我们描述了大鼠后肢复合体的手术技术及脱细胞处理过程。脱细胞采用低浓度十二烷基硫酸钠通过灌注进行 离体 机器灌注系统
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本文内容
摘要
摘要
严重创伤和组织缺损患者需要复杂的外科重建治疗。血管化复合组织异体移植（VCA）是一种新兴的重建手段，可将多种组织作为复合亚单位进行整体移植。尽管VCA前景广阔，但长期免疫抑制治疗的需求仍构成重大限制，因其会增加恶性肿瘤、终末器官毒性及机会性感染的风险。脱细胞复合支架的组织工程学构建可能成为减少免疫抑制需求的替代方案。本文描述了大鼠后肢的获取及其后续使用十二烷基硫酸钠（SDS）进行脱细胞处理的方法。所采用的获取策略基于股总动脉。构建并使用了一套基于机械灌注的生物反应器系统 离体 下肢脱细胞化。成功实施灌注脱细胞化处理，下肢呈现白色半透明状外观。观察到下肢内完整且可灌注的血管网络。组织学分析显示，所有组织区室内的细胞核成分已被清除，而组织架构得以保留。
引言
对于需要复杂外科重建的患者而言，血管化复合组织移植（VCA）是一种新兴的治疗选择。创伤性损伤或肿瘤切除会导致体积性组织缺损，难以进行重建。VCA 可将供体的多种组织（如皮肤、骨骼、肌肉、神经和血管）作为复合移植物整体移植给受体1。尽管该技术前景广阔，但其应用仍受限于长期使用免疫抑制剂所带来的问题。终身使用此类药物会增加机会性感染、恶性肿瘤以及终末器官毒性的风险1,2,3。为了减少甚至消除对免疫抑制治疗的依赖，采用脱细胞化技术制备的组织工程支架在 VCA 中展现出巨大潜力。
组织脱细胞是指在去除细胞和细胞核成分的同时，保留细胞外基质的结构。这种脱细胞支架可重新接种患者特异性细胞4。然而，保持复合组织中细胞外基质网络的完整性是一项额外的挑战，原因在于支架内存在多种组织类型，其组织密度、结构架构和解剖位置各不相同。本方案提供了一种针对大鼠后肢的外科手术技术及脱细胞方法，作为将该组织工程技术应用于复合组织的原理验证模型。该方法也可为进一步通过再细胞化实现复合组织再生的研究提供基础。
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方案
所有实验均使用来自多伦多综合医院研究所的雄性 Lewis 大鼠尸体（300-430 g）。所有手术操作均采用无菌器械和材料以维持无菌技术（参见材料表）。所有操作均遵循多伦多综合医院研究所、大学健康网络（加拿大安大略省多伦多）动物护理委员会的指导方针进行。共对四只后肢进行了脱细胞处理。
1. 术前准备
- 配制50 mL的5%肝素化生理盐水。使用5 mL注射器从50 mL生理盐水袋中抽出2.5 mL生理盐水并弃去。再使用5 mL注射器向生理盐水袋中加入2.5 mL肝素。翻转生理盐水袋以混匀内容物。
- 将大鼠尸体置于蓝色垫巾上，呈仰卧位。使用电动剃刀对后肢及腹股沟区域进行环形剃毛，并清除毛发。
- 将大鼠移至手术台，用纱布蘸取聚维酮碘擦洗液擦拭后肢和腹股沟区域。随后，用纱布蘸取70%异丙醇擦去擦洗液。
- 弃去步骤1.2中使用的蓝色垫巾，并更换为新的无菌手套。
2. 大鼠后肢的获取
- 使用#10手术刀片和#3刀柄，沿腹股沟韧带水平从外侧向内侧方向做皮肤切口（图1A）。使用Adson镊子夹持周围皮肤，以确保切口平滑。
- 当暴露皮下脂肪时，采用钝性....
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结果
采购方案成功分离并插管了股总动脉，为后续灌注步骤奠定了基础。代表性解剖图像如下所示 图1A，B 显示切口位置及股血管的暴露情况，确保与分叉点保持足够的距离。 图2 显示了制备生物反应器和灌注回路所需的装置。脱细胞终点通过观察组织呈现白色、半透明样外观来确定。 离体 机器灌注系统成功实现了大鼠后肢的灌注脱细胞。维持了单次通过的封闭式循环系统（图3）。经过5天0.25% SDS灌注后，原生后肢的大体形态变为白色、苍白的外观（图4).
使用苏木精和伊红（H&E）染色后，观察到股血管、皮肤、神经、骨和肌肉中的细胞成分被去除，未见细胞核存在。各组织的结构均相对于天然组织进行了分析。脱细胞处理后的股动脉和股静脉均显示所有层次及周围结缔组织中细胞核成分完全消失，表现为无蓝色染色的细胞核，而天然血管中则.......
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讨论
大鼠后肢作为血管化复合组织移植（VCA）的实验模型具有重要价值5。脱细胞支架的组织工程是解决VCA相关长期免疫抑制治疗缺陷的第一步。由于复合移植物包含多种组织，每种组织都具有独特的功能、免疫原性和结构特性，因此其应用面临更大的挑战。本方案展示了一种成功获取大鼠脱细胞复合后肢的方法。这些支架可进一步实现再细胞化，为VCA提供概念验证模型。
为确保成功获取并完成脱细胞处理，在手术和脱细胞过程中存在多个关键步骤。为了使去污剂和灭菌溶液在天然血管系统中实现全身性分布，关键步骤包括结扎腹壁下血管，以及在结扎股动静脉前，确保与动静脉网络分叉点保持足够的距离。文中所述的灭菌程序有助于降低生物负荷，从而为后续的再细胞化实验提供支持；在这些实验中，细胞的黏附、存活和生长需要无菌环境6。
我们还介绍了一种专为实现脱细胞化而设计的灌注生物反应器系统。关键组件包括：利用蠕动泵实现连续灌注，并允许去污剂和灭菌剂通过插管动脉进行单程灌注。蠕动泵还被设定为脉动流.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
图3A 使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠注射液 USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL 一次性血清移液管 | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc 一次性注射器 | 来自研究机构 | ||
| 三通旋塞阀 | 来自研究机构 | ||
| 5cc 一次性注射器 | 来自研究机构 | ||
| 70% 异丙醇 | 来自研究机构 | ||
| Acrodisc 注射器滤器 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| 直型阿克曼镊 | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 24G 19 mm 血管导管（Angiocatheter）¾”) | VWR | 38112 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩液）100 mL | 多细胞 | 450-115-EL | |
| 骨剪 | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| 连接器 1/16" 至 1/8" 管子 | McMasterCarr | 5117K52 | |
| 雌性鲁尔接头转凸形接头适配器（PVDF）- 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 精细镊子，带微钝尖端 | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 肝素钠注射液 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| 雄性鲁尔接头转凸形接头转换器（PVDF）- 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| 微型持针器 | WLorenz | 04-4125 | |
| 显微剪 | WLorenz | SP-4506 | |
| 过氧乙酸 | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| 蠕动泵，3通道 | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| 磷酸盐缓冲液 1× 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| 聚维酮碘外科洗手液 | 来自研究机构 | ||
| 泵管，三通，Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| 泵管，铂金硫化硅胶 | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| 手术刀片 - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| 手术刀柄 - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 十二烷基硫酸钠 试剂级：纯度： >99%，1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| 6-0 外科缝合线 | Covidien | VS889 |
参考文献
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al.
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重印与许可
