利用造血细胞因子进行肿瘤疫苗接种的实验性黑色素瘤免疫治疗模型

摘要

本方案介绍了一种利用表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤细胞进行细胞型肿瘤疫苗接种的癌症免疫治疗模型。该方案演示了包括培养肿瘤细胞的制备、肿瘤植入、细胞辐照、肿瘤生长测量、瘤内免疫细胞的分离以及流式细胞术分析在内的各项操作步骤。

摘要

Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）是一种造血细胞因子，可促进树突状细胞（DCs）的存活与分化。该因子已被用于肿瘤疫苗中，以激活先天免疫并增强抗肿瘤免疫应答。本实验方案展示了一种基于细胞的肿瘤疫苗治疗模型，该模型使用表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤细胞，并结合对肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的表型与功能分析。文中详细描述了培养肿瘤细胞的制备、肿瘤接种、细胞辐照、肿瘤体积测量、瘤内免疫细胞分离以及流式细胞术分析等操作步骤。本方案的总体目标是提供一种临床前实体瘤免疫治疗模型，以及一个用于研究肿瘤细胞与浸润性免疫细胞之间相互关系的研究平台。此处描述的免疫治疗方案可与其他治疗方式联合使用，例如免疫检查点阻断（抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1抗体）或化疗，以提高黑色素瘤的治疗效果。

引言

癌症免疫治疗因其较低的毒副作用和更持久的疗效而被认为是一种前景广阔的治疗策略。目前已开发出多种类型的免疫治疗方法，包括溶瘤病毒疗法、癌症疫苗、细胞因子疗法、单克隆抗体、过继性细胞转移（CAR-T细胞或CAR-NK细胞）以及免疫检查点阻断¹。

在癌症疫苗领域，存在多种类型的治疗性疫苗，例如全细胞疫苗、蛋白质或肽类疫苗，以及RNA或DNA疫苗。疫苗接种依赖抗原呈递细胞（APCs）处理肿瘤抗原（包括肿瘤特异性抗原）的能力，并以具有免疫原性的形式将这些抗原呈递给T细胞。树突状细胞（DCs）被认为是功能最强的抗原呈递细胞，在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用^2,3。这些细胞摄取并处理肿瘤抗原后，迁移至引流淋巴结（dLN），通过T细胞受体（TCR）与共刺激分子的相互作用，启动并激活肿瘤特异性的T效应细胞（Teff）。这导致肿瘤特异性细胞毒性T细胞（CTL）的分化与扩增，后者浸润肿瘤组织并杀伤肿瘤细胞⁴。因此，激活和促进树突状细胞的成熟是激发针对肿瘤抗原免疫应答的有吸引力的策略。

Flt3L 被证实可促进表达 MHC II 类分子、CD11c、DEC205 和 CD86 蛋白的功能成熟树突状细胞（DCs）的成熟与扩增⁵。研究表明，瘤内注射携带 Flt3L 基因的腺病毒载体（Adv-Flt3L）可诱导针对原位肿瘤的免疫治疗作用，而静脉注射则无此效果⁶。Flt3L 还被用于基于肿瘤细胞的疫苗中，例如由经逆转录病毒转导并稳定表达 Flt3L 的照射灭活 B16-F10 细胞构成的疫苗，以增强树突状细胞对肿瘤抗原的交叉提呈能力，从而提高抗肿瘤免疫应答。本文所述的 B16-Flt3L 肿瘤疫苗方案基于 James Allison 博士研究团队发表的一项研究⁷。该研究报道，B16-Flt3L 疫苗联合 CTLA-4 阻断可协同诱导已建立的黑色素瘤发生排斥反应，显著延长生存期。

本实验方案旨在提供一种用于黑色素瘤的临床前免疫治疗模型。本文详细描述了如何制备和植入肿瘤疫苗，以及如何分析实体瘤内肿瘤浸润免疫细胞的组成和功能。

方案

本研究中使用的所有小鼠均饲养于拉霍亚免疫学研究所（LJI）的动物房内，在温度和湿度受控的无特定病原体条件下进行维护。动物实验采用8至14周龄的雌性C57BL/6小鼠，实验操作严格遵循LJI动物护理委员会批准的指南和方案进行。

1. 植入前培养肿瘤细胞的制备

1. 在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、1 mM MEM非必需氨基酸以及各100 U/mL青霉素和链霉素的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中培养B16-F10黑色素瘤细胞。将细胞系维持在37 °C、5% CO₂条件下。
2. 在175T培养瓶中接种1.5–2 × 10⁶个B16-F10细胞，培养2天。当细胞融合度达到75%–80%时收集细胞。
3. 移除培养基，用PBS洗涤培养瓶一次。吸除PBS后，加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并用力敲击培养瓶边缘。
4. 加入15 mL培养基以中和胰蛋白酶-EDTA，将瓶内液体倒入50 mL离心管中。再用10 mL PBS冲洗培养瓶表面，并将冲洗液倒入同一50 mL离心管中。
5. 在200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，通过轻弹管底使细胞沉淀重新悬浮。
6. 加入10 mL预冷PBS，轻轻吹打形成细胞悬液，然后使用血细胞计数板进行人工细胞计数。注射前将细胞置于冰上保存。

2. 肿瘤移植

1. 在通风橱中，以每分钟1.0 L的气流速度使用5%异氟烷对小鼠进行气体麻醉。 当小鼠完全麻醉后，将气流速度调整至维持剂量2%异氟烷 。本方案中的麻醉操作由兽医根据机构动物护理与使用指南 执行。
2. 剃除小鼠左侧 flank 部位的毛发，并使用酒精棉片消毒注射部位。使用30 G针头在左侧 flank 皮内（i.d.）接种50 µL冷PBS中的B16-F10肿瘤细胞，细胞数量为5 x 10⁵。
   注意：为成功诱导肿瘤生长，接种的B16-F10肿瘤细胞剂量可能需要在0.5–5 x 10⁵细胞范围内进行调整。
3. 接种后，每周使用电子数显卡尺测量肿瘤长度和宽度三次。使用以下公式计算肿瘤体积（mm³）：
   肿瘤体积（mm³）= 宽度² × 长度 × 0.5
   当肿瘤大小达到≥2 mm时，开始给予小鼠肿瘤疫苗治疗。
   ​注意：接种5 x 10⁵个肿瘤细胞后，通常在第3天即可测量到肿瘤。在雄性C57BL/6、Rag1^-/-或Rag2-/-γc-/-小鼠中观察到B16-F10肿瘤生长速度更快。其他研究中也描述了类似现象⁸。建议保持小鼠性别一致。但需注意，美国国立卫生研究院（NIH）强调性别是生物医学研究中的一个重要生物学变量。

3. 表达 Flt3L 的 B16-F10（B16-Flt3L）细胞疫苗的制备与注射

1. 在含有8%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺以及各100 U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养B16-Flt3L细胞。
2. 将1 × 10⁶个B16-Flt3L细胞接种至175T培养瓶中，培养2天。当细胞融合度达到75%–80%时，按步骤1.3至1.6所述方法收集细胞，并重悬于1 mL冷PBS中。
3. 使用设定参数为160 kV和25 mA的X射线照射仪，以150 Gy剂量的γ射线对细胞进行辐照。注射前通过台盼蓝染色法计数并检测细胞活力。
4. 按前述方法对小鼠进行气体麻醉，并用酒精棉片消毒注射部位。在初始细胞接种后的第3、6、9天，于与原肿瘤植入同侧的皮下部位，距离原发肿瘤位置约1 cm处，皮内注射50 µL含1 × 10⁶个辐照处理的B16-Flt3L细胞的冷PBS溶液。
5. 用彩色记号笔标记疫苗注射位点，以便与原发肿瘤区分。
   ​注意：若初始植入0.5 × 10⁵个B16-F10细胞，建议在第8、11、14天进行疫苗治疗。

4. 肿瘤内免疫细胞的分离

1. 实验结束时（肿瘤接种后第15天；图1），在通风橱内使用CO₂吸入法结合颈椎脱位处死小鼠。
2. 手术切除每只小鼠带皮肤的肿瘤组织，放入含有1 mL 10% FBS/RPMI-1640培养基的24孔板中。用纸巾吸干肿瘤表面液体后称重。
3. 将肿瘤组织剪成小块，加入2 mL消化缓冲液（含100 µg/mL TL Liberase和200 µg/mL DNase I的RPMI-1640培养基），于37 °C孵育25分钟。
4. 加入10 mL 10% FBS/RPMI-1640培养基以终止消化反应。用25 mL移液管转移细胞悬液，并用1 mL注射器的推杆在40 µm细胞筛网上研磨组织。
5. 在4 °C条件下，以500 x g离心5分钟。将沉淀重悬于5 mL PBS中配制的40%密度梯度专用培养基（稀释至1x浓度）中。
6. 将细胞悬液缓慢加至5 mL PBS配制的80%密度梯度专用培养基上方。在室温（RT）下以低刹车设置于325 x g离心23分钟。
7. 离心后，小心收集位于40%与80%密度梯度专用培养基界面处的白细胞层，并通过40 µm细胞筛网过滤。在4 °C条件下，以500 x g离心5分钟。
8. 将沉淀物于室温下在2 mL红细胞裂解缓冲液（RBC lysis buffer）中孵育5分钟。孵育结束后，加入10 mL 10% FBS/RPMI-1640培养基以终止裂解反应。
9. 在4 °C条件下，以500 x g离心5分钟。将细胞重悬于0.5 mL 10% FBS/RPMI-1640培养基中，在用于后续分析前计数总细胞数。
   ​注意：收集脾脏或引流淋巴结（dLN）作为对照，用于流式细胞术分析中免疫细胞亚群设门策略的参考。细胞分离方法同上，但作如下调整：使用1 mL注射器推杆在70 µm细胞筛网上研磨组织。用10% FBS/RPMI-1640培养基冲洗组织以获得单细胞悬液。按上述方法进行红细胞裂解。

5. 流式细胞术分析

注意：从白细胞层收集的细胞包含免疫细胞和肿瘤细胞。建议使用两个独立的染色方案。

1. 表面染色
   1. 将细胞转移至96孔V型底板中。用PBS洗涤细胞，并加入细胞活力染料（每孔50–100 µL），室温避光孵育15分钟。
   2. 以 500 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 5 分钟。使用混合抗体对表面标志物进行染色（具体稀释比例见下文） 材料表) 在 FACS 缓冲液（1% FBS 和 0.05% NaN₃ 在冰上孵育30分钟（每孔50-100 µL PBS）。
   3. 以 500 x g 离心细胞 g 5 分钟，用 FACS 缓冲液洗涤两次。
   4. 在冰上用细胞固定缓冲液（每孔 50–100 µL）固定细胞 35 分钟。将细胞在 500 x g 5 分钟，用 FACS 缓冲液洗涤两次。
   5. 将样本置于 FACS 缓冲液中（每管 150–200 µL），于 4 °C 避光保存。使用流式细胞仪采集样本。针对树突状细胞（DCs）和 T 细胞群体，请遵循文中提供的设门策略 图2B 和 图3A.
      注意：对于髓系树突状细胞的染色，建议在表面抗体孵育（步骤 5.1.2）之前，先在冰上用 FC 阻断剂（Rat anti-mouse CD16/CD32）孵育 15 分钟。
2. 细胞因子分析 离体 再次刺激
   1. 将细胞接种于完全培养基（RPMI-1640，添加10% FBS、10 mM HEPES（pH 7.2–7.6）、0.1 mM 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠、各100 U/mL 青霉素和链霉素、50 μM 2-巯基乙醇和2 mM L-谷氨酰胺）中，在37 °C、5% CO₂条件下，加入PMA（50 ng/mL）和离子霉素（1 µM），并同时加入蛋白转运抑制剂，共同刺激4小时。₂.
   2. 按照上述第5.1步所述进行表面标志物的表面染色。
   3. 加入破膜液（50–100 µL/孔），室温孵育5分钟，用于胞内染色。将细胞与针对细胞因子或核蛋白的特异性抗体在破膜液（50–100 µL/孔）中冰上孵育60分钟，或4 °C过夜。
   4. 以 500 x g 离心细胞 g 5 分钟，用 FACS 缓冲液洗涤两次。将样品置于 4 °C 避光保存。使用流式细胞仪采集样品数据。
      注意：抗体稀释比例可能需要根据实际情况调整，以获得最佳染色效果。

结果

通常在肿瘤植入后约3天，可在皮肤表面观察到植入的B16-F10细胞形成的可见黑色斑点。当肿瘤结节大小达到≥2 mm后，分别在第3、6、9天对小鼠进行肿瘤疫苗治疗。我们观察到，接种疫苗的小鼠组在肿瘤植入后约2周时，肿瘤生长显著受到抑制。图1实验结束时，我们分离了肿瘤内的免疫细胞，分析其数量、细胞表面标志物表达以及短时间刺激后的细胞因子产生情况 体外 如上所述进行刺激。从白细胞层收集的细胞仍含有大量肿瘤细胞，使得淋巴细胞群体的界定较为困难。因此，建议平行使用脾细胞，以便在流式细胞术分析中对肿瘤内免疫细胞亚群进行准确设门。图2A）。此处，CD103的设门策略⁺CD11c⁺DC，CD8⁺，CD4⁺，Treg 的结果如图所示（图2B 和 图3A）以及补偿矩阵（表1 和

讨论

此处所述方案基于Allison研究团队的研究。他们证明，B16-Flt3L疫苗与CTLA-4阻断联合使用在提高生存率和抑制肿瘤生长方面具有协同作用，而单独使用B16-Flt3L疫苗或抗CTLA-4抗体治疗的小鼠则未见肿瘤生长的抑制⁷。近期研究揭示了一条新的Treg细胞内在的CTLA4-PKCη信号通路，在调控Treg细胞接触依赖性抑制功能中发挥关键且必需的作用¹¹。单独使用B16-Flt3L疫苗治疗，或将其与Treg细胞特异性PKCη缺失联合使用，均可显著抑制肿瘤生长，即使在植入更高数量（0.5–5 × 10⁵）的B16-F10黑色素瘤细胞（高于Allison研究中使用的1 × 10⁴个细胞）时仍有效。黑色素瘤细胞来源或小鼠品系的细微差异可能解释这一结果差异。因此，建议对植入的肿瘤细胞数量进行滴定优化。在先前的研究中也观察到原发肿瘤内CD8⁺ T细胞浸润增加的现象⁷。此外，我们还观察到肿瘤内CD103⁺CD1...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
10% 热灭活胎牛血清	Omega Scientific	FB-02	批号# 209018
30G 针头	BD Biosciences	305106
96 孔 V 型底板	SARSTEDT	83.3926.500
表达 Fms 样酪氨酸激酶 3 配体的 B16 细胞系（B16-Flt3L）	由 LJI 的 Stephen Schoenberger 博士惠赠		Flt3L cDNA 克隆至 pMG-Lyt2 逆转录病毒载体，参见参考文献 5 的补充图 1
B16-F10 细胞系	ATCC	CRL-6475
Centrifuge 5810R 离心机	Eppendorf
Cytofix 固定缓冲液	BD Biosciences	BDB554655	细胞固定缓冲液（4.2% 多聚甲醛）
Cytofix/Cytoperm 试剂盒	BD Biosciences	554714	固定/通透溶液试剂盒
DNase I	Sigma	11284932001
杜尔贝科改良伊格尔培养基 （DMEM）	Corning	10013CV
电子数显卡尺	Fisherbrand	14-648-17
FlowJo 软件	Tree Star		流式细胞仪数据分析
GolgiStop（蛋白转运抑制剂）	BD Biosciences	554724	1:1500 稀释
HEPES（1M）	Gibco	15630-080
离子霉素	Sigma	I0634
Iscove’s 改良 Dulbecco’s 培养基（IMDM）	Thermo Fisher	12440053
LSR-II 流式细胞仪	BD Biosciences		流式细胞仪
MEM 非必需氨基酸	Gibco	11140-050
青霉素和链霉素	Gibco	15140-122
Percoll	GE Healthcare Life Sciences	GE17-0891-02	密度梯度专用培养基
PMA	Sigma	P1585
红细胞裂解缓冲液 Hybri-Max 液体	Sigma	R7757-100ML
RPMI 1640 培养基	Corning	10-040-CV
RS2000 X 射线照射仪	Rad Source Technologies
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
无菌细胞筛 40 μm	Fisherbrand	22-363-547
无菌细胞筛 70 μm	Fisherbrand	22-363-548
TL Liberase	Roche	477530
Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒	BioLegend	423101
抗体
抗小鼠 CD45	BioLegend	103135	克隆号：30-F11 荧光染料：BV570 稀释比例：1:200
抗小鼠 CD3ε	BioLegend	100327	克隆号：145-2C11 荧光染料：PerCP-Cy5.5 稀释比例：1:200
抗小鼠 CD8	BioLegend	100730 100724	克隆号：53-6.7 荧光染料：Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 稀释比例：1:200
抗小鼠 CD4	BioLegend	100414	克隆号：GK1.5 荧光染料：APC-Cy7 稀释比例：1:200
抗小鼠 Foxp3	Thermo Fisher Scientific	11577382	克隆号：FJK-16s 荧光染料：FITC 稀释比例：1:100
抗小鼠/人 GzmB	BioLegend	372208	克隆号：QA16A02 荧光染料：PE 稀释比例：1:100
抗小鼠 IFNγ	BioLegend	505826	克隆号：XMG1.2 荧光染料：PE-Cy7 稀释比例：1:100
抗小鼠 CD19	BioLegend	115543	克隆号：6D5 荧光染料：BV785 稀释比例：1:100
抗小鼠 Gr1	BioLegend	108423	克隆号：RB6-8C5 荧光染料：APC/Cy7 稀释比例：1:200
抗小鼠 CD11b	BioLegend	101223	克隆号：M1/70 荧光染料：Pacific blue 稀释比例：1:100
抗小鼠 F4/80	BioLegend	123114	克隆号：BM8 荧光染料：PECy7 稀释比例：1:100
抗小鼠 CD11c	BioLegend	117328	克隆号：N418 荧光染料：PerCP Cy5.5 稀释比例：1:100
抗小鼠 MHCII	BioLegend	107622	克隆号：M5/114.15.2 荧光染料：AF700 稀释比例：1:400
抗小鼠 CD103	BioLegend	121410	克隆号：2E7 荧光染料：Alexa Fluor 647 稀释比例：1:200
抗小鼠 CD86	BioLegend	105007	克隆号：GL-1 荧光染料：PE 稀释比例：1:200
FC 阻断剂（大鼠抗小鼠 CD16/CD32）	BD Biosciences	553141	克隆号：2.4G2 稀释比例：1:200