我们描述了大鼠后肢复合体的手术技术及脱细胞处理过程。脱细胞采用低浓度十二烷基硫酸钠通过灌注进行 离体 机器灌注系统
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本文内容
摘要
摘要
严重创伤和组织缺损患者需要复杂的外科重建治疗。血管化复合组织异体移植（VCA）是一种新兴的重建手段，可将多种组织作为复合亚单位进行整体移植。尽管VCA前景广阔，但长期免疫抑制治疗的需求仍构成重大限制，因其会增加恶性肿瘤、终末器官毒性及机会性感染的风险。脱细胞复合支架的组织工程学构建可能成为减少免疫抑制需求的替代方案。本文描述了大鼠后肢的获取及其后续使用十二烷基硫酸钠（SDS）进行脱细胞处理的方法。所采用的获取策略基于股总动脉。构建并使用了一套基于机械灌注的生物反应器系统 离体 下肢脱细胞化。成功实施灌注脱细胞化处理，下肢呈现白色半透明状外观。观察到下肢内完整且可灌注的血管网络。组织学分析显示，所有组织区室内的细胞核成分已被清除，而组织架构得以保留。
引言
对于需要复杂外科重建的患者而言，血管化复合组织移植（VCA）是一种新兴的治疗选择。创伤性损伤或肿瘤切除会导致体积性组织缺损，难以进行重建。VCA 可将供体的多种组织（如皮肤、骨骼、肌肉、神经和血管）作为复合移植物整体移植给受体1。尽管该技术前景广阔，但其应用仍受限于长期使用免疫抑制剂所带来的问题。终身使用此类药物会增加机会性感染、恶性肿瘤以及终末器官毒性的风险1,2,3。为了减少甚至消除对免疫抑制治疗的依赖，采用脱细胞化技术制备的组织工程支架在 VCA 中展现出巨大潜力。
组织脱细胞是指在去除细胞和细胞核成分的同时，保留细胞外基质的结构。这种脱细胞支架可重新接种患者特异性细胞4。然而，保持复合组织中细胞外基质网络的完整性是一项额外的挑战，原因在于支架内存在多种组织类型，其组织密度、结构架构和解剖位置各不相同。本方案提供了一种针对大鼠后肢的外科手术技术及脱细胞方法，作为将该组织工程技术应用于复合组织的原理验证模型。该方法也可为进一步通过再细胞化实现复合组织再生的研究提供基础。
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方案
所有实验均使用来自多伦多综合医院研究所的雄性 Lewis 大鼠尸体（300-430 g）。所有手术操作均采用无菌器械和材料以维持无菌技术（参见材料表）。所有操作均遵循多伦多综合医院研究所、大学健康网络（加拿大安大略省多伦多）动物护理委员会的指导方针进行。共对四只后肢进行了脱细胞处理。
1. 术前准备
- 配制50 mL的5%肝素化生理盐水。使用5 mL注射器从50 mL生理盐水袋中抽出2.5 mL生理盐水并弃去。再使用5 mL注射器向生理盐水袋中加入2.5 mL肝素。翻转生理盐水袋以混匀内容物。
- 将大鼠尸体置于蓝色垫巾上，呈仰卧位。使用电动剃刀对后肢及腹股沟区域进行环形剃毛，并清除毛发。
- 将大鼠移至手术台，用纱布蘸取聚维酮碘擦洗液擦拭后肢和腹股沟区域。随后，用纱布蘸取70%异丙醇擦去擦洗液。
- 弃去步骤1.2中使用的蓝色垫巾，并更换为新的无菌手套。
2. 大鼠后肢的获取
- 使用#10手术刀片和#3刀柄，沿腹股沟韧带水平从外侧向内侧方向做皮肤切口（图1A）。使用Adson镊子夹持周围皮肤，以确保切口平滑。
- 当暴露皮下脂肪时，采用钝性分离法小心地分离脂肪组织，找到腹壁上血管。
- 使用显微剪刀向近端分离，暴露腹股沟韧带水平的股神经、股动脉和股静脉。
- 在解剖显微镜下辨认股血管，使用精细镊子向近端分离股动脉和股静脉，以获得足够的长度，从动脉网络的分叉点起始（图1B）。
- 使用6-0缝线分别结扎股动脉和股静脉。
- 在不干扰已结扎股血管的前提下，对剩余的后肢进行环周分离。
- 使用骨剪在股骨中段横断股骨。
- 为完全游离后肢，使用显微剪刀在结扎线远端横断已结扎的股血管。
- 在解剖显微镜下，使用24G套管针插入股动脉。使用精细镊子小心插入套管，用肝素化生理盐水冲洗，直至股静脉处观察到澄清的流出液。
- 通过在插管血管周围打一个结，并在套管远端再打一个结来固定套管。确保套管放置在近端，以防止阻塞分叉点。
- 将获取的后肢浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，直至进行脱细胞处理。
图1：大鼠后肢的获取。（A）从外侧至内侧沿腹股沟韧带水平标记皮肤切口。（B）股静脉和股动脉的解剖视图，已向腹股沟韧带方向近端分离，由虚线指示。缩写：L = 外侧；M = 内侧；FV = 股静脉；FA = 股动脉。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 溶液的配制
- 在6 L玻璃烧瓶中，通过将12.5 g十二烷基硫酸钠（SDS）粉末溶解于5 L超纯蒸馏水中，配制5 L的0.25% SDS洗涤剂储备液。用封口膜覆盖烧瓶口以密封。
- 在1 L玻璃广口瓶中，通过将2.5 g SDS溶解于1 L超纯蒸馏水中，单独配制1 L的0.25% SDS溶液。加入搅拌子，并在磁力搅拌器上搅拌至所有SDS完全溶解。
- 配制含1%抗生素-抗真菌剂（AA）的1 L 1×PBS洗涤液。在1 L烧瓶中加入990 mL 1×PBS溶液和10 mL AA。
- 另取500 mL玻璃广口瓶，使用495 mL 1×PBS溶液和5 mL AA，再次配制1×PBS + 1% AA溶液。
- 配制200 mL的1%过氧乙酸（PAA）/4%乙醇（EtOH）溶液。该溶液需在通风橱中配制。
4. 生物反应器与灌注回路的构建
注意：请参考图2，了解所列步骤中生物反应器和灌注回路的配置。
- 在500 mL的腔室（塑料容器）上，按照图2中标注的位置钻三个孔（1/4英寸）：A口为进液管，B口为补液管，C口为出液管。去除并丢弃多余的塑料碎屑。用70%乙醇喷洒并擦拭腔室。
- 剪取三段5 cm长的硅胶管，将每段管的一半分别插入腔室的三个接口中。在A口朝向腔室内部的开口端连接一个雄性鲁尔接头，在管子位于腔室外侧的另一端连接一个雌性鲁尔接头。
- 在B口和C口朝向腔室外侧的管端分别连接雌性鲁尔接头。
- 在该塑料容器的密封盖上，于盖面钻一个孔。
- 剪一段3 cm长的硅胶管，将其插入盖上的孔中。确保约有2 cm的管段位于盖外，如图2所示。
- 对带有管路的腔室和盖子进行灭菌处理。
- 使用剪刀剪取两段30 cm长的硅胶管。在每段管的一端连接一个1/16英寸转1/8英寸的接头。
- 另剪两段12 cm长的硅胶管。在每段管的一端连接一个1/16英寸转1/8英寸的接头；在其中一段管的另一端连接一个雄性鲁尔接头，在另一段管的另一端连接一个雌性鲁尔接头。
- 对步骤4.7和步骤4.8中的所有管路材料进行灭菌，并包括两根3通道泵管（1.85 mm）一并灭菌。
- 准备三个三通旋塞阀、一个注射器滤器、两支1 mL血清移液管和一支10 mL注射器，用于脱细胞装置。移除1 mL血清移液管中的滤膜。
图 2：生物反应器的准备及灌注回路的构建。 图中显示了灌注回路的装置，包括（A）蠕动泵和（B）进液与出液管路对应的卡匣。（C, D）还展示了长度分别为 12 cm 和 30 cm 的硅胶管及其相应的连接件。（E）用于蠕动泵的管路（1.85 mm）。（F）进液口、（G）补液口和（H）出液口标注清楚的生物反应器腔室。（I）带有通气孔的生物反应器盖。 请点击此处查看该图的放大版本。
5. 大鼠后肢脱细胞
- 将灭菌后的腔室安装到位，并在入口、出口和补充液管路上拧上三个一次性三通旋塞。确保补充液口的旋塞其余两个端口已加盖，以防止泄漏。
- 将步骤 4.8 中制备的管路连接至入口和出口管路的旋塞上。
- 将蠕动泵管连接到上述步骤中的管路上。将卡匣固定在蠕动泵管上，并将其放置于蠕动泵中。暂时不要将带管路的卡匣完全固定。
- 将步骤 4.7 中的一根管路连接到上述出口管路蠕动泵管的末端。在另一端连接一支 1 mL 移液管。将连接移液管的一端悬置于废液收集瓶中。
- 对入口管路重复步骤 4.7。将连接移液管的管路末端悬置于洗涤剂储液瓶中。立即用封口膜密封洗涤剂储液瓶的开口。参见 图 3A、B 了解脱细胞循环系统的整体示意图。
- 从 1 L 玻璃瓶（步骤 3.2）中取 0.25% SDS 加入生物反应器腔室，至半满位置。
- 使用 Adson 镊子夹取获取的后肢，并小心将其悬置于生物反应器腔室内。
- 使用两把 Adson 镊子将后肢已插管的部分引导至入口管路。用一把镊子夹住插管的同时，用另一把镊子旋转并固定入口管路与插管的连接。确保插管未被拉扯或扭转，以防脱管。
- 连接固定后，根据需要从 1 L 玻璃瓶中补充更多 0.25% SDS，使肢体完全浸没。确保出口端口也浸没在生物反应器储液腔中，以维持持续的流出（图 3C）。
- 参照步骤 4.4 和步骤 4.5，将一次性注射器滤器连接至生物反应器盖上的通气口。
- 将盖子固定在生物反应器上，并确保腔室四周完全密封（图 3B）。
- 为排除管路中的空气并启动灌注循环，使用一支新的、一次性 10 mL 注射器，通过入口管路的三通旋塞从洗涤剂储液瓶中抽取洗涤剂。
- 抽液后，使用同一液体注入出口管路的三通旋塞。确保入口和出口管路的整个管路系统中均有洗涤剂流通。
- 压下并固定带管路的卡匣，使其牢固安装在蠕动泵中。按下电源按钮启动蠕动泵。
- 在蠕动泵屏幕上，使用方向键进入第二个选项卡，设置第一通道的灌注速率。将流速设为给液模式，并将灌注速率设定为1 mL/min。根据装置设置确认流动方向正确。对第二通道重复相同操作。
- 校准蠕动泵，以确保通过入口管路输送和/或从出口管路抽取的液体流量在两个通道之间保持一致。确保管路内径设置为1.85 mm。
- 通过按下键盘上的电源按钮，以 1 mL/min 的流速开始对入口和出口管路进行机器灌注脱细胞。监测并确保入口和出口管路的流动持续且稳定。
- 继续脱细胞过程并每日监测。根据需要，通过补充液口使用 1 L 的 0.25% SDS（步骤 3.2）补充生物反应器储液腔。观察组织呈现白色半透明外观，通常在第 5 天出现，表明大鼠后肢已完成脱细胞。
图3: 大鼠后肢灌注脱细胞生物反应器回路概述 (A生物反应器灌注回路示意图。蓝色箭头指示洗涤剂和废液的流动方向。B) 含大鼠后肢的生物反应器脱细胞循环系统示意图。SDS 储液瓶（左侧烧瓶）连接至蠕动泵，再接入生物反应器的进液管路。流出液通过蠕动泵导入废液储液瓶（右侧烧瓶）。C（I）生物反应器，内含大鼠后肢，进液管连接至插管的股动脉。（II）位于角落的补液口，用于灌注洗涤剂。（III）流出管悬置于悬液储液器中。缩写：SDS = sodium dodecyl sulfate。 请点击此处以查看此图的放大版本。
6. 脱细胞后的清洗与灭菌
- 确认脱细胞完成后，将洗涤剂储液罐更换为1x PBS + 1% 抗生素/抗真菌剂（AA）储液罐。用封口膜密封烧瓶开口。以1 mL/min的流速开始1x PBS + 1% AA灌注，并持续2天。
- 将1x PBS + 1% AA储液罐更换为200 mL的0.1% 过氧乙酸（PAA）/4% 乙醇（EtOH）储液罐，并以1 mL/min的流速灌注2小时。
- 使用两把无菌Adson镊子将后肢与进液管路断开，其中一把镊子用于旋转进液管，另一把镊子夹持套管。操作时应确保不牵拉套管，以防脱管。
- 将肢体置于含有1x PBS + 1% AA的500 mL玻璃瓶中，于4 °C保存，以备后续使用。
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结果
采购方案成功分离并插管了股总动脉，为后续灌注步骤奠定了基础。代表性解剖图像如下所示 图1A，B 显示切口位置及股血管的暴露情况，确保与分叉点保持足够的距离。 图2 显示了制备生物反应器和灌注回路所需的装置。脱细胞终点通过观察组织呈现白色、半透明样外观来确定。 离体 机器灌注系统成功实现了大鼠后肢的灌注脱细胞。维持了单次通过的封闭式循环系统（图3）。经过5天0.25% SDS灌注后，原生后肢的大体形态变为白色、苍白的外观（图4).
使用苏木精和伊红（H&E）染色后，观察到股血管、皮肤、神经、骨和肌肉中的细胞成分被去除，未见细胞核存在。各组织的结构均相对于天然组织进行了分析。脱细胞处理后的股动脉和股静脉均显示所有层次及周围结缔组织中细胞核成分完全消失，表现为无蓝色染色的细胞核，而天然血管中则...
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讨论
大鼠后肢作为血管化复合组织移植（VCA）的实验模型具有重要价值5。脱细胞支架的组织工程是解决VCA相关长期免疫抑制治疗缺陷的第一步。由于复合移植物包含多种组织，每种组织都具有独特的功能、免疫原性和结构特性，因此其应用面临更大的挑战。本方案展示了一种成功获取大鼠脱细胞复合后肢的方法。这些支架可进一步实现再细胞化，为VCA提供概念验证模型。
为确保成功获取并完成脱细胞处理，在手术和脱细胞过程中存在多个关键步骤。为了使去污剂和灭菌溶液在天然血管系统中实现全身性分布，关键步骤包括结扎腹壁下血管，以及在结扎股动静脉前，确保与动静脉网络分叉点保持足够的距离。文中所述的灭菌程序有助于降低生物负荷，从而为后续的再细胞化实验提供支持；在这些实验中，细胞的黏附、存活和生长需要无菌环境6。
我们还介绍了一种专为实现脱细胞化而设计的灌注生物反应器系统。关键组件包括：利用蠕动泵实现连续灌注，并允许去污剂和灭菌剂通过插管动脉进行单程灌注。蠕动泵还被设定为脉动流...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
图3A 使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 氯化钠注射液 USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL 一次性血清移液管 | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc 一次性注射器 | 来自研究机构 | ||
| 三通旋塞阀 | 来自研究机构 | ||
| 5cc 一次性注射器 | 来自研究机构 | ||
| 70% 异丙醇 | 来自研究机构 | ||
| Acrodisc 注射器滤器 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| 直型阿克曼镊 | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 24G 19 mm 血管导管（Angiocatheter）¾”) | VWR | 38112 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液（100倍浓缩液）100 mL | 多细胞 | 450-115-EL | |
| 骨剪 | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| 连接器 1/16" 至 1/8" 管子 | McMasterCarr | 5117K52 | |
| 雌性鲁尔接头转凸形接头适配器（PVDF）- 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 精细镊子，带微钝尖端 | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 肝素钠注射液 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| 雄性鲁尔接头转凸形接头转换器（PVDF）- 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| 微型持针器 | WLorenz | 04-4125 | |
| 显微剪 | WLorenz | SP-4506 | |
| 过氧乙酸 | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| 蠕动泵，3通道 | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| 磷酸盐缓冲液 1× 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| 聚维酮碘外科洗手液 | 来自研究机构 | ||
| 泵管，三通，Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| 泵管，铂金硫化硅胶 | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| 手术刀片 - #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| 手术刀柄 - #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 十二烷基硫酸钠 试剂级：纯度： >99%，1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| 6-0 外科缝合线 | Covidien | VS889 |
参考文献
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