本方案演示了一种 体外 内皮细胞转胞吞实验作为一种模型，通过检测人视网膜微血管内皮细胞在小窝介导的跨细胞转运过程中跨细胞运输辣根过氧化物酶的能力，评估内层血-视网膜屏障的通透性。
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方法文章
内皮细胞转吞作用检测方法作为一种 体外 评估内层血-视网膜屏障通透性的模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
血-视网膜屏障（BRB）功能障碍是多种血管性眼病病理生理过程中的重要因素，常导致视网膜水肿及继而发生的视力丧失。内层血-视网膜屏障（iBRB）主要由视网膜血管内皮构成，在生理条件下具有低通透性的特征。这种低通透性特征受到严格调控并得以维持，主要依赖于相邻视网膜微血管内皮细胞间极低的旁细胞转运率以及通过细胞本身的跨细胞转运（胞吞转运）过程。对视网膜跨细胞屏障通透性的评估，可能为理解健康与疾病状态下iBRB的完整性提供基础性见解。在本研究中，我们描述了一种内皮细胞（EC）胞吞转运检测方法，作为一种 体外 用于评估内层血-视网膜屏障（iBRB）通透性的模型，采用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）。该检测方法分别评估HRMECs通过受体介导和小窝蛋白介导的跨细胞转运过程运输转铁蛋白和辣根过氧化物酶（HRP）的能力。将完全汇合的HRMECs培养于多孔膜上，分别与荧光标记的转铁蛋白（网格蛋白依赖性胞转作用）或HRP（小窝蛋白介导的胞转作用）共孵育，测定转移至下室的转铁蛋白或HRP水平，以反映内皮细胞单层中的胞转水平。通过调控已知调节iBRB的Wnt信号通路，验证基于小窝蛋白介导的HRP胞转检测方法。本文所述的内皮细胞胞转检测方法可为研究血管病理状态下内皮细胞通透性及iBRB完整性的分子调控机制，以及药物递送系统的筛选提供有力工具。 关键词：内层血-视网膜屏障，iBRB，人视网膜微血管内皮细胞，HRMECs，转铁蛋白，辣根过氧化物酶，HRP，胞转作用，小窝蛋白介导的胞转，网格蛋白依赖性胞转，Wnt信号通路，内皮细胞通透性，药物递送系统
引言
人视网膜是体内能量需求最高的组织之一。神经视网膜的正常功能需要充足的氧气和营养供应，同时限制其他潜在有害分子的进入，以保护视网膜微环境，这一过程由血-视网膜屏障（BRB）介导1。与中枢神经系统中的血-脑屏障（BBB）类似，BRB在眼部起到选择性屏障的作用，调控离子、水、氨基酸和糖类在视网膜内外的转运。BRB还通过阻止免疫细胞、抗体和有害病原体等循环因子的进入，维持视网膜的稳态及其免疫豁免状态2。BRB功能障碍参与多种血管性眼病的病理生理过程，如糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性（AMD）、早产儿视网膜病变（ROP）、视网膜静脉阻塞和葡萄膜炎，导致血管源性水肿及继发性视力丧失3,4,5。
血-视网膜屏障（BRB）由两个独立的屏障组成，分别对应于两个不同的ocular血管网络：视网膜血管系统和位于视网膜下方的有孔毛细血管——脉络膜毛细血管。内层BRB（iBRB）主要由视网膜微血管内皮细胞（RMECs）构成，这些细胞排列在视网膜微血管内壁，为视网膜内层神经元提供营养。另一方面，视网膜色素上皮细胞构成了外层BRB的主要部分，位于神经感觉性视网膜与脉络膜毛细血管之间2<....
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方案
所有动物实验均经波士顿儿童医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，用于获取光学显微镜和电镜图像（图3）。实验方案 体内 研究可参见 Wang 等人。24所有涉及人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的实验均经波士顿儿童医院机构生物安全委员会（IBC）批准。
1. 试剂的准备
- 组织培养皿包被液的配制：将1 mL明胶储备液（40%-50%）溶解于500 mL无菌组织培养级1×PBS（pH = 7.4）中，配制成0.1%明胶溶液。使用0.22 µm滤膜过滤该溶液。将0.1%明胶溶液储存于2-8°C。在无菌条件下，该溶液可在上述温度下长期保存。
- 生长培养基：根据生产商说明书（材料表），将EGM添加剂溶解于内皮细胞生长基础培养基（EBM）中，配制500 mL内皮细胞完全生长培养基（EGM）。将生长培养基分装至50 mL离心管中，于4 °C保存。生长培养基在4 °C下的保质期为12个月。
- 胰蛋白酶溶液：将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液从原装瓶中分装至50 mL离心管中，于4 °C保存（最多2周）或−20 °C保存（最多24个月）。
2. HRM....
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结果
视网膜血管内皮细胞的透射电镜图像显示内皮细胞中存在穿胞囊泡运输及小窝样囊泡 体内.
EC 跨细胞转运可被可视化 体内 在光学显微镜下，视网膜横切面中可见深棕色沉淀物，代表含辣根过氧化物酶（HRP）的血管图3A）以及作为含有HRP的穿胞小泡的电子致密沉淀物（图3B, C）使用透射电子显微镜（TEM）观察，从而证明内皮细胞通过iBRB的转胞吞作用。较大的囊泡可能反映巨胞饮作用（白色箭头； 图3B），小囊泡可能代表小凹小泡（白色箭头； 图3C）。此外，在荧光显微镜下可观察到小窝在视网膜血管中的定位，表现为小窝标志物CAV-1抗体与血管内皮标志物异凝集素（EC marker）在血管中的共染色.......
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讨论
血-视网膜屏障（BRB）在视网膜健康与疾病中发挥着至关重要的作用。体外血管通透性评估技术已被证明是研究屏障（BRB/血脑屏障）发育与功能的关键工具。本文所述方法可用于研究内皮细胞转胞吞作用的分子机制，或评估影响BRB通透性的相关分子调节因子。体外内皮细胞转胞吞检测相较于体内检测或血管通透性评估技术具有多项优势：操作快速、通量高，可用于分析多种不同变量或特定信号通路中孤立分子的作用，且可结合基因和药物手段进行调控。纯内皮细胞培养体系消除了体内实验中常见的个体动物差异，同时限制了其他细胞类型对目标分子可能产生的修饰或内吞作用32。HRMEC细胞的培养操作简便，仅需大多数实验室常见的基础细胞培养设备，且在成本上通常优于体内动物实验。尽管体外转胞吞检测无法完全模拟体内生理条件33，但它们仍可作为有价值的工具，补充体内研究，推动我们对BRB调控机制的理解。
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披露
作者无任何利益冲突或经济利益需要披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01 EY028100、EY024963 和 EY031765），资助对象为 JC。ZW 获骑士圣殿眼科基金会职业启动奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物安全柜 | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| 细胞培养皿 | Nest Biotechnology | 704001 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5702 | |
| 离心管（15 mL） | Corning Inc. | 352097 | |
| 离心管（50 mL） | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 氰基3-人转铁蛋白 | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| 内皮细胞基础培养基-2（EBM-2） | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| 内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）SingleQuots 添加剂 | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell 电阻测量系统-2（ERS-2） | Millipore | MERS00002 | |
| 胎牛血清（FBS） | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| 血细胞计数板（双计数室） | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| 辣根过氧化物酶（HRP） | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| 人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC） | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| 培养箱 | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L细胞（用于对照条件培养基） | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A细胞（用于Wnt3A条件培养基） | ATCC | CRL-2647 | |
| 光学显微镜 | Leica | DMi1 | |
| 多功能酶标仪 | EnSight, PerkinElmer | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液（1×） | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu 荧光过氧化物酶底物试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| 重组人Norrin蛋白（rhNorrin） | R&D Systems | 3014-NR | |
| 重组人血管内皮生长因子（rhVEGF） | R&D Systems | 293-VE | |
| 注射器滤器（0.22 µm） | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell 小室（6.5 mm Transwell，0.4 µm 孔径聚酯膜插入物） | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%）（1×） | GIBCO | 25-200-072 | |
| 水浴锅 | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939（Wnt/β-catenin 抑制剂） | Selleckchem | S1180 |
参考文献
- Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
- Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. <....
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重印与许可
