) 加入细胞培养皿中。
  2. 向细胞培养皿中分别加入 3 mL 和 2 mL 培养基rd 和 7th 第一周的每一天。注意不要触碰脐动脉、脐静脉和华通胶的组织块。
  3. 第二周更换一半液体培养基两次，第三周更换全部液体培养基两次。
  4. 约7天后观察细胞从组织块中爬出，约2周细胞融合度达80%时，弃去组织块。
    1. 当细胞融合度达到100%时，离心（600 × g）后用2 mL 0.05%胰蛋白酶按1:3比例传代 g 室温下持续 4 分钟。
      注意：从脐带中分离的原代细胞数量约为 2 x 106 UCA-PSCs，1 × 106 UCV-PSCs 和 2 × 106 WJ-MSCs。2 × 106 UCA-PSCs，1 × 106 UCV-PSCs，以及 2 × 106 从20 cm脐带组织中分离出WJ-MSCs。三份脐带样本中均有细胞爬出，表明不同分离批次之间的结果具有可重复性。
    2. 以 5 x 10 的浓度接种细胞5/100 cm2 在培养皿中。保留 5 x 105 1 mL 冻存液（90% FBS，10% DMSO）中的细胞。本研究使用第3至第5代细胞。

通过流式细胞术检测MSC表面标志物

  1. 用0.05%胰蛋白酶消化第三代细胞，获得单细胞悬液。在室温下以600 × g 离心4分钟，并用巴斯德吸管弃去细胞上清液。然后将1 × 105 个细胞重悬于100 µL PBS（1% FBS）中。参照已发表的文献方法8，使用血细胞计数板对细胞数量进行计数评估。
  2. 将1 × 105 个细胞与针对CD13（FITC，0.1 mg/mL）、CD34（FITC，0.1 mg/mL）、CD45（FITC，0.1 mg/mL）、CD73（FITC，0.1 mg/mL）和HLA-DR（FITC，0.1 mg/mL）的各种藻红蛋白抗体在避光条件下孵育30分钟。作为对照，将1 × 105 个细胞与FITC-IgG（FITC小鼠抗人IgG，0.1 mg/mL）孵育（见材料表）。
  3. 在室温下以600 × g 离心细胞4分钟，然后用巴斯德吸管弃去细胞上清液。将1 × 105 个细胞重悬于500 µL PBS（1% FBS）中，通过流式细胞术检测，并使用FlowJo2 软件进行分析（见材料表）。

4. UCA-PSCs、UCV-PSCs 和 WJ-MSCs 向脂肪细胞的分化

  1. 将第三代细胞以 6 × 104 个细胞/cm2 的密度接种于 24 孔板中，每孔加入 500 µL 细胞培养基（低糖 DMEM、10% 胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素，参见材料表），置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
  2. 24 小时后更换细胞培养基，对照组更换为细胞培养基（低糖 DMEM、10% 胎牛血清、100 IU/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）。当细胞在 24 孔板中融合度达到 80% 时，进行实验。
    注意：诱导成脂分化的各组细胞更换为成脂诱导培养基（成脂分化试剂盒，参见材料表）。两组细胞的培养基均每 3 天更换一次。
  3. 在成脂诱导组中，于诱导后约 21 天观察细胞内的脂滴，随后终止成脂诱导过程。
    注意：通过更换为细胞培养基来终止成脂诱导2,5。此外，对照组细胞无明显变化。
  4. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，然后在室温下用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。之后再用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
  5. 弃去 PBS，在室温下将细胞干燥约 20 分钟。然后每孔加入 500 µL 油红 O 染液（0.5%）（参见材料表），染色 10 分钟。
  6. 移除油红 O 染液，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。在显微镜下观察细胞。

5. 将干细胞分化为成骨细胞

  1. 加入500 µL的0.1%明胶（见 材料表每孔加入24孔培养板中，30分钟后弃去。
  2. 接种 6 x 104/cm2 的 将第三代细胞接种至24孔培养板中，每孔加入500 µL细胞培养基或成骨诱导培养基（成骨分化试剂盒，见 材料表) 加入至每个孔中，在5% CO₂条件下2 在37 °C培养箱中孵育。对照组每3天更换一次细胞培养基，成骨诱导分化组每3天更换一次成骨诱导培养基。
  3. 3–4 周后，观察细胞中是否有黑色钙盐沉积。用 PBS 洗涤孔板，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  4. 室温下用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。加入1%茜素红染色液，室温孵育20分钟，然后弃去染色液。
  5. 室温干燥30分钟后，在显微镜下观察细胞。

6. 干细胞向神经元的分化

  1. 将第三代细胞以6 × 104/cm2的密度接种于24孔培养板中，孔内预先放置经L-多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片。将细胞爬片（见材料表）放入24孔板中，以诱导细胞向神经元分化。在细胞爬片上进行细胞培养。
  2. 随后，向孔中加入500 µL细胞培养基，24小时后更换为500 µL神经元诱导培养基9（见材料表）。
  3. 诱导24小时后，在培养液中加入10-7 mol/L的全反式维甲酸（ATRA）和10 ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（见材料表），以维持神经元的诱导分化状态。
  4. 当出现明显的细胞突触结构时终止诱导。使用显微镜技术观察明显的细胞突触形成情况（见材料表）。
    注意：采用免疫荧光染色法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE，见材料表）这一神经元特异性标志物，以确认神经元身份2。
  5. 对细胞爬片进行共聚焦成像。

7. 免疫荧光染色

  1. 弃去细胞培养液后，用 500 µL PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤三次。
  2. 然后向孔中加入 500 µL 4% 多聚甲醛，在室温下固定细胞 45 分钟。
  3. 用 PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤三次。
  4. 用 100 µL 0.5% Triton-X 在室温下对细胞进行通透处理，持续 5 分钟。
  5. 用含 1% BSA 的 500 µL PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤三次。
  6. 每孔加入含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 500 µL PBS，在 37 °C 孵育 45 分钟，以封闭非特异性结合位点。
  7. 用含 1% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS（1:100 稀释）将抗 NSE 一抗（1:100，参见 材料表）稀释，并在 4 °C 下与细胞孵育过夜。
  8. 弃去一抗后，用含 1% BSA 的 500 µL PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤三次。
  9. 将荧光二抗（山羊抗小鼠 IgG H&L，Alexa Fluor 488，参见 材料表）用含 1% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS 按 1:200 稀释，每孔加入稀释后的二抗，在 37 °C 避光孵育 60 分钟。
  10. 每孔加入 500 µL PBST（含 0.1% Tween-20 的 PBS），在避光条件下洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤三次。
  11. 向孔中加入 200 µL DAPI 染液（用 PBST 稀释，0.1 µg/mL），在室温避光条件下染色细胞核 5 分钟。
  12. 用 500 µL PBST 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤三次，全程避光。
  13. 向载玻片上滴加抗荧光淬灭剂，然后轻轻盖上盖玻片，并在盖玻片周围滴加指甲油以固定。
  14. 使用激光共聚焦显微镜观察样品。显微镜设置如下：绿色通道使用 488 nm 激光，DAPI 通道使用 405 nm 激光。

8. 增殖实验

  1. 将2 × 103个细胞接种至96孔板的每个孔中，每孔加入100 µL细胞培养基。
  2. 每孔加入10 µL细胞计数试剂盒-8（CCK-8，参见材料表）。
  3. 孵育2天后，在第1至第7天使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值）。
  4. 使用统计学软件（参见材料表）分析不同类型干细胞的OD值，并以均值±标准差（SD）表示。采用单因素方差分析（ANOVA），以P值< 0.05为差异具有统计学意义。

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结果

从脐带中分离和培养脐动脉PSCs、脐静脉PSCs及华通胶MSCs
将脐动脉、脐静脉和华通胶从脐带中机械分离，并切割成2-3 cm3的小块。动脉、静脉或华通胶组织块之间的距离约为1 cm，呈梅花状排列（图1A-C）。采用组织贴壁培养法分离这三种干细胞5。贴壁培养约1周后，可见细胞呈放射状爬出，形态为细长梭形，并快速增殖（图1D-F）。约2周时细胞融合度达到70%-80%，传代后生长速度加快。细胞呈现均匀的梭形、平行排列或漩涡状生长（图1G-I）。此外，CCK-8检测结果显示不同干细胞的增殖趋势相似（补充图1）。然而，在...

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讨论

本研究从脐动脉、脐静脉和华通胶中分离出三种不同类型的细胞。脐带属于分娩废弃物，其使用简便、安全，且不存在伦理争议5。脐带间充质干细胞（UC-MSCs）具有原始性，且分化能力较强1。既往研究表明，采用胶原酶、胰蛋白酶和透明质酸酶消化法从脐带中分离的UC-MSCs数量并不充足；约70%的样本中干细胞无法进行多次传代，难以满足临床需求10。其他UC-MSCs分离方法，如流式细胞术或免疫磁珠技术，操作复杂且成本较高11。贴壁分离法6可快速、大量地分离UC-MSCs，其体外分化与增殖能力强于胶原酶消化法所获得的细胞in vitro12，并可迅速扩增以获得足够的间充质干细胞，满足临床治疗的需求13,14。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者希望感谢常州市科学技术局基础研究项目（项目编号 CJ20200110，负责人：YJY）、国家自然科学基金（项目编号 82001629，负责人：XQS）、江苏省自然科学基金青年项目（项目编号 BK20200116，负责人：XQS）以及江苏省博士后科研资助计划（项目编号 2021K277B，负责人：XQS）提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
成脂分化试剂盒GibcoA1007001多向分化
茜素红染色液SigmaA5533多向分化
抗CD13抗体Thermo Fisher ScientificMA1-12034流式分析
抗CD34抗体BD Biosciences560942流式分析
抗CD45抗体BD Biosciences561865流式分析
抗CD73抗体BD Biosciences940294流式分析
抗HLA-DR抗体BD Biosciences555560流式分析
抗荧光淬灭剂AbcamAB103748免疫荧光
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)abcamab150113多向分化
ATRASTEMCELL Technologies302-79-4细胞培养
bFGFGibco13256029多向分化
BSASigmaV900933免疫荧光
细胞培养箱Thermo Fisher ScientificHERAcell 240i细胞培养
细胞计数试剂盒-8DojindoCK04细胞增殖
离心机Thermo Fisher ScientificSorvall™ MTX-150细胞培养
DAPISigma10236276001免疫荧光
DMSOSigmaD1435细胞培养
FBSGibco10099141细胞培养
FITC小鼠抗人IgGBD Biosciences560952流式分析
流式细胞仪Thermo Fisher ScientificA24864流式分析
荧光显微镜Thermo Fisher ScientificIM-5流式分析
明胶Sigma48722多向分化
Leica显微镜LeicaDM500多向分化
低糖DMEM培养基Gibco11-885-084细胞培养
酶标仪Thermo Fisher ScientificA51119500C细胞增殖
神经元诱导试剂GibcoA1647801多向分化
油红O溶液SigmaO1516多向分化
成骨诱导试剂CyagenHUXXC-90021多向分化
多聚甲醛Sangon Biotech30525-89-4免疫荧光
巴斯德吸管BiosharpBS-XG-03L细胞培养
PBS（磷酸盐缓冲液）HycloneSH30256.LS细胞培养
青霉素-链霉素HycloneSV30010细胞培养
抗NSE一抗Santa Cruz Biotechnologysc-292097多向分化
SPSS 22.0IBMSPSS 22.0统计分析
细胞爬片CITOTEST Scientific80346-0910多向分化
TritonX-100Sangon Biotech9002-93-1免疫荧光
胰蛋白酶Gibco25300120细胞培养

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脐带干细胞华通胶血管周干细胞细胞分离贴壁培养机械分离流式细胞术多向分化再生医学

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