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方法文章

一种研究Nippostrongylus brasiliensis感染模型中产生IL-9的淋巴细胞的策略

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⸱

DOI：

10.3791/64075

⸱

2023年3月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

表达IL-9的T细胞和ILC2细胞在……期间被诱导产生 N. brasiliensis 感染，但由于其频率较低且动力学特征不同，这些细胞在受感染肠道中的表征在很大程度上被忽视。本方案描述了从不同靶器官中分离这些细胞并鉴定其身份的方法。 通过 不同感染阶段的流式细胞术

摘要

IL-9 是一种具有多效性的细胞因子，与多种生理和病理过程相关，包括抗肿瘤免疫、过敏性疾病的诱导以及抗寄生虫感染的免疫应答，其中在清除线虫寄生虫过程中发挥重要作用。在小鼠巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis）感染模型中，IL-9 主要由肺、小肠及引流淋巴结中的 CD4+ T 淋巴细胞和固有淋巴样细胞产生。由于 IL-9 胞内染色技术操作困难，且感染后从小肠分离造血细胞过程复杂，因此迫切需要一种全面而简便的实验方案，用于分析该模型中不同淋巴组织和非淋巴组织内 IL-9 的表达情况。本文所述方案系统描述了在 N. brasiliensis 感染过程中，肺和小肠（主要靶器官）以及纵隔淋巴结和肠系膜淋巴结中 CD4+ T 细胞与固有淋巴样细胞产生 IL-9 的动力学特征。此外，方案还详细说明了根据目标细胞类型和器官确定所需的感染幼虫数量。本方案旨在通过帮助研究者聚焦于 N. brasiliensis 感染模型中特定的细胞类型、器官和疾病阶段，促进实验的标准化，从而节省时间和资源。

引言

钩虫是肠道寄生虫，全球约有7亿人感染，主要集中在发展中国家的热带地区。高强度感染可导致 十二指肠钩口线虫 和 美洲钩虫，人类中最常见的钩虫寄生虫，可引起贫血和蛋白质缺乏，导致生长迟缓和智力发育障碍1. N. americanus 以及啮齿类动物寄生虫 Nippostrongylus brasiliensis 在宿主中诱导典型的2型免疫反应，并在生命周期方面具有相似性。因此，小鼠感染 N. brasiliensis 是人类钩虫感染最常用的模型。三期幼虫（L3） N. brasiliensis 感染性幼虫在感染后的最初几小时内从皮肤移行至肺部。到达肺部后，幼虫发育为L4阶段，随后沿气管向上迁移并被吞咽，经胃部进入肠道，并在4至5天内发育为成虫（L5）。在肠道内，L5期蠕虫产卵，虫卵随粪便排出体外，从而重新启动寄生虫的生活周期。2.

N. brasiliensis 诱导的免疫反应特征是多种2型细胞因子水平升高，包括IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13，同时伴有嗜酸性粒细胞增多、嗜碱性粒细胞增多、杯状细胞和肥大细胞增生，以及IgG1和IgE产生增加。大多数旨在鉴定和界定N. brasiliensis感染所引发免疫反应的研究，主要集中于IL-4或IL-13在此模型中的作用3。然而，表达IL-9的细胞的鉴定及其细胞因子功能在很大程度上被忽视，直到Licona-Limón等人发表了首项研究，证明IL-9在抗N. brasiliensis免疫反应中具有关键作用。该研究利用报告基因小鼠，描述了T细胞（主要是辅助性T细胞9）和2型固有淋巴细胞（ILC2s）是感染后表达IL-9的主要细胞亚群4。

从感染寄生虫的肺组织中分离和表征免疫细胞是可行的，已有大量文献报道3,4。然而，由于肠道感染后固有的组织重塑和黏液产生，对感染肠道进行类似操作曾长期存在技术难题，直至Ferrer-Font等人的近期研究发表才得以解决5。该研究团队提出了一种从感染Heligmosomoides polygyrus的小鼠肠道中分离并分析免疫细胞亚群单细胞悬液的实验方案。在此基础上，我们现已建立了一套标准化流程，用于从感染N. brasiliensis的小鼠肠道中分离并进行IL-9表达淋巴样细胞的流式细胞分析。此外，我们还系统地确定了在感染过程中来自不同细胞来源和解剖部位的IL-9表达动力学特征。

明确参与该感染的不同细胞群体，对于深入理解宿主对寄生虫的免疫应答及其与宿主的相互作用至关重要。本综合实验方案提供了一条清晰的技术路径，可用于在特定疾病阶段从目标器官中分离和分析产生IL-9的细胞，从而显著增进对这些细胞在巴西诺卡氏线虫（N. brasiliensis）感染以及更广泛的寄生虫感染中所起作用的认识。

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方案

本文所述所有动物实验均经墨西哥国立自治大学细胞生理研究所动物实验管理内部委员会（CICUAL）批准。

注意：整个实验方案的流程图见图1。

1. 小鼠的饲养

  1. 使用8至10周龄的雌性或雄性小鼠群体，饲养于温度和湿度恒定的动物设施中，采用12小时光照/12小时黑暗循环， 随意摄取 饮水和食物的获取。
    注意：本实验方案使用了如前所述的C57BL/6背景的IL-9报告小鼠品系4；然而，也可使用其他IL-9报告基因小鼠品系6,7,8, 以及细胞内IL-9染色，结果存在差异9.

2. 小鼠感染

  1. 在感染前1天，将小鼠背部从身体中部至尾根部附近的毛发剃除。无需使用麻醉剂。
  2. 按照先前所述方法2,11，在小鼠下背部皮下接种200个具有活性的第三阶段N. brasiliensis幼虫（L3），溶于100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中10；对照组小鼠则仅注射100 µL PBS。于感染后第4天、第7天或第10天处死动物。

3. 肺、小肠、纵隔和肠系膜淋巴结的分离

  1. 通过颈椎脱位处死小鼠。将小鼠仰卧放置，并用70%乙醇喷洒。使用剪刀沿中线做切口，打开皮肤以暴露腹部和胸部区域。
    注意：异氟烷可作为替代的安乐死方法12不建议使用二氧化碳舱，因为CO2 导致肺组织损伤和出血13.
  2. 纵隔淋巴结和肺组织的分离
    1. 在胸骨处做一切口，并沿纵向切开 "V" 形状以去除肋骨和胸肌。暴露胸腔后，在食管旁、心脏下方找到纵隔淋巴结（参见 补充图1).
    2. 取出纵隔淋巴结，并将其收集于1 mL R-10培养基中（表1在12孔培养板中。置于冰上避光保存，直至处理。
      注意：样品应避光保存，以避免本实验所用报告基因小鼠的荧光信号减弱。
    3. 每只小鼠取出肺脏后，置于含1 mL R-10培养基的12孔细胞培养板中。置于冰上并避光保存，直至后续处理。
  3. 肠系膜淋巴结链和小肠的分离
    1. 暴露腹腔，小心将小肠向右移动，以暴露沿结肠分布的肠系膜淋巴结（MLN）链。
    2. 用镊子取出肠系膜淋巴结，将其在纸巾上轻轻滚动，去除脂肪组织。
    3. 将MLN转移至12孔培养板中的1 mL R-10培养基中。置于冰上避光保存，直至处理。
    4. 在幽门括约肌下方和盲肠上方切断小肠。借助镊子缓慢拉出肠管，同时去除附着的肠系膜和脂肪组织。
    5. 将小肠置于纸巾上，并用 PBS 充分润湿。用剪刀从小肠上移除派伊尔结。
      注意：为保持活性，需去除残留的脂肪组织，并在整个过程中用 PBS 保持小肠湿润。
    6. 用剪刀将小肠纵向剪开，然后用镊子轻轻沿打开的小肠滑动，以清除粪便内容物和黏液。
    7. 用镊子夹住小肠，在冰上用5 mL PBS轻轻浸没冲洗数次。重复该步骤两次。
    8. 将小肠切成短段（约5 mm），并用10 mL HBSS收集至50 mL锥形管中14 含 2% FBS（表1立即继续分离上皮内和固有层细胞。

4. 小肠、肺和淋巴结单细胞悬液的制备

注意：在从小肠制备单细胞悬液时，每人处理的小鼠数量最多不得超过六只，因为处理时间延长会显著降低细胞活力。本方法改编自Heligmosomoides polygyrus感染小鼠模型5。

  1. 将摇床培养箱、R-20 培养基、HBSS 和 HBSS-2 mM EDTA（表 1）预热至 37 °C。
  2. 每份样品准备 10 mL 小肠消化液（表 1）。
  3. 用手剧烈振荡步骤 3.3.8 中的小肠组织片段。
  4. 将每份样品通过置于玻璃漏斗上的尼龙网筛（约 10 cm × 10 cm）过滤。向网筛上加入 10 mL 预热的 HBSS 洗涤样品，并弃去滤过液。重复一次。
    注意：每份样品使用新的网筛，并在整个操作过程中重复使用该网筛。
  5. 从漏斗上取下网筛，用 10 mL 温热的 HBSS-2 mM EDTA（步骤 4.1）将网筛上的样品收集至 50 mL 锥形管中。在 37 °C、200 rpm 振荡条件下孵育 10 分钟。
  6. 以最大速度（3,200 rpm）涡旋 10 秒，并通过置于玻璃漏斗上的网筛过滤样品，将滤过液收集至 50 mL 锥形管中。
  7. 重复步骤 4.5 和 4.6 两次，将滤过液均收集至同一 50 mL 锥形管中。上皮内细胞位于此 30 mL 组分中。保留剩余组织。
  8. 上皮内细胞的单细胞悬液制备
    1. 将步骤 4.7 中获得的 30 mL 细胞悬液在室温（RT）下以 450 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
    2. 加入 5 mL PBS，于室温下以 450 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
    3. 将细胞沉淀重悬于 3 mL RPMI 10% FBS-20 µg/mL DNase（表 1）中。置于冰上，避光保存，直至进行细胞染色。
  9. 固有层细胞的单细胞悬液制备
    1. 将步骤 4.7 中剩余的小肠组织用 10 mL 温热 HBSS 通过置于漏斗上的网筛冲洗一次，重复洗涤一次。用 10 mL 小肠消化液将网筛上的组织收集至 50 mL 锥形管中。
    2. 在 37 °C、200 rpm 振荡条件下孵育 30 分钟。每 5 分钟以最大速度涡旋 10 秒。
    3. 加入 10 mL FACS-EDTA 缓冲液（表 1）以终止消化反应，并置于冰上。
    4. 使用移液管将每份样品通过 100 µm 细胞筛过滤，将悬液收集至置于冰上的 50 mL 锥形管中。
    5. 在 4 °C 下以 600 × g 离心 6 分钟。
    6. 弃去上清液。用 5 mL PBS 洗涤细胞沉淀，并在 4 °C 下以 600 × g 离心 6 分钟。
    7. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL RPMI 10% FBS-20 µg/mL DNase 中。置于冰上，避光保存，直至进行细胞染色。
  10. 肺组织的单细胞悬液制备
    注意：为避免操作时间过长导致细胞活力降低，应由两人分别平行处理每份肺组织和小肠组织。
    1. 每处理一份样品，准备 4 mL 肺组织消化液（表 1）。
    2. 从步骤 3.2.3 的孔中取出含肺组织的 RPMI 培养基，用精细剪刀将肺组织剪成小块。
    3. 用刮勺将肺组织块转移至 15 mL 锥形管中，加入 4 mL 肺组织消化液（表 1）。
    4. 在 37 °C、250 rpm 振荡条件下孵育 30 分钟。完成后置于冰上，待所有样品处理完毕。
    5. 将每份样品通过置于 6 孔板单个孔中的 100 µm 细胞筛过滤，用注射器活塞头解离组织。
    6. 将每份样品收集至 15 mL 锥形管中，加入 4 mL R-2 培养基（表 1）。在处理其他样品时保持置于冰上。
    7. 在 4 °C 下以 600 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL R-5 培养基（表 1）中。
    8. 在离心过程中，为每份样品准备 4 mL 27.5% 密度梯度溶液（表 1），用于富集造血细胞组分15,16。相较于其他类似的密度梯度介质，该单细胞分离策略更高效、更具成本效益且毒性更低17。
    9. 将 4 mL 27.5% 密度梯度溶液加入步骤 4.10.7 中的 1 mL 细胞悬液中，剧烈振荡。
    10. 缓慢地在混合悬液上方加入 1 mL R-5 培养基（表 1），形成两相。
    11. 在室温下以 1,500 × g 离心 20 分钟，低加速、关闭刹车。观察两相之间形成的环状层。
    12. 用 1 mL 微量移液器回收两相之间的环状层，并重悬于 4 mL R-2 培养基中。
    13. 在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL ACK 缓冲液（表 1）中，在室温下孵育 1 分钟。
    14. 加入 4 mL R-5 培养基，在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL R-10 培养基中。置于冰上，避光保存，直至进行流式细胞术染色。
  11. 淋巴结的单细胞悬液制备
    1. 将步骤 3.2.2 或 3.3.3 中的淋巴结置于 6 孔板孔内两片网筛之间，用注射器活塞头解离组织。
    2. 将细胞悬液收集至 1.5 mL 锥形管中，在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟。
    3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL R-10 培养基中。置于冰上，避光保存，直至进行流式细胞术染色。
      注意：若可见细胞团块，需将样品通过 100 µm 细胞筛过滤。

5. 用于流式细胞术的细胞染色（图2 和 图3）

注意：将步骤 4.11.3 中获得的淋巴结细胞悬液在 4 °C 条件下以 450 × g 离心 5 分钟，并将细胞沉淀重悬于 500 µL FACS 缓冲液中（表 1）。

  1. 用于鉴定ILC2细胞的细胞染色（图3 和 补充图2）
    注意：该染色程序专用于鉴定表达IL-9的ILC2细胞。
    1. 将步骤4.10.14中每份肺组织样本150 µL（约1.8 x 106 个细胞）以及步骤4.11.3中每份淋巴结样本50 µL（纵隔和肠系膜淋巴结样本分别约为0.7 x 106 和2.2 x 106 个细胞）加入至96孔圆底培养板中。加入100 µL FACS缓冲液，在4 °C下以450 x g 离心5分钟。
    2. 将步骤4.8.3和4.9.7中每份小肠样本100 µL（上皮内和固有层样本分别约为2.7 x 106 和0.6 x 106 个细胞）加入至96孔圆底培养板中。加入150 µL FACS缓冲液，在4 °C下以450 x g 离心5分钟。
    3. 弃去上清液，将每份细胞沉淀重悬于50 µL用FACS缓冲液稀释的生物素化抗体混合液中（表2），在4 °C避光孵育30分钟。
      注意：上皮内和固有层样本应使用含20 µg/mL DNase的FACS缓冲液。
    4. 加入150 µL FACS缓冲液，在4 °C下以450 x g 离心5分钟。
    5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL FACS缓冲液中，再次离心并弃去上清液。
    6. 将细胞沉淀重悬于50 µL抗体/染料混合液中（表2），在4 °C避光孵育30分钟。
    7. 加入150 µL FACS缓冲液，在4 °C下以450 x g 离心5分钟。
    8. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL FACS缓冲液中，再次离心并弃去上清液。重复洗涤一次（步骤5.1.7），并弃去上清液。
    9. 将细胞沉淀重悬于300 µL FACS缓冲液中，进行流式细胞术分析。
    10. 对于小肠和肺组织样本，采用以下设门策略：淋巴细胞、单细胞、活细胞、造血细胞、CD90+Lineage-细胞、ST2+细胞和IL-9+细胞（图3A、B 和 补充图2A）。对于淋巴结样本，采用以下设门策略：活细胞、单细胞、CD90+ Lineage-细胞、ST2+细胞和IL-9+细胞（补充图2B,C）。
  2. 用于鉴定IL-9产生型淋巴细胞的细胞染色（图2 和 补充图3）
    1. 将步骤4.10.14中每份肺组织样本800 µL转移至1.5 mL离心管中（约14.6 x 106 个细胞），在4 °C下以450 x g 离心5分钟，弃去上清液。
    2. 对于淋巴结样本，将步骤4.11.3中细胞悬液400 µL（纵隔和肠系膜淋巴结样本分别约为5.6 x 106 和17.5 x 106 个细胞）分两步加入96孔圆底板中。
      1. 先转移200 µL，于4 °C下以450 x g 离心5分钟，弃去上清液。
      2. 再向对应孔中加入另外200 µL，于4 °C下以450 x g 离心5分钟，弃去上清液。
    3. 将细胞沉淀重悬于50–400 µL抗体/染料混合液中（表3），在4 °C避光孵育30分钟。
      注意：肺组织样本应使用400 µL染色混合液重悬，纵隔淋巴结样本使用50 µL，肠系膜淋巴结样本使用100 µL。
    4. 向纵隔淋巴结样本中加入150 µL FACS缓冲液，向肠系膜淋巴结样本中加入100 µL FACS缓冲液，在4 °C下以450 x g 离心5分钟，弃去上清液。
    5. 分别用1 mL和200 µL FACS缓冲液重悬肺组织和淋巴结样本的细胞沉淀进行洗涤，在4 °C下以450 xg 离心5分钟，弃去上清液，并重复洗涤一次。
    6. 将肺组织样本重悬于600 µL FACS缓冲液中，进行流式细胞术分析。采用以下设门策略：淋巴细胞、单细胞、活细胞、造血细胞、CD4+TCRβ+细胞和IL-9+细胞（图2A）。
    7. 将淋巴结样本重悬于300 µL FACS缓冲液中，进行流式细胞术分析。采用以下设门策略：淋巴细胞、单细胞、活细胞、CD4+ TCRβ+细胞和IL-9+细胞（图2B 和 补充图3A）。

6. 单细胞悬液中细胞绝对数量的测定

  1. 用 PBS 将分离步骤 4.8.3、4.9.7、4.10.14 和 4.11.3 中的样品按 1:20 的比例稀释（10 µL 样品 + 190 µL PBS）。
  2. 取步骤 6.1 中每种稀释后的样品 10 µL，与 10 µL 台盼蓝混合。取 10 µL 混合液加入血细胞计数板，计数活细胞数，并考虑各稀释倍数。
  3. 通过将流式细胞术测定的活细胞中目标细胞群所占百分比（活力染料阴性细胞）乘以分离后单细胞悬液中的总活细胞数，再将所得数值除以 100，计算出细胞的绝对数量（补充图 4、补充图 5 和补充图 6）。
    绝对数量 =（流式细胞术测定的活细胞中目标细胞群百分比 × 单细胞悬液中总活细胞数）/100

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结果

小鼠皮下注射200条L3期N. brasiliensis幼虫，对照组则注射PBS作为假感染对照。本方案中使用的幼虫数量经过调整，以便从小鼠肺组织、淋巴组织及小肠中分离出有活性的细胞，这与以往研究不同——以往通常使用更高剂量的寄生虫，仅用于在淋巴组织和肺中检测细胞4。在感染后第0、4、7和10天分别采集肺组织、纵隔淋巴结、肠系膜淋巴结以及小肠组织，用于淋巴细胞的分离，并鉴定产IL-9的细胞群体。本研究共使用27只小鼠，进行了两次或以上的独立实验，包括9只对照小鼠，以及每个时间点4至6只N. brasiliensis感染小鼠。每次实验均包含假感染对照组，以获取基础细胞数量。采用本方案，可从小鼠肺组织、肠系膜淋巴结和纵隔淋巴结中分离出产IL-9的CD4+ T细胞（在此模型中主要为Th9细胞），用于定量分析及后续研究。

根据感染的自然进程，我们首先评估了肺和纵隔淋巴结中产生IL-9的CD4+ T淋巴细胞（Th9）的频率（设门策略见图2A和

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讨论

要全面理解肠道寄生虫与宿主之间的相互作用以及宿主对蠕虫感染的免疫应答，必须鉴定并分析在组织重塑和蠕虫排出过程中起关键作用的不同细胞群体及效应分子。土源性蠕虫感染在全球发展中国家仍是一个重大公共卫生问题。然而，直到最近，尚无一种可用于分析小肠中稀有细胞群体的实验方案——小肠是此类感染的主要受累器官5。本方案涵盖了先前已描述的方法，可用于在巴西日圆线虫（N. brasiliensis）感染期间，对肺组织、纵隔淋巴结和肠系膜淋巴结中表达IL-9的淋巴样细胞进行流式细胞术分析，并进一步首次实现了对该细胞群体在小肠中的鉴定。

该实验方案的成功高度依赖于组织处理时间。建议每人每次最多处理六个小肠样本。若需同时处理不同器官，建议由另一人并行操作。通过使用相对较低的寄生虫负荷（200条L3幼虫），本方案可在维持从其他器官分离淋巴样细胞能力的同时，实现从N. brasiliensis感染的小肠中分离淋巴样细胞。使用较高的寄生虫负荷会损害从小肠中分离细胞的质量和数量（数据未显示）；然而，这可能导致其他器官中表达IL-9...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 José Luis Ramos-Balderas 提供的技术支持。本研究工作获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）向 PLL 提供的以下资助项目（FORDECYT-PRONACE-303027）的支持。OM-P 和 EO-M 分别获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）的博士后奖学金资助（编号分别为 736162 和 481437）。MCM-M 获得了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）“墨西哥博士后研修计划”（Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)）的奖学金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACK 缓冲液自制
Attune Nxt 流式细胞仪Thermofisher
B220Biolegend103204
CD11bBiolegend101204
CD11c Biolegend117304
CD19 Biolegend115504
CD4Biolegend100404
CD4 (BV421)Biolegend100443
CD45.2Biolegend109846
CD8 Biolegend100703
CD90.2Biolegend105314
胶原酶 DRoche11088866001
DNase IInvitrogen18068015比活性：≥10 000 单位/mg   
Facs ARIA II 分选仪BD Biosciences
FACS Melody 细胞分选仪BD Biosciences
Fc-BlockBiolegend101320
FcεRIeBioscience13589885
胎牛血清Gibco26140079
FlowJoFlowJo流式细胞术分析数据软件
Gr-1Tonbo305931
汉克斯平衡盐溶液 (HBSS)自制
IL-9biolegend514103
NK1.1 Biolegend108704
尼龙筛网 ‎ lbaB07HYHHX5V
OptiPrep 密度梯度介质SigmaD1556
磷酸盐缓冲液 自制
RPMIGibco11875093
Siglec F Biolegend155512
链霉亲和素Biolegend405206
TCR-β Biolegend109203
TCR-β (PE/Cy7)Biolegend109222
TCR-γδ Biolegend118103
Ter119Biolegend116204
Tricine 缓冲液 自制
Zombie Aqua 可固定活力染料Biolegend423101

参考文献

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IL 9 CD4 T
一种研究Nippostrongylus brasiliensis感染模型中产生IL-9的淋巴细胞的策略
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