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方法文章

一种低成本测量方法 原位 静水水体附生藻类群落的初级生产力

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DOI:

10.3791/64078

2022年12月16日

本文内容

摘要

本文介绍了一种经济、便携的方法/装置,用于在真实环境下测量微生物席的初级生产力 原位 环境温度和光照条件。该实验装置基于广泛可得的材料,可在多种条件下使用,同时具备基于实验室模型的优势。

摘要

测量 原位 生长季节梯度下附生藻类初级生产力的研究可阐明环境驱动因子(主要是磷浓度和光照强度)以及物种组成对初级生产力的定量影响。初级生产力主要受光照强度、温度、营养物质的可利用性以及真光层不同深度下碳酸盐体系离子形态分布的调控。该系统十分复杂,难以在实验室条件下进行有效模拟。本研究采用一种低成本、可移动且易于搭建的浮台装置,可在实际自然环境中精确测定初级生产力。该方法基于将非侵入式氧气传感器集成于密闭玻璃瓶中,实现实时初级生产力测量,并在线监测氧气通量,从而为代谢活动提供新的认识。详细的季节性 原位 微生物垫(或其他底栖生物)总初级生产力的测量可增进对静水水体中初级生产力动态控制过程的现有认知。

引言

初级生产力是自生碳进入水生系统的唯一途径,构成了整个系统食物网的基础1。因此,准确估算初级生产力是理解水生生态系统功能的关键步骤。沿岸带是初级生产力和生物多样性较高的区域。除了浮游植物外,附生生物群(下文称为微生物垫)和大型藻类也被认为对沿岸带的初级生产力有重要贡献2。由于这些生物具有固着生活方式且在空间上存在显著异质性,其初级生产力的量化并非易事。

初级生产力主要受光照强度、温度、营养物质的可利用性以及真光层不同深度中碳酸盐体系离子种类分布的驱动。3,4深度显著影响着微生物席的空间分布。在较浅的深度,微生物群落必须应对高强度辐射和显著的季节性温度变化带来的不利影响,而在较深的区域则需适应较低的光照强度。除了深度梯度外,动态的营养相互作用还在不同尺度上形成了多种且复杂的空间格局。5该复杂系统在实验室中模拟较为困难。推断来自沿岸带各个初级生产者的代谢活性最准确的方法是建立 原位 实验。

本文介绍的方法基于传统的培养皿法2,6,7,并结合了一种可移动、低成本且易于构建的浮筏装置。该方法能够在自然光照光谱、温度以及碳酸盐体系离子种类随深度分布不同的条件下,测量不同水深的初级生产力。该方法基于明暗瓶溶氧量差异的原理,最初用于测量浮游植物光合作用6,至今仍被广泛使用6,7。该方法通过比较置于光照条件下(包含初级生产力和呼吸作用的共同影响)与黑暗条件下(仅呼吸作用)瓶中溶氧量的变化速率来进行分析8。该方法以氧气释放量(光合作用)作为初级生产力的替代指标。所测量的变量包括净生态系统生产力(NEP,即光照条件下单位时间内O2浓度的变化)和生态系统呼吸量(RE,即黑暗条件下单位时间内O2浓度的变化)。总生态系统生产力(GEP)则通过两者之差计算得出(表1)。此处使用“生态系统”一词,意在表明附生生物群落由自养和异养生物共同组成。相较于传统培养皿法,本方法最主要的改进在于采用了非侵入式光学溶氧传感器,并对该原本主要用于浮游生物的方法进行了优化,以适用于附生生物初级生产力的测定。

该技术以捷克共和国新形成的采矿后湖泊——米拉达湖、莫斯湖和梅达尔湖沿岸带微生物席的测量为例进行描述。通过直接测定法确定微生物席的代谢活性 原位 O的测量2 在特定深度直接进行通量测量,这些深度是所研究群落自然分布的位置。异养和光养活性的测定在配备非侵入性光学氧传感器的密闭玻璃瓶中进行。这些传感器利用对光敏感染料的荧光来检测氧气分压。含有微生物席的玻璃瓶被悬挂在浮置装置上,并在相应深度进行孵育。在白天时段,通过小船对瓶内氧气浓度进行连续监测。

完整的微生物席样品由潜水员采集,并置于指定深度的密闭培养瓶中。每个培养瓶均配备一种非侵入式光学氧微传感器,用于监测 O2 随时间变化的生产力/消耗量。每个深度的测量均进行五次重复的暗/光配对实验。在培养期间,持续测量相应深度的温度和光合有效辐射(PHAR)强度。培养6小时后 原位 孵育(白天时段)后,从瓶中采集微生物席并进行干燥。2 通量数据归一化至微生物生物量。作为对照,使用不含微生物席生物量的湖泊水样,在独立的透光和避光密闭瓶(空白对照)中校正氧气浓度变化对通量的影响。下文将详细介绍漂浮平台的搭建方法及整个实验的逐步操作流程。本文还展示了在两个水深(1 m和2 m)条件下对微生物席进行测量的代表性结果,每个深度设置五个重复。实验全程使用数据记录仪监测实际温度和光照强度。

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方案

注意:采样前,应根据整个项目需求、统计设计或预期的样本变异性程度来确定重复次数。建议设置五组光照和黑暗培养瓶的重复样本,以实现精确的统计分析,并应对潜在的样品损失或破损情况。所述的浮动实验驳船设计可容纳五组重复样本外加一对空白对照;实验驳船的技术图纸详见图1

静态平衡示意图,展示重量分布与受力情况,用于建筑结构分析。
图1实验驳船和侧浮体的技术图纸 (A俯视图:驳船框架由四根铝制角钢L型材(蓝色)组成,通过四根铝制平板条(灰色)连接在一起。XPS浮体(粉色)在框架上平行铝材的两个位置固定。用于悬挂培养瓶的链条通过快挂扣固定在框架两侧预制孔(红色箭头)处,两孔间距为550 mm。链条上在1 m和2 m处设有快挂扣,用于连接培养瓶(根据实验深度选择快挂扣位置)。混凝土锚固定在驳船船首,此处有25 mm的悬挑部分,设有两个预制孔(黄色箭头),用于连接锚链和研究船只。框架可方便地进行组装与拆卸 通过 四个铝制角件之间的平行接缝(绿色箭头所示)。B侧面视图显示了悬挂的链条、悬垂的培养瓶以及混凝土锚(棕色方块)。C侧部XPS浮体:平行的铝制角材L型件(蓝色)通过垂直的铝制扁条(灰色)连接。在横杆部分下方,安装有XPS浮体(粉色),并标示出所需的孔径大小(4 mm)。悬挂链条通过8 mm孔中的弹簧扣固定(红色箭头)。在驳船船首处,于悬伸的铝材上钻有两个8 mm的孔,一个用于将锚固定至驳船上(黄色箭头),另一个用于将研究船系泊至驳船上(蓝色)。 请点击此处以查看此图的放大版本。

1. 实验驳船的构建

注意:浮动平台由两个相同的部分组装而成,便于安装和拆卸。所有使用的部件均可在任何 hobby 市场或销售建筑材料的商店购买。

  1. 首先,通过使用四根铝制角材L型型材(40 mm x 40 mm x 3 mm;长度为2,000 mm)和四根铝制扁条(40 mm x 3 mm x 350 mm)、16个螺钉(4 mm x 15 mm,带六角螺母)以及32个垫圈(4 mm x 10 mm)将各部件连接,组装驳船的框架
    注:扁条的距离和位置详见图1A中的技术图纸。浮体与侧边扁条连接的详细方式见图1B
  2. 连接框架的两个相同部分,在末端使用四个4 mm x 15 mm带蝶形螺母的螺钉和八个4 mm x 10 mm垫圈,将铝制角材L型型材相互固定(图1A中的绿色箭头所示)。
  3. 使用五块挤塑聚苯乙烯(XPS)材料(每块尺寸为500 mm x 200 mm x 150 mm)、十个10 mm x 170 mm带六角螺母的螺钉以及二十个10 mm x 50 mm垫圈,制备五个挤塑聚苯乙烯浮体(每个尺寸为500 mm x 200 mm x 150 mm)。按照技术图纸中所示的五个位置(图1A),将浮体固定在框架上。
  4. 在框架上钻孔(见图1A中红色箭头,标示出链条孔位及间距)。使用钢制卡宾钩(50 mm x 5 mm)将12 m长的钢链(线径3 mm,链环内径5.5 mm x 26 mm)固定在框架的孔中,用于悬挂培养瓶。每根链条配备成对的快挂钩(50 mm x 5 mm),以便根据实验设计将培养瓶安装至所需深度。本实验中,培养瓶分别置于1 m和2 m深度处。
  5. 制作锚具时,将一个15 L的桶内灌满混凝土。将一个带环螺栓插入混凝土中,并静置使其完全干燥。将5 m长的钢链固定在该螺栓上。将锚具牢固地连接至驳船船首的预钻孔位置(图1A、B 中黄色箭头所示)。
    ​注:带装配说明的技术图纸见图1A–C图2展示了组装完成的实验驳船照片。图3展示了培养瓶在链条上的固定方式。

静态平衡概念,带有平衡力的杠杆装置示意图。
图2:组装完成的实验驳船。 组装完成的实验驳船照片。红色箭头指示用于连接装有培养瓶的链条的孔位。绿色箭头指示浮筒两半部分的连接处。 请点击此处查看此图的放大版本。

水下生态观测装置;水生生物研究;用于环境研究的容器系统。
图 3:培养瓶。 两组深色和透明培养瓶在水下1米深处悬挂的照片。其中一组培养瓶内含有仍生长在石块上的完整微生物垫样品(红色箭头所示)。另一组为对照瓶,内含相应深度的湖水。黄色箭头指向附着在培养瓶内壁上的氧气传感器探点。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 野外安装

  1. 建议使用充气式皮划艇来放置浮台并开展实验,因其便于运输。
  2. 选择适宜水深的地点固定浮台。水深应确保下层培养瓶距离水底至少2 m,以避免扰动沉积物进入培养瓶周围的水体中。
  3. 将组装好的浮台固定在船尾后方。沿船侧小心放下锚,并调整位置使其略微低于水面,以便能够连同浮台一起将锚拖至所需深度的地点。
  4. 将锚从船上解开,沉降至水底,并将浮台固定在锚链上。
  5. 在浮台上固定用于悬挂培养瓶的链条。

3. 培养瓶的准备

  1. 使用带有气密密封盖的透明宽口 0.5 L 瓶。
    注意:可以调整瓶子的尺寸,但需同时增加驳船上的聚苯乙烯泡沫板以增强浮力。此处描述的驳船可稳定承载 24 个 0.5 L 玻璃瓶。
  2. 将氧气光学传感器贴片固定在每个瓶子的内壁上。
  3. 通过用黑色电工胶带包裹瓶子,为暗处理组的瓶子添加一层不透光覆盖层。
  4. 在装有光学传感器的位置上打一个微小孔洞。为防止光线进入瓶内,孔的直径应略小于传感器的直径。
    ​注意:任何能有效阻止光线进入瓶内的不透光材料均可使用。黑色电工胶带的优点在于耐磨损,且在水中不易脱落。

4. 样本采集与处理

注意:在较深的水域,样本的手动采集由潜水员完成;在浅水区域,可通过浮潜或涉水方式进行。

  1. 将培养瓶放入便携式箱中。
  2. 携带该箱下潜至相应深度。避免扰动周围水体中的沉积物。
  3. 小心地用样品填充培养瓶。尽量减少对样品生物量的扰动,例如使用长镊子操作。如果微生物垫生长在固体表面(如小石块)上,应小心地将带有完整生物量的整块石头转移至瓶中。
    注意:当微生物垫生长在石块上时,采样时应避免采集过大的石块——玻璃瓶在后续操作中可能因此破裂。
  4. 用相应深度的清洁水填充一对明/暗瓶,作为空白对照。
    注意:不含周丛生物样品的瓶子作为空白对照,用于测定周围水体中生物的氧气产生/消耗量,以确保所计算的周丛生物净初级生产力或总初级生产力不受干扰。
  5. 确保所有培养瓶中的水体清洁,不含干扰性的沉积物。
  6. 封闭瓶子后,将其带回锚定在浮筏上的船只。

5. 测定初级生产力

注意:坐在船上的人员从潜水员手中接过盒子,并执行以下步骤。

  1. 将前两对培养瓶固定在第一条链的卡扣上。
  2. 使用光纤氧含量仪测量每个瓶子中的初始氧浓度。将仪器的光纤电缆连接至安装在瓶内的氧传感器,并立即(几秒内)读取 O₂ 浓度值。2 通过瓶壁非接触式测量浓度。记录测得的数值。
    注意:操作时间较短;从潜水员取出瓶子到将其初始设置至相应深度,仅需几分钟。
  3. 随后,小心地将带有附着瓶的链条重新放回水中。确保培养瓶所处的深度与其中所装生物量的采样深度相同。
  4. 1 小时后再次从船上进行测量(见下文注释)。小心地将带有瓶子的每根链条拉回船上,通过将光纤电缆连接到传感器读取氧气值,然后再次将样品放回水中。
    注意:根据孵育过程中 O 的强度调整各次测量之间的时间间隔2 避免样品的生产/消耗导致瓶内过度饱和。
  5. 对所有成对的瓶子至少重复此步骤四到五次。
    注意:田间试验的整体设置如图所示 图4.

水生实验示意图:在不同深度测量 O₂ 水平,并使用重复水样。
图 4:野外实验装置示意图。 图示为固定在湖面的实验浮台。装有微生物席生物量的培养瓶(0.5 L)悬挂在两个不同深度(1 m 和 2 m)。潜水员在相应深度直接将微生物席样品采集至培养瓶中。单个培养瓶中的氧气浓度在船上进行测量。将培养瓶从水中提出,通过连接光纤至氧气传感器,可在数秒内完成氧气浓度测定,随后再小心地将培养瓶放回水中。对两个深度的两组培养瓶完成全部测量过程约需 2 分钟。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 样品分析

  1. 测量结束后,直接从瓶中取出样品,将微生物席的生物量转移至小型塑料离心管中。如果微生物席生长在固体基质(如石块)上,需用牙刷或小刀刮取。
  2. 在实验室中,将每个重复样品通过预先称重的玻璃纤维滤膜过滤,以测定干重9

7. 数据分析

  1. 在孵育期间,测定明瓶和暗瓶中的氧气浓度,并将其与灌装时水柱中的氧气浓度进行比较。
    注意:光照瓶中氧气随时间的变化是整个生态系统总初级生产力(GEP)与瓶内所有生物(包括来自周围水体和附生藻类群落的自养生物和异养生物)呼吸作用的综合结果。暗瓶中氧气的减少量反映了自养生物和异养生物的呼吸消耗。对照组(即不含附生藻类的瓶子)中氧气浓度的变化仅由周围水体中的异养或自养生物的活动引起。附生藻类的生产力和呼吸速率通过从空白培养瓶测得的周围水体生产力和呼吸速率中扣除后估算得出。
  2. 记录 O2 以百分比氧饱和度表示浓度(即,将氧气传感器校准至0%和100%氧饱和度)。在估算初级生产力之前,将原始数据转换为科学记法中表示原始氧气的化学符号,O₂。)转换为某个合理的单位。
    注意:在本研究中,数据被转换为 O2 根据Benson和Krause,在干重基础上,每克附生藻类生物量的有机物(OM)含量10.
    1. 使用公式(1):
      氧气浓度计算公式,化学过程分析的关键科学方程。 (1)
      何处 Cp 是 O2 水中浓度(mg (O2) L-1)当其被 O 完全饱和时2, V瓶子 是瓶子的体积(单位:mL), V石头 是石块所占的体积(单位:mL),是附生生物量的质量(单位:g),32 是 O 的摩尔质量2.
    2. 计算 Cp 使用公式(2):
      聚合物溶解度的统计力学方程;浓度预测公式 (2)
      何处 Cs 是标准 O2 浓度 P 是湖面处的大气压强, Pw 是湖面水蒸气的分压,以及 ω 是水的密度。
    3. 计算 Cs, ω, P,和 Pw 来自先前定义的经验方程(3-6)当湖面高程(h 公里)以及湖泊表面水温(t 在 °C已知:
      方程:ln(Cs) = 7.7117 - 1.31403×ln(t+45.93),对数转换,数据分析。 (3)
      符号形式的转动运动学方程 (4)
      自然对数压力方程;公式,对数计算,科学分析 (5)
      自然对数压力公式,\( \ln(P_w) \) 方程,热力学计算 (6)
      注意:由公式(1-6),很明显,所计算的 O2 浓度在浅层深度时最为准确。随着深度增加,计算出的浓度在绝对浓度方面的偏差会增大。当已知每个湖泊沿深度方向的氧气浓度变化率时,该方法最为理想,以便准确确定绝对O2 浓度可在必要时进行校正。一旦 O2 浓度计算出来后,其随时间的变化可用于计算两种不同的 O2 在两种不同条件下。在光照条件下,净生态系统生产力(NEP)与 O 的变化成正比2 随时间变化的浓度(见下文)。此处使用“生态系统”一词表示附生藻类由自养和异养生物组成。在黑暗条件下,O₂2 随时间变化的浓度与自养和异养生物的呼吸损失之和成正比,从而定义了生态系统呼吸(RE)。净生态系统生产力(NEP)与RE之间的差值定义为总生态系统生产力(GEP)。如果群落中异养部分的呼吸损失可忽略不计,则GEP等于总生态系统生产力。
  3. 确定 O 的变化速率2 通过三阶多项式回归分析浓度随时间的变化,如公式(7).
    氧气浓度随时间变化的多项式方程,\(O_2 = A_0 + A_1 \times time + A_2 \times time^2 + A_3 \times time^3\)。(7)
    何处 A0 是 O2 零时刻的浓度 A1-A2 是多项式回归的系数。
    注意:使用多项式函数是因为它可作为任意微分方程的近似。因此,无需知晓氧浓度与信号强度之间准确的函数关系。2 浓度和时间。因此,与函数关系(例如线性)相关的任何假设均无需加以控制。根据定义,多项式回归的第二项 A1 定义氧气变化速率2 时间零点的浓度(即瞬时速率),该值与...无关 A0 因此,绝对O2 时间零点的浓度。因此,O的估计值2 绝对O的偏置不影响通量2 由深度梯度压力变化引起的浓度计算 A1 具有单位 O2 (mmol g(OM)-1)每单位时间(本研究中为1小时)。
    1. 计算 A1,分别针对暴露于光照和未暴露于光照且含有微生物席生物量的瓶子进行计算(即 V石头 > 0)以及光照与无光照且含有游离水的对照瓶(即 V石头 = 0).
      注意:为这些不同的回归系数分配符号 光照下氧气浓度变化速率;光生物学实验图示中的公式。, 氧气符号的微分方程 dO₂/dt;动力学研究,变化速率分析, 氧气变化速率方程,dO2/dt;对照组与光照条件比较;生物学分析示意图。,以及 对照和黑暗条件下的氧气变化速率方程 \( \frac{dO_2}{dt} \)。,分别为方程(8) 用于生产率 GEP 计算可表示为:
      总初级生产力方程,GEP=NEP-RE;公式,生态生产力分析 (8.1)
      净生态系统光合作用方程 NEP;示意图;科学研究;氧气;光照测量 (8.2)
      样品中净氧气产生速率的计算公式;公式使用对照组和样品比较的 RE=(dO₂/dt)。 (8.3)
      术语 光照条件下样品与对照组的氧气变化速率方程,实验分析 定义净生态系统生产力(图5A;即净产氧量),以及该术语 耗氧率计算公式;生物化学方程式,代谢研究中的数据分析 表示自养呼吸和异养呼吸的总和(图5B;RE,即假设在黑暗和光照条件下呼吸作用相似。
    2. 从NEP中减去R得到GEP(图5C).
      注意:公式(8)隐含地假设了 光照下氧气浓度变化速率;光生物学实验图示中的公式。氧气变化速率方程,dO2/dt;对照组与光照条件比较;生物学分析示意图。 均为阳性,且 氧气符号的微分方程 dO₂/dt;动力学研究,变化速率分析对照和黑暗条件下的氧气变化速率方程 \( \frac{dO_2}{dt} \)。 均为阴性。如果 耗氧率计算公式;生物化学方程式,代谢研究中的数据分析。 为阳性时,应仔细检查原始数据中的离群值。 光照条件下样品与对照组的氧气变化速率方程,实验分析 理论上可能为负值,因为异养活动引起的呼吸损耗可能高于光合作用活性。

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结果

亮瓶与暗瓶法,NEP与RE;时间与O2关系图;NEP、RE、GEP比较图表。
图5:微生物席在日光期间的净生态系统生产力和总生态系统生产力。(A)亮瓶法测定净生态系统生产力:来自亮瓶中微生物席的净氧气生产力随时间变化的数据。在日光期间,于培养瓶中孵育1小时后测定氧气浓度的变化。灰色圆点:含有微生物席样品的瓶子。白色圆点:仅含湖水的空白瓶。(B暗瓶法测定呼吸作用来自暗瓶的自养呼吸与异养呼吸之和。在日光期间,于培养瓶中孵育1小时后测定氧气浓度的变化。灰色圆点:含有微生物席样品的瓶子。白色圆点:仅含湖水的空白瓶。(<...

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讨论

本文所述方法基于黑白瓶测氧技术,并结合使用光学氧传感器无创测定 O2 浓度的技术。该系统可通过快速移动用于测定 O2 的光纤,实现对不同培养条件的并行测量。来自不同深度的底栖群落可能在分类组成和生产力方面存在差异;通过并行方式同时测量这些群落可节省时间,并提高结果的精确性,从而能够计算出附生藻类生长的全水深剖面。集成于摇瓶中的无创氧传感器可实现对氧气通量的实时监测。

设计的实验装置能够测量微生物群落在其自然分布深度下的初级生产力,而这种条件在实验室中难以模拟(如适当的压力、昼夜温度变化过程及光照强度的变化)。 原位,不同的营养物质可利用性)。所提出方法的主要改进之处在于其非侵入性、低成本,以及能够在靠近样品采集位置的单一坐标点进行多次同步测量。该方法对环境友好,所有材料均可重复使用,且能够在无需额外支出的情况下收集大量数据。高灵敏度O的引入2 探针(即检测限为15 ppb,分辨率为0.1%或0.04 mg O)2 L-1也使得该方法的使用转向生产力较低的水...

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披露

作者确认无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由捷克科学基金会(GACR 19-05791S)、RVO 67985939 以及捷克科学院“战略 AV 21,土地保护与恢复”项目资助。衷心感谢 Ondřej Sihelský 在野外拍摄的照片——没有他,拍摄工作将极为艰难。本项目离不开与 Palivový Kombinát Ústí s.p. 和 Sokolovská Uhelná 公司的紧密合作,这两家公司为研究地点的实地考察提供了便利条件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝制角材 L 型材 40 x 40 mm x 3 mm,长度 2,000 mm
铝制扁条 40 x 3 x 350 mm
15 L 桶,内填混凝土 
带螺纹锁扣的钢丝绳扣 50 x 5 mm
黑色电工胶带
挤塑聚苯乙烯(XPS)材料 500 x 200 x 150 mm
Fibox 3 LCD tracePreSens Precision Sensing GmbH独立式光纤氧含量测定仪
Hondex PS-7 便携式测深仪Hondex  - Honda Electronics用于通过水体测量距离——测量水底深度;https://www.honda-el.net/industry/ps-7e
KORKEN - 0.5 L 玻璃密封罐IKEA培养瓶;https://www.ikea.com/cz/en/p/korken-jar-with-lid-clear-glass-70213545/
金属挂钩 
氧气传感器斑点 SP-PSt3-NAU-D5PreSens Precision Sensing GmbH用于真实条件下测量的非侵入式光学氧传感器
SCOUT 婴儿便携式独木舟GUMOTEXhttps://www.gumotexboats.com/en/scout-standard#0000-044667-021-13/11C
六角螺母螺钉 10 x 170 mm
六角螺母螺钉 4 x 15 mm
蝶形螺母螺钉 4 x 15 mm
快挂扣 50 x 5 mm
钢制快挂扣 50 x 5 mm
钢链,线径 3 mm,链节内径 5.5 x 26 mm
钢链,5 m
牙刷
镊子
垫圈 10 x 50 mm
垫圈 4 x 10 mm
垫圈 4 x 10 mm

参考文献

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