方法文章

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

DOI：

10.3791/64074

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2022年7月20日

1Department of Biochemistry & Molecular Biology, and Department of Neuroscience & Physiology, State University of New York (SUNY) Upstate Medical University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案旨在通过可视化动态微丝和微管提供操作指南 体外 全内反射荧光（TIRF）显微镜检测

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

传统上，肌动蛋白和微管细胞骨架被作为独立的实体进行研究，局限于特定的细胞区域或过程，并由各自独特的结合蛋白群分别调控。如今许多研究表明，这两种细胞骨架聚合物的动力学行为相互交织，且这种交互作用是大多数细胞行为所必需的。目前已鉴定出多种参与肌动蛋白-微管相互作用的蛋白质（如 Tau、MACF、GAS、formins 等），并对它们在单独调控肌动蛋白或微管方面的功能有了较为深入的了解。然而，较少研究采用两种聚合物的动态形式来检测肌动蛋白与微管之间的协同作用。这可能掩盖了肌动蛋白与微管之间潜在的连接机制。本文基于全内反射荧光（TIRF）显微镜技术 体外 重构技术可实现从同一生化反应中同时观察肌动蛋白和微管的动力学行为。该技术能够分别或在另一种聚合物共存条件下，保持肌动蛋白丝或微管的聚合动力学特性。本方法使用 commercially available Tau 蛋白，以展示在经典细胞骨架交联蛋白存在下，肌动蛋白与微管相互作用行为的变化。该技术可在单根纤维或高阶复合物水平上，为调控蛋白如何协调肌动蛋白与微管动力学提供可靠的功能性与机制性见解。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

传统上，肌动蛋白和微管被视为相互独立的实体，各自拥有一套调控蛋白、动态行为以及特定的细胞定位。如今大量证据表明，肌动蛋白与微管聚合物之间存在功能性的相互作用机制，这些机制对于多种细胞过程的执行至关重要，包括细胞迁移、有丝分裂纺锤体的定位、细胞内运输以及细胞形态的维持1,2,3,4。上述现象所依赖的多种协调行为，受制于一系列复杂的偶联因子、信号通路和物理特性的平衡。然而，这些机制背后的分子细节在很大程度上仍不清楚，因为大多数研究一次仅关注一种细胞骨架聚合物1,2,5。

肌动蛋白和微管不直接相互作用6,7,8。细胞中观察到的肌动蛋白与微管的协调动态由其他因子介导。许多被认为可调节肌动蛋白-微管串扰的蛋白质已被鉴定，并且这些蛋白质各自对单一细胞骨架聚合物的作用已得到充分表征1,2。越来越多的证据表明，仅关注单一聚合物的研究方法掩盖了一些能够介导肌动蛋白-微管偶联事件的蛋白质/复合物的双重功能7,8,9,10,11,12,13。同时包含两种聚合物的实验较为罕见，且通常仅以一种动态聚合物与另一种静态稳定形式来定义其作用机制6,8,9,10,11,14,15,16,17,18。因此，亟需建立能够在同时包含两种动态聚合物的实验体系中，研究肌动蛋白-微管协调蛋白所展现出的新兴特性的方法。

直接蛋白质标记方法、基因编码的亲和标签与全内反射荧光（TIRF）显微镜技术的结合，已在仿生重建系统中得到成功应用19,20,21,22,23许多自下而上的研究方案并未包含调控细胞内蛋白质的所有因子。然而 "盖玻片上的生物化学反应" 技术已在高空间和时间尺度上阐明了肌动蛋白和微管动态的多种机制，包括聚合或解聚所需的组分以及运动蛋白的移动。5,12,23,24,25,26,27一种用于研究肌动蛋白-微管偶联的最小组分单丝方法 体外 本文描述了一种可用于市售或高纯度纯化蛋白、荧光标记蛋白、灌流腔室的实验方案，并可扩展至包含细胞提取物或合成系统的更复杂体系。此处以市售Tau蛋白为例，演示在存在微丝-微管偶联蛋白的情况下细胞骨架动态的变化，但该蛋白可替换为其他潜在的微丝-微管协调因子。该系统相较于其他方法的主要优势在于能够在同一反应中同时监测多种细胞骨架多聚体的动态变化。本方案还为使用者提供了量化细胞骨架多聚体变化的示例和简易工具。因此，使用者可通过本方案获得可靠、定量、单纤维分辨率的数据，用于阐释多种调控蛋白协调微丝-微管动态的分子机制。

方案

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1. 清洗盖玻片

注意：按照 Smith 等人，201328 的方法清洗（24 mm × 60 mm，#1.5）盖玻片。

  1. 将盖玻片按顺序排列在塑料载片邮寄盒中。
  2. 依次将盖玻片浸入以下溶液中，并分别超声处理30–60分钟，每种溶液之间用ddH2O冲洗10次：含一滴洗洁精的ddH2O；0.1 M KOH。将盖玻片保存在100%乙醇中，可保存长达6个月。
    注意：切勿用手套以外的手指接触玻璃表面，应使用镊子操作。

2. 使用mPEG和生物素-PEG-硅烷对已清洗的（24 mm × 60 mm，#1.5）盖玻片进行包被

注意：本方案专门使用生物素-链霉亲和素系统将肌动蛋白和微管定位在TIRF成像平面内。也可使用其他包被方法和系统（例如抗体、聚-L-赖氨酸等）。L-赖氨酸，NEM肌球蛋白等。

  1. 解冻 PEG-硅烷和生物素-PEG-硅烷粉末的分装样品。
  2. 在使用前，将 PEG 粉末溶解于 80% 乙醇（pH 2.0）中，配制成 10 mg/mL 的 mPEG-硅烷和 2–4 mg/mL 的生物素-PEG-硅烷涂层储备液。
    注意：PEG 粉末外观上可能已溶解，但在微观层面可能尚未完全溶解。充分重悬需持续吹打约 1–2 分钟。建议在粉末看似溶解后，再额外吹打 10 次。
    注意：配制 80% 乙醇（pH 2.0）时会使用浓盐酸，操作时请佩戴手套以保护皮肤。
  3. 用镊子从乙醇储存液中取出洁净的（24 mm × 60 mm，#1.5）盖玻片，用氮气吹干，并存放于洁净的培养皿中。
  4. 用 100 µL 涂层溶液对盖玻片进行包被：该溶液为 80% 乙醇（pH 2.0）中含 2 mg/mL mPEG-硅烷（分子量 2,000）和 0.04 mg/mL 生物素-PEG-硅烷（分子量 3,400）的混合液。
    注意：如需稀疏包被（推荐），使用 2 mg/mL mPEG-硅烷和 0.04 mg/mL 生物素-PEG-硅烷；如需密集包被，则使用 2 mg/mL mPEG-硅烷和 4 mg/mL 生物素-PEG-硅烷。
  5. 将盖玻片在 70 °C 下孵育至少 18 小时，或孵育至使用前。
    注意：若包被后的盖玻片在 70 °C 下储存超过 2 周，其性能会下降。

3. 组装成像流室

  1. 将双面背胶胶带裁剪成12条，每条长度为24 mm。撕去胶带一侧的背衬，将胶带条紧邻固定在洁净成像腔室的六个凹槽旁。
    注意：胶带必须平整，以确保正确组装，否则成像腔室会发生泄漏。应小心撕去胶带背衬，避免产生凸起。建议将贴好胶带的腔室在洁净表面上轻轻滑动，以使胶带与腔室接触更平整。
  2. 撕去胶带第二层背衬，暴露每个成像腔室凹槽处胶带的粘性面。将腔室带有胶带的一面朝上放置于洁净表面上。
  3. 按照1:1比例（或根据制造商说明）在小型称量皿中混合环氧树脂与固化剂溶液。
  4. 使用P1000移液器吸头，在每个成像腔室凹槽末端的胶带条之间滴加一滴混合好的环氧树脂（红色箭头；图1A）。将带有胶带和环氧树脂的腔室面朝上放置于洁净表面上。
  5. 从70 °C培养箱中取出一张已包被的盖玻片。用ddH2O反复冲洗盖玻片的包被面和未包被面六次，用过滤氮气吹干，然后将盖玻片包被面朝向胶带，贴附到成像腔室上。
  6. 使用P200或P1000移液器吸头对胶带与玻璃的界面施加压力，以确保胶带与盖玻片之间形成良好密封。
    注意：密封良好时，双面胶带会变为半透明。若胶带与腔室接触不充分，则会导致腔室泄漏。
  7. 将组装好的腔室在室温下孵育至少5–10分钟，使环氧树脂充分固化，确保腔室小室密封后再使用。灌流腔室在组装后12–18小时内失效。
    注意：根据胶带的位置以及所用双面胶带的厚度，组装后的腔室最终体积为20–50 µL。

4. 灌注室的预处理

  1. 使用灌注泵（流速设定为 500 µL/min）按以下顺序在灌注腔室中依次更换预孵育溶液：
    1. 注入 50 µL 的 1% BSA 以预润成像腔室。从鲁尔锁接头储液池中移除多余的缓冲液。
    2. 注入 50 µL 的 0.005 mg/mL 链霉亲和素。室温孵育 1–2 分钟。从储液池中移除多余的缓冲液。
    3. 注入 50 µL 的 1% BSA 以封闭非特异性结合位点。孵育 10–30 秒。从储液池中移除多余的缓冲液。
    4. 注入 50 µL 温热（37 °C）的 1× TIRF 缓冲液（1× BRB80、50 mM KCl、10 mM DTT、40 mM 葡萄糖、0.25% (v/v) 甲基纤维素（4,000 cp））。
      注意：不要从储液池中移除多余的缓冲液。这可以防止腔室干燥，从而避免向系统中引入气泡。
    5. 可选：注入 50 µL 稳定化的29、50% 生物素化微管种子，用 1× TIRF 缓冲液稀释。
      注意：合适的稀释度需通过实验确定，且存在批次间差异。建议参考文献27,29 中的方案作为起始点。在此系统中，每视野出现 10–30 个种子的稀释度效果良好。

5. 显微镜准备

注意：使用配备120-150 mW固态激光器、温度校正的63倍油浸TIRF物镜和EMCCD相机的倒置全内反射荧光（TIRF）显微镜来观察或进行含有动态肌动蛋白丝和微管的生化反应。本示例中蛋白质在以下波长下进行观察：488 nm（微管）和647 nm（肌动蛋白）。

  1. 在成像第一个生化反应前至少30分钟，将载物台/样品加热装置设定为维持35–37 °C。
  2. 设置图像采集参数如下：
    1. 采集间隔设为每5秒一次，持续15–20分钟。
    2. 将488 nm和647 nm激光的曝光时间设为50–100 ms，功率设为5%–10%。为显微镜设置合适的全内反射（TIRF）角度。
      注意：无论显微镜配置如何，设置激光功率、曝光时间和TIRF角度的最简单方法是在仅含一种聚合物的样品图像上进行调整（见下文5.2.2.1和5.2.2.2）。强烈建议使用者采用仍能实现检测的最低激光功率和最短曝光时间。
      1. 调整聚合反应（图1C），以启动肌动蛋白丝组装，并在647 nm波长下采集图像，进行相应调整。
      2. 在第二个预处理的灌流腔室中调整聚合反应，以启动微管组装（图1C），并在488 nm波长下观察，进行相应调整。

6. 蛋白质反应混合液的制备

  1. 制备荧光标记微管蛋白的储备液。
    1. 测定自制未标记微管蛋白的浓度 通过 分光光度法在吸收波长下的测定280，如下所示：
      1. 使用不含GTP的1xBRB80缓冲液作为空白对照进行分光光度测定。
      2. 使用测定的消光系数 115,000 M⁻¹cm⁻¹ 计算微管蛋白的浓度-1 厘米-1 以及以下公式：
        Tubulin concentration calculation formula with absorption coefficient, scientific analysis method.
    2. 将市售的冻干赖氨酸标记488-微管蛋白用20 µL不含GTP的1x BRB80缓冲液重悬至10 µM（1 mg/mL；100%标记）。
    3. 解冻一份7.2 µL的100 µM未标记回收微管蛋白29 置于冰上。
      注意：回收的微管蛋白对微管成功组装至关重要 体外 因为它能去除在冷冻蛋白储备液中形成的无法进行聚合的二聚体29,30.
    4. 将3 µL的10 µM 488标记微管蛋白与7.2 µL的100 µM未标记微管蛋白混合，使用前不超过15分钟。
  2. 制备荧光标记肌动蛋白的储备液。
    1. 对于自制蛋白质，测定肌动蛋白的浓度和标记百分比 通过 分光光度法 吸光度290 和吸收度650，如下所示：
      1. 用G缓冲液调零分光光度计。
      2. 使用测定的消光系数 25,974 M⁻¹cm⁻¹ 计算未标记肌动蛋白的浓度-1 cm-1 以及以下公式：
        Actin concentration formula, [actin] in µM, based on absorbance at 290 nm; equation diagram.
      3. 使用未标记肌动蛋白的消光系数、0.03 的荧光校正因子以及以下公式，计算赖氨酸标记 Alexa-647-肌动蛋白的浓度：
        [Alexa-647 标记的肌动蛋白]，µM = (Abs290 - Fluorescence quantification equation; diagram of fluorescence correction for actin absorption analysis.
      4. 使用已确定的 Alexa-647 消光系数（ε = 239,000 M⁻¹cm⁻¹）计算 Alexa-647-肌动蛋白的标记百分比-1 厘米-1，如下所示：
        Alexa-647-肌动蛋白的标记率 = (Abs290 - (Protein concentration formula, including absorbance and labeled actin.
    2. 解冻一份2 µL的3 µM完全标记生物素化肌动蛋白（在赖氨酸残基上标记）。加入18 µL G缓冲液，稀释10倍。
    3. 将3 µL稀释的生物素化肌动蛋白与适量的未标记及标记肌动蛋白（见上文）混合，使最终混合物中肌动蛋白总浓度为12.5 µM，荧光标记比例为10%–30%。
      注意：荧光标记的肌动蛋白单体比例超过30%（终浓度）可能影响成像分辨率，因为此时难以将纤维与背景信号区分开。
  3. 配制反应混合液（图1C).
    1. 在成像前不超过15分钟，将2 µL的12.5 µM肌动蛋白混合液储备液（6.2.3）与微管蛋白储备液混合液（6.1.4）混合，配制细胞骨架混合液（A管）。使用前置于冰上保存。
    2. 通过混合所有其他实验组分和蛋白质来制备蛋白质反应混合液（B管），包括：2× TIRF缓冲液、抗漂白剂、核苷酸、缓冲液以及辅助蛋白。示例如下所示 图1C.
      注意：最终稀释得到的TIRF缓冲液为1x浓度，其中含有ATP、GTP，离子强度处于估计的生理范围内。
  4. 将A管和B管分别在37 °C孵育30-60秒。为启动反应，混合并将B管中的内容物加入A管中（如下）。

7. 观察肌动蛋白和微管动态

  1. 灌注培养皿预处理图1B；步骤4，见上文）。
  2. 通过将B管（反应混合液）中的内容物加入A管（细胞骨架混合液）中，同时启动微丝和微管的组装图1C).
  3. 加入50 µL反应液，其中含有1x TIRF缓冲液，并补充15 µM游离微管蛋白、1 mM GTP、0.5 µM肌动蛋白单体，以及适量的缓冲液对照。
  4. 使用显微镜软件记录延时电影，每5秒采集一次，持续15-20分钟。
    注意：肌动蛋白和微管动力学的启动发生在2-5分钟内（图2延迟时间较长表明反应混合物中存在温度控制问题或蛋白质浓度相关的问题。
  5. 预灌注新的灌注小室（步骤4），并用目标调节蛋白（如Tau）及缓冲液对照替换缓冲液体积图1C）。按照上述第7步所述进行采集，以评估调控蛋白在新生的肌动蛋白-微管功能中的作用。

8. 使用 FIJI 软件处理和分析图像31

  1. 打开保存的TIRF视频，以复合图像形式查看。
  2. 分析微管动力学（图3A），步骤如下：
    1. 从图像堆栈菜单生成基于时间的最大Z投影。
    2. 通过 分析> 工具> 同步窗口 菜单，将Z投影窗口与原始TIRF视频同步。
    3. 在时间投影图像上，使用直线工具沿感兴趣微管绘制一条线。
      1. 从分析菜单中打开感兴趣区域（ROI）管理器（分析> 工具> ROI管理器）。
      2. 按下“t”键保存单个微管位置。对所有感兴趣的微管重复此操作。
    4. 使用“/”键绘制所选线条的线扫图（kymograph），或运行多线扫图宏，该宏为ROI管理器中的每个微管生成视频和线扫图31。
      1. 从 分析> 工具> 标尺 菜单，为线扫图添加长度（µm）和时间（min）标尺。
    5. 根据线扫图的斜率测量微管生长速度（图3A，1-2；黑色线条的斜率）。
    6. 从生成的线扫图或使用可用的分析宏5,8,18,25统计动态微管事件（ catastrophe 或再生长）。图3A，1-2中的红色虚线代表 catastrophe/快速解聚事件。
  3. 分析肌动蛋白动力学（图3B），步骤如下：
    1. 测量肌动蛋白成核，步骤如下：
      1. 在反应启动后100秒，计数视野中肌动蛋白丝的数量，并按面积归一化表示（每µm2的丝数）。
      2. 在ROI管理器中记录并保存数据，方法同上文步骤8.2.3.1。
    2. 测量肌动蛋白丝的延伸速率（图3B），步骤如下：
      1. 使用折线工具沿感兴趣的肌动蛋白丝绘制一条线。
      2. 将该线添加至ROI管理器，方法同上文步骤8.2.3.1。
      3. 沿该线追踪（每次测量均添加至ROI管理器），至少持续四个视频帧。
        注：建议测量连续七到八个帧，但在某些条件下，肌动蛋白聚合速度低于物镜/显微镜系统可分辨的检测限。此时，可在非连续帧上以固定间隔进行测量（例如，每隔五帧测量一次）。
      4. 将测得的长度值对经过时间作图。所得直线的斜率即为肌动蛋白延伸速率（单位：微米/秒）。
      5. 使用校正因子370（表示每微米肌动蛋白丝所含单体数目）32，将最终计算的速率转换为亚基 s-1 µM-1。
  4. 对肌动蛋白-微管平行共定位区域进行关联分析（图3C），步骤如下：
    1. 在特定时间点（例如反应启动后300秒），使用直线工具沿感兴趣的微管绘制一条线。
      1. 将该线添加至ROI管理器，方法同上文步骤8.2.3.1。
    2. 在每个通道中绘制该线上荧光强度的分布。
      1. 使用图像滑块选择每个通道，并通过“command k”键绘制该线上的强度分布。
      2. 点击输出窗口中的“list”按钮保存或导出数值。
    3. 以单个事件中肌动蛋白与微管重叠的比例，或在固定时间点特定视野中事件的计数，表示肌动蛋白-微管偶联事件（图3C）。
    4. 替代方法：使用软件计算两个通道之间的重叠百分比5,12。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在上述条件下（图1），在图像采集后2分钟内应可观察到肌动蛋白和微管聚合物（且具有动态性）（图2）。与任何基于生物化学的实验方案一样，针对不同的调控蛋白或不同批次的蛋白，可能需要进行优化。因此，应首先使用仅含单一聚合物的反应体系来设定TIRF显微镜的激光入射角度和图像曝光参数。这一步骤可确认储存的蛋白仍具功能活性，并且标记蛋白的浓度足以被检测。尽管并非总是必要（本文中未进行），但可通过影像后处理（如背景扣除、图像平均化或傅里叶变换）来增强图像对比度（尤其是微管）5,25,33。本实验方法可直接可视化单根肌动蛋白丝和微管，从而支持对任一细胞骨架组分单独或联合作用时的多种动态参数进行定量分析，包括聚合参数（如成核速率或延伸速率）、解聚参数（如回缩速率或灾变事件）以及聚合物的共排列/重叠情况（图3）。此外，这些参数还可作为研究调控性配体（如Tau蛋白）结合行为或功能影响的起点（图3）。一段TIRF显微影像可获取大量关于单根肌动蛋白丝或微管的测量数据。然而，由于盖玻片包被、移液操作及其他因素可能存在变异，可靠的测量结果应包含多个技术重复的反应或影像。

通过示例走时图可以确定微管动态的多个方面，包括微管延伸速率以及 catastrophe 和 rescue 事件的发生频率（图3A）。在此系统中，使用走时图测量肌动蛋白动态则较为复杂，因为肌动蛋白丝比微管结构更不规则。因此，肌动蛋白丝动态参数需手动测量，这一过程耗时且劳动强度大。成核计数是指在所有实验条件下统一时间点存在的肌动蛋白丝数量。这些计数在不同TIRF成像视野间差异较大，但可通过大量重复实验或与其他聚合实验的观察结果相互补充来提高可靠性。若实验条件中缺乏稳定的微管种子，也可对微管进行成核计数。肌动蛋白丝的延伸速率通过至少四个电影帧中丝长度随时间的变化来测定。速率值以每微摩尔肌动蛋白表示，并采用370个亚基的校正因子，以反映每微米肌动蛋白丝中所含的肌动蛋白单体数量（图3B）32。目前对于定义肌动蛋白与微管之间协调行为的测量方法尚不完善。然而，已有研究应用相关性分析方法来评估两种多聚体的共定位情况，包括线扫描分析（图3C）或重叠分析软件5,11,34。

数据可用性：
本研究相关的所有数据集均已存入 Zenodo，可通过合理申请获取，网址为：10.5281/zenodo.6368327。

全内反射荧光显微镜装置示意图；微管-肌动蛋白混合物制备；成像室组装步骤。
图1．实验流程示意图：从成像室组装到图像采集。（A）成像室组装。从上到下：将IBIDI成像室沿灌注孔道用胶带固定（箭头所示）；第二层（白色）胶带衬底（图中保留以帮助用户更好定位）被移除，并在灌注室边缘（箭头处）涂抹环氧树脂。注意：为便于用户明确环氧树脂的涂抹位置，本图中保留了白色衬底。将清洗并包被好的盖玻片粘附至成像室，包被面朝向灌注孔道内侧。（B）流程图，展示用于生物素-链霉亲和素连接的成像室预处理步骤。（C）用于获取动态微管和肌动蛋白丝TIRF录像的反应示例。请点击此处查看该图的放大版本。

有无Tau蛋白时微管蛋白-肌动蛋白动态的延时显微镜图像，显示纤维的生长。
图2．在无或有Tau蛋白存在下生长的肌动蛋白丝和微管的图像序列。 来自TIRF实验的时间延时图像拼接图，其中含有0.5 µM肌动蛋白（10% Alexa-647标记肌动蛋白和0.09%生物素标记肌动蛋白）和15 µM游离微管蛋白（4% HiLyte-488标记），在无（A）或有（B）250 nM Tau蛋白的条件下进行。图中显示自反应开始（混合A管与B管）后经过的时间。比例尺：25 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

微管-肌动蛋白丝相互作用分析；走时图；显微镜图像；荧光图。
图3．微管与肌动蛋白丝动态的示例测量结果。（A）微管蛋白通道的平均时间投影可有效显示用于生成走时图的线扫描范围内的总微管长度。黑色虚线对应于右侧所示两条动态微管的走时图示例。每张走时图中均标示出微管的生长阶段（实心黑线）和解聚阶段（虚线粉线；两条以粉红色箭头标出）。时间比例尺：3 分钟。长度比例尺：10 µm。反应体系包含 0.5 µM 肌动蛋白（10% 647 标记）和 15 µM 游离微管蛋白（4% 488-HiLyte 标记）。仅显示微管蛋白通道。（B）两个示例性延时成像拼接图，展示单根肌动蛋白丝的活跃聚合过程。肌动蛋白丝的延伸速率通过其长度随时间变化曲线的斜率计算，单位为每微摩尔肌动蛋白的延伸速率。因此，在将 0.5 µM 肌动蛋白反应的速率与通常在 1 µM 肌动蛋白浓度下测定的速率进行比较时，必须应用两倍的校正因子。右侧展示了来自五根肌动蛋白丝的示例。比例尺：10 µm。反应体系包含 0.5 µM 肌动蛋白（10% 647 标记）和 15 µM 游离微管蛋白（4% 488-HiLyte 标记）。仅显示肌动蛋白通道。（C）全内反射荧光（TIRF）图像，显示在无（左）或有 250 nM Tau 蛋白（中）条件下动态微管（MT，绿色）和肌动蛋白丝（紫色）的聚合情况。蓝色虚线和箭头标示了每种条件下用于生成线扫描图的划线位置（位于各图像下方）。可在设定时间点按区域对微管与肌动蛋白区域的重叠部分（以黑色显示）进行评分（右）。比例尺：25 µm。反应体系包含 0.5 µM 肌动蛋白（10% 647 标记）和 15 µM 游离微管蛋白（4% 488-HiLyte 标记），部分反应体系中添加 250 nM Tau 蛋白。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

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利用全内反射荧光（TIRF）显微镜观察纯化的蛋白质，已成为解析细胞骨架调控独特机制的一种富有成效且极具说服力的方法5,23,24,25,26,27,35。与传统的生化实验相比，TIRF 反应所需体积极小（50–100 µL），且可从单个实验中获得关于细胞骨架动态的定量数据。目前大多数关于细胞骨架动态的研究集中于单一聚合物系统（即肌动蛋白丝或微管），因此，在细胞中常见的肌动蛋白丝与微管之间的相互作用或涌现行为，其详细测量在体外实验中仍难以实现且极具挑战性。为解决这一问题，本实验方案描述了一种单丝 TIRF 显微镜系统，可在同一生化反应中直接可视化动态的肌动蛋白和微管聚合物。因此，该方法超越了仅重现肌动蛋白丝或微管单独动态行为的传统实验。本研究还以 Tau 蛋白为例，展示了细胞骨架偶联因子存在时多种动态特性的变化。该实验方案也可用于其他已知或疑似协调肌动蛋白或微管动态的蛋白质，包括但不限于 MACF、GAS、formins 等。最后，所提供的示例分析可作为指南，用于量化本方案所获得的数据。

"眼见为实"是进行基于显微镜检测的一个有力理由。然而，在执行和解释全内反射荧光（TIRF）显微镜实验时需格外谨慎。细胞骨架共组装检测的主要挑战之一在于，许多常用的成像条件并不适用于每种聚合物。微管和肌动蛋白在聚合时通常对缓冲液、温度、盐浓度、核苷酸及浓度等条件有不同的要求。本方案中所使用的肌动蛋白、微管蛋白、目标调控蛋白以及缓冲液均对冻融循环敏感。因此，为成功实施本方案，必须谨慎处理蛋白质和缓冲液。为减轻上述诸多问题，强烈建议使用新鲜回收的微管蛋白（冷冻时间少于<6周），并通过超速离心对冻存后重悬的肌动蛋白进行预清除。这些注意事项同样适用于本实验中需评估的多种调控蛋白，这些蛋白可能对冻融循环或缓冲液中盐浓度敏感5,11,36。

遗憾的是，目前并不存在一种适用于所有情况且无需进行实验权衡的通用缓冲液。为了在较低蛋白浓度下获得更适配的体积，可在2倍TIRF缓冲液中添加ATP和GTP（图1C）。然而，由于这些核苷酸对冻融循环极为敏感，因此不建议采用此方法。本实验中使用的氧清除化合物（即过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶）对于长时间（数分钟至数小时）观察蛋白质是必要的，但已知在高浓度下会抑制微管聚合5。与此类缓冲液选择相关的是，本实验方案的一个局限性在于，某些典型的微管相关调控蛋白可能需要更高或更低的盐浓度，才能重现其在细胞内或仅使用微管（不含肌动蛋白）的实验体系中的功能。改变盐的种类或浓度以满足这些需求，很可能会影响肌动蛋白丝的聚合速率和/或微管动态参数。为确认本方案的成功实施，或明确记录特定缓冲液或调控蛋白的影响，必须测量多个描述性参数（至少包括成核、延伸速率和稳定性）（图3）。例如，过度的肌动蛋白丝聚合可能在数秒内遮蔽肌动蛋白-微管偶联事件。因此，通过降低肌动蛋白总体浓度或添加其他抑制肌动蛋白成核的蛋白（如profilin）来精细调节实验条件，可延长清晰观察肌动蛋白与微管协同活动的时间窗口。针对上述前提条件设置对照实验，并进行技术重复（超出多个视野的重复观察），对于用户获得可靠且可重复的结果至关重要。

基于细胞的研究难以直接观察蛋白质-蛋白质相互作用或调控复合物的功能。相比之下，一些从此类研究中获得的机制 体外 检测结果并不总能反映蛋白质在细胞内的真实行为。这一经典生物化学难题可通过对此技术进行特定改进，在未来应用中加以解决。例如，加入功能性的荧光标记偶联蛋白，可将该方法从单一纤维研究扩展至单分子水平分子 研究。检测方法还可进一步修改，以使用可能添加的细胞提取物 "缺失" 重现类细胞现象所需的关键因素尚不明确。例如，利用酵母或非洲爪蟾提取物进行的基于全内反射荧光（TIRF）的实验已重建出收缩性肌动球蛋白环37有丝分裂纺锤体26,38肌动蛋白或微管组装的组分39,40以及中心体和动粒处的动态变化36,41,42,43此外，这类系统可能为含有脂质或信号因子的人工细胞系统铺平道路44,45,46.

披露

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不存在需要披露的利益冲突。

致谢

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感谢Marc Ridilla（Repair Biotechnologies）和Brian Haarer（SUNY Upstate）对本实验方案提出的有益建议。本研究工作由美国国立卫生研究院（GM133485）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% BSA（w/v）Fisher ScientificBP1600-100出于此目的（封闭TIRF腔室），将BSA溶于 ddH20 并通过 0.22 µm 滤膜
1× BRB80自制80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，用KOH调至pH 6.8
10 mg/mL（1000 U）葡萄糖氧化酶Sigma Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市G2133-50KU与过氧化氢酶联合分装，于 -80 保存 oC，直至使用
100 µM 微管蛋白Cytoskeleton公司，丹佛，科罗拉多州T240自制微管蛋白在使用前应进行循环处理，以去除无法聚合的微管蛋白（Hyman et al. (1992)）29；Li 和 Moore（2020）30）。市售微管蛋白通常浓度过低而无法回收利用，但若按照生产商说明重新悬浮，则可良好地发挥作用。’s 说明并经超速离心预清除（278,000） × g) 使用前，放置60分钟。
100 mM ATPGold Biotechnology Inc，密苏里州奥利维特A-081重悬于 ddH20（pH 7.5），过滤除菌。
100 mM GTPFisher ScientificAC226250010重悬于 1× BRB80（pH 6.8）并过滤除菌。
120-150 mW 固体激光器徕卡显微系统11889151; 11889148
2 mg/mL 过氧化氢酶Sigma Aldrich 公司，美国密苏里州圣路易斯市C40-100与葡萄糖氧化酶联合使用，分装后于 -80 保存 o直至使用前均置于 C 保存
2× TIRF缓冲液自制2× BRB80，100 mM KCl，20 mM DTT，80 mM 葡萄糖，0.5% (v/v) 甲基纤维素（4,000 cp）；注意：1 µ0.1 M GTP 溶液 L 和 1 µ分别向TIRF反应中加入0.1 M ATP溶液，以避免反复冻融循环。
24 × 60 毫米，#1.5 盖玻片Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆22-266882盖玻片在使用前必须彻底清洗（Smith et al. (2014)22)
37 oC 热块
37 oC 水浴
5 mg/mL 链霉亲和素（600倍浓缩液）Avantor，宾夕法尼亚州费城RLS000-01重悬于 Tris-HCl（pH 8.8）中；将等分试样稀释至 1× 在使用当天，置于HEK缓冲液中
5 分钟环氧树脂与固化剂Loctite，美国康涅狄格州罗基希尔1365736混合树脂与固化剂可能需要长达30分钟才能固化。
50% 生物素化-GpCpp 微管种子Cytoskeleton 公司；自制T333P（可选）GppCpp 或紫杉醇（Taxol）稳定的微管种子可更高效地介导微管聚合。紫杉醇与 GppCpp 以不同的方式稳定微管，这可能影响微管晶格结构以及某些调控蛋白与微管稳定区域结合的能力。Hyman 等（1992）概述了一种制备多种类型微管种子的方法。
70 oC 培养箱
肌动蛋白混合物储备液自制；本实验方案12.5 µM肌动蛋白混合物，包含标记（荧光和生物素化）与未标记的肌动蛋白，适用于最多六个反应。2 µL 储液用于最终的 TIRF 反应。每个反应中所用肌动蛋白的最终浓度为 0.5 µM（10% Alexa-647；0.09% 生物素标记）
适当的缓冲液对照自制所有待评估蛋白质缓冲液的混合
生物素-PEG-硅烷（分子量 3,400）莱桑生物公司生物素-PEG-SIL-3400分装为2-5 mg等份，充氮气保护，用Parafilm封口，于-20℃保存 o置于干燥剂中，4°C 保存备用
生物素标记的肌动蛋白Cytoskeleton 公司；自制AB07生物素-肌动蛋白通过标记赖氨酸残基制备，因此假定其标记率至少为100%，但不同批次或制备之间可能存在差异。  最佳的生物素标记肌动蛋白浓度需根据特定用途或实验设计通过实验经验确定。较高浓度可实现更高效的追踪，但可能抑制聚合或与调控蛋白的相互作用。本实验中，最终TIRF反应体系含有少量生物素标记肌动蛋白（0.09% 或 900 pM）。
洗洁精Dawn，宝洁公司，俄亥俄州辛辛那提出于未知原因，蓝色版本清洗盖玻片的效率高于其他可用颜色的版本。
干冰
FIJI 软件www.https://imagej.net/software/fiji/downloads施耐德等人（2012）31.
荧光标记的肌动蛋白Cytoskeleton公司；自制AR05自制的荧光标记肌动蛋白保存于添加了50%甘油的G缓冲液中，置于-20℃储存 oC（Spudich 等（1971））47；刘等人（2022）48）。荧光标记的肌动蛋白在G缓冲液中透析，并通过超速离心在278,000 × g下离心60分钟进行预清除 × 使用前称量 g。
荧光标记的微管蛋白Cytoskeleton公司TL488M，TLA590M，TL670M重悬于20 µL 1× BRB80（10 µM 终浓度）并通过超速离心预清除（278,000 × g) 使用前，放置 60 分钟。
G缓冲液自制3 mM Tris-HCl (pH 8.0)，0.2 mM CaCl2，0.5 mM DTT，0.2 mM ATP
HEK缓冲液自制的20 mM HEPES（pH 7.5），1 mM EDTA（pH 8.0），50 mM KCl
冰
冰桶
成像室IBIDI，威斯康星州菲奇堡80666订购无底培养室以使用不同的盖玻片涂层
iXon Life 897 EMCCD 相机Andor，北爱尔兰贝尔法斯特8114137
LASX Premium 显微镜软件Leica Microsystems11640611
甲基纤维素（4,000 cp）Sigma Aldrich 公司M0512
配备TIRF模块的显微镜基座德国韦茨拉尔，徕卡显微系统公司11889146
mPEG-硅烷（分子量 2,000）Laysan Bio 公司，阿拉巴马州阿拉伯市mPEG-SIL-2000分装为10–15 mg等份，充入氮气，用Parafilm封口膜密封，于-20 °C保存 o置于干燥剂中，4°C 保存备用
物镜加热器与加热载物台插件OKO labs，波佐利，意大利8113569将温度控制设置为35-37 oC. 使用制造商建议进行准确校准。
灌注泵哈佛仪器公司，霍利斯顿，马萨诸塞州704504可使用注射器和管路进行替代。
培养皿，100 × 15 mmGenesee Scientific，加利福尼亚州圣地亚哥32-107
塑料幻灯片邮寄容器Fisher ScientificHS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm 厚Grace Biolabs，俄勒冈州本德620001强烈建议使用精确制造尺寸的双面胶带。
小型泡沫塑料容器Abcam，英国剑桥重复使用发货材料
小型称量舟Fisher Scientific02-202-100
分光光度计
TauCytoskeleton 公司TA01商业可得的Tau蛋白制备物中含有三种Tau亚型。本方案中的浓度由分子量最高的条带（14.3）确定 µM，按照制造商说明重新悬浮后’50 的建议 µL of ddH20).
温度校正 63× Plan Apo 1.47 数值孔径油浸 TIRF 物镜徕卡显微系统11506319
微管蛋白储备液自制；本方案由7.2组成的微管蛋白储备液 µL 回收 100 µM 未标记的微管蛋白和 3 µ10 升 µM 重悬市售荧光标记的微管蛋白。每个反应使用一份微管蛋白储存液，解冻后置于冰上保存。每个反应中游离微管蛋白的终浓度为 15 µM（4% 标记）。超过 15 µM微管蛋白将导致微管过度稳定（无动态性），而浓度低于7.5 µ游离微管蛋白不易有效聚合，需精确测定蛋白浓度并谨慎操作。
未标记的肌动蛋白（深色）Cytoskeleton 公司；自制AKL99肌动蛋白成核点几乎总是存在于市售（冻干）或冷冻保存的肌动蛋白中，这会导致定量测量结果的变异性（Spudich 等，1971）47；刘等人（2022）48）。兔肌动蛋白在G缓冲液中保存于-80 oC，并通过在278,000 × g下超速离心60分钟进行预清除 × 使用前称量 g。 一天中需配制多份肌动蛋白储备液（每次配制不超过六个反应所需的量） 强烈建议）。

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