表达IL-9的T细胞和ILC2细胞在……期间被诱导产生 N. brasiliensis 感染，但由于其频率较低且动力学特征不同，这些细胞在受感染肠道中的表征在很大程度上被忽视。本方案描述了从不同靶器官中分离这些细胞并鉴定其身份的方法。 通过 不同感染阶段的流式细胞术
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方法文章
一种研究Nippostrongylus brasiliensis感染模型中产生IL-9的淋巴细胞的策略
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
IL-9 是一种具有多效性的细胞因子，与多种生理和病理过程相关，包括抗肿瘤免疫、过敏性疾病的诱导以及抗寄生虫感染的免疫应答，其中在清除线虫寄生虫过程中发挥重要作用。在小鼠巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis）感染模型中，IL-9 主要由肺、小肠及引流淋巴结中的 CD4+ T 淋巴细胞和固有淋巴样细胞产生。由于 IL-9 胞内染色技术操作困难，且感染后从小肠分离造血细胞过程复杂，因此迫切需要一种全面而简便的实验方案，用于分析该模型中不同淋巴组织和非淋巴组织内 IL-9 的表达情况。本文所述方案系统描述了在 N. brasiliensis 感染过程中，肺和小肠（主要靶器官）以及纵隔淋巴结和肠系膜淋巴结中 CD4+ T 细胞与固有淋巴样细胞产生 IL-9 的动力学特征。此外，方案还详细说明了根据目标细胞类型和器官确定所需的感染幼虫数量。本方案旨在通过帮助研究者聚焦于 N. brasiliensis 感染模型中特定的细胞类型、器官和疾病阶段，促进实验的标准化，从而节省时间和资源。
引言
钩虫是肠道寄生虫，全球约有7亿人感染，主要集中在发展中国家的热带地区。高强度感染可导致 十二指肠钩口线虫 和 美洲钩虫，人类中最常见的钩虫寄生虫，可引起贫血和蛋白质缺乏，导致生长迟缓和智力发育障碍1. N. americanus 以及啮齿类动物寄生虫 Nippostrongylus brasiliensis 在宿主中诱导典型的2型免疫反应，并在生命周期方面具有相似性。因此，小鼠感染 N. brasiliensis 是人类钩虫感染最常用的模型。三期幼虫（L3） N. brasiliensis 感染性幼虫在感染后的最初几小时内从皮肤移行至肺部。到达肺部后，幼虫发育为L4阶段，随后沿气管向上迁移并被吞咽，经胃部进入肠道，并在4至5天内发育为成虫（L5）。在肠道内，L5期蠕虫产卵，虫卵随粪便排出体外，从而重新启动寄生虫的生活周期。2.
N. brasiliensis 诱导的免疫反应特征是多种2型细胞因子水平升高，包括IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13，同时伴有嗜酸性粒细胞增多、嗜碱性粒细胞增多、杯状细胞和肥大细胞增生，以及IgG1和IgE产生增加。大多数旨在鉴定和界定N. brasiliensis感染所引发免疫反应的研究，主要集中....
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方案
本文所述所有动物实验均经墨西哥国立自治大学细胞生理研究所动物实验管理内部委员会（CICUAL）批准。
注意：整个实验方案的流程图见图1。
1. 小鼠的饲养
- 使用8至10周龄的雌性或雄性小鼠群体，饲养于温度和湿度恒定的动物设施中，采用12小时光照/12小时黑暗循环， 随意摄取 饮水和食物的获取。
注意：本实验方案使用了如前所述的C57BL/6背景的IL-9报告小鼠品系4；然而，也可使用其他IL-9报告基因小鼠品系6,7,8, 以及细胞内IL-9染色，结果存在差异9.
2. 小鼠感染
- 在感染前1天，将小鼠背部从身体中部至尾根部附近的毛发剃除。无需使用麻醉剂。
- 按照先前所述方法2
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结果
小鼠皮下注射200条L3期N. brasiliensis幼虫，对照组则注射PBS作为假感染对照。本方案中使用的幼虫数量经过调整，以便从小鼠肺组织、淋巴组织及小肠中分离出有活性的细胞，这与以往研究不同——以往通常使用更高剂量的寄生虫，仅用于在淋巴组织和肺中检测细胞4。在感染后第0、4、7和10天分别采集肺组织、纵隔淋巴结、肠系膜淋巴结以及小肠组织，用于淋巴细胞的分离，并鉴定产IL-9的细胞群体。本研究共使用27只小鼠，进行了两次或以上的独立实验，包括9只对照小鼠，以及每个时间点4至6只N. brasiliensis感染小鼠。每次实验均包含假感染对照组，以获取基础细胞数量。采用本方案，可从小鼠肺组织、肠系膜淋巴结和纵隔淋巴结中分离出产IL-9的CD4+ T细胞（在此模型中主要为Th9细胞），用于定量分析及后续研究。
根据感染的自然进程，我们首先评估了肺和纵隔淋巴结中产生IL-9的CD4+ T淋巴细胞（Th9）的频率（设门策略见图2A和
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讨论
要全面理解肠道寄生虫与宿主之间的相互作用以及宿主对蠕虫感染的免疫应答，必须鉴定并分析在组织重塑和蠕虫排出过程中起关键作用的不同细胞群体及效应分子。土源性蠕虫感染在全球发展中国家仍是一个重大公共卫生问题。然而，直到最近，尚无一种可用于分析小肠中稀有细胞群体的实验方案——小肠是此类感染的主要受累器官5。本方案涵盖了先前已描述的方法，可用于在巴西日圆线虫（N. brasiliensis）感染期间，对肺组织、纵隔淋巴结和肠系膜淋巴结中表达IL-9的淋巴样细胞进行流式细胞术分析，并进一步首次实现了对该细胞群体在小肠中的鉴定。
该实验方案的成功高度依赖于组织处理时间。建议每人每次最多处理六个小肠样本。若需同时处理不同器官，建议由另一人并行操作。通过使用相对较低的寄生虫负荷（200条L3幼虫），本方案可在维持从其他器官分离淋巴样细胞能力的同时，实现从N. brasiliensis感染的小肠中分离淋巴样细胞。使用较高的寄生虫负荷会损害从小肠中分离细胞的质量和数量（数据未显示）；然而，这可能导致其他器官中表达IL-9.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢 José Luis Ramos-Balderas 提供的技术支持。本研究工作获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）向 PLL 提供的以下资助项目（FORDECYT-PRONACE-303027）的支持。OM-P 和 EO-M 分别获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）的博士后奖学金资助（编号分别为 736162 和 481437）。MCM-M 获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）“墨西哥博士后研修计划”（Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)）的奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ACK 缓冲液 | 自制 | ||
| Attune Nxt 流式细胞仪 | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| 胶原酶 D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 比活性：≥10 000 单位/mg |
| Facs ARIA II 分选仪 | BD Biosciences | ||
| FACS Melody 细胞分选仪 | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | 流式细胞术分析数据软件 | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| 汉克斯平衡盐溶液 (HBSS) | 自制 | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| 尼龙筛网 | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep 密度梯度介质 | Sigma | D1556 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 自制 | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| 链霉亲和素 | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine 缓冲液 | 自制 | ||
| Zombie Aqua 可固定活力染料 | Biolegend | 423101 |
参考文献
- Centers for Disease Control and Prevention. Parasites - Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , Chapter 19 (Unit 19.12) (2003).
- Mearns, H., et al.
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重印与许可
