本方案介绍了一种利用表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤细胞进行细胞型肿瘤疫苗接种的癌症免疫治疗模型。该方案演示了包括培养肿瘤细胞的制备、肿瘤植入、细胞辐照、肿瘤生长测量、瘤内免疫细胞的分离以及流式细胞术分析在内的各项操作步骤。
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摘要
摘要
Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）是一种造血细胞因子，可促进树突状细胞（DCs）的存活与分化。该因子已被用于肿瘤疫苗中，以激活先天免疫并增强抗肿瘤免疫应答。本实验方案展示了一种基于细胞的肿瘤疫苗治疗模型，该模型使用表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤细胞，并结合对肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的表型与功能分析。文中详细描述了培养肿瘤细胞的制备、肿瘤接种、细胞辐照、肿瘤体积测量、瘤内免疫细胞分离以及流式细胞术分析等操作步骤。本方案的总体目标是提供一种临床前实体瘤免疫治疗模型，以及一个用于研究肿瘤细胞与浸润性免疫细胞之间相互关系的研究平台。此处描述的免疫治疗方案可与其他治疗方式联合使用，例如免疫检查点阻断（抗CTLA-4、抗PD-1、抗PD-L1抗体）或化疗，以提高黑色素瘤的治疗效果。
引言
癌症免疫治疗因其较低的毒副作用和更持久的疗效而被认为是一种前景广阔的治疗策略。目前已开发出多种类型的免疫治疗方法，包括溶瘤病毒疗法、癌症疫苗、细胞因子疗法、单克隆抗体、过继性细胞转移（CAR-T细胞或CAR-NK细胞）以及免疫检查点阻断1。
在癌症疫苗领域，存在多种类型的治疗性疫苗，例如全细胞疫苗、蛋白质或肽类疫苗，以及RNA或DNA疫苗。疫苗接种依赖抗原呈递细胞（APCs）处理肿瘤抗原（包括肿瘤特异性抗原）的能力，并以具有免疫原性的形式将这些抗原呈递给T细胞。树突状细胞（DCs）被认为是功能最强的抗原呈递细胞，在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用2,3。这些细胞摄取并处理肿瘤抗原后，迁移至引流淋巴结（dLN），通过T细胞受体（TCR）与共刺激分子的相互作用，启动并激活肿瘤特异性的T效应细胞（Teff）。这导致肿瘤特异性细胞毒性T细胞（CTL）的分化与扩增，后者浸润肿瘤组织并杀伤肿瘤细胞4。因此，激活和促进树突状细胞的成熟是激发针对肿瘤抗原免疫应答的有吸引力的策略。
Flt3L 被证实可促进表达 MHC II 类分子、CD11c、DEC205 和 CD86 蛋白的功能成熟树突状细胞（DCs）的成熟与扩增
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方案
本研究中使用的所有小鼠均饲养于拉霍亚免疫学研究所（LJI）的动物房内，在温度和湿度受控的无特定病原体条件下进行维护。动物实验采用8至14周龄的雌性C57BL/6小鼠，实验操作严格遵循LJI动物护理委员会批准的指南和方案进行。
1. 植入前培养肿瘤细胞的制备
- 在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、1 mM MEM非必需氨基酸以及各100 U/mL青霉素和链霉素的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中培养B16-F10黑色素瘤细胞。将细胞系维持在37 °C、5% CO2条件下。
- 在175T培养瓶中接种1.5–2 × 106个B16-F10细胞，培养2天。当细胞融合度达到75%–80%时收集细胞。
- 移除培养基，用PBS洗涤培养瓶一次。吸除PBS后，加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并用力敲击培养瓶边缘。
- 加入15 mL培养基以中和胰蛋白酶-EDTA，将瓶内液体倒入50 mL离心管中。再用10 mL PBS冲洗培养瓶表面，并将冲洗液倒入同一50 mL离心管中。
- 在200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，通过轻弹管底使细胞沉淀重新悬浮。
- 加入10 mL预冷PBS，轻轻吹打形成细胞悬液，然后使用血细胞计数....
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结果
通常在肿瘤移植后约3天，可在皮肤表面观察到移植的B16-F10细胞形成的可见黑色斑点。当肿瘤结节达到≥2 mm时，分别在第3、6、9天对小鼠进行肿瘤疫苗治疗。我们在疫苗接种组小鼠中观察到，肿瘤移植约2周后肿瘤生长显著受到抑制（图1）。实验结束时，我们分离了肿瘤内免疫细胞，分析其数量、细胞表面标志物表达，以及如上所述经短期in vitro刺激后的细胞因子产生情况。从白细胞层收集的细胞仍含有大量肿瘤细胞，这使得淋巴细胞群体的界定较为困难。因此，建议同时使用脾细胞作为对照，以便在流式细胞术分析中对肿瘤内免疫细胞亚群进行准确设门（图2A）。此处展示了CD103+CD11c+DC、CD8+、CD4+和Treg的设门策略（图2B和图3A），以及补偿矩阵（表1和.......
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讨论
此处所述方案基于Allison研究团队的研究。他们证明，B16-Flt3L疫苗与CTLA-4阻断联合使用在提高生存率和抑制肿瘤生长方面具有协同作用，而单独使用B16-Flt3L疫苗或抗CTLA-4抗体治疗的小鼠则未见肿瘤生长的抑制7。近期研究揭示了一条新的Treg细胞内在的CTLA4-PKCη信号通路，在调控Treg细胞接触依赖性抑制功能中发挥关键且必需的作用11。单独使用B16-Flt3L疫苗治疗，或将其与Treg细胞特异性PKCη缺失联合使用，均可显著抑制肿瘤生长，即使在植入更高数量（0.5–5 × 105）的B16-F10黑色素瘤细胞（高于Allison研究中使用的1 × 104个细胞）时仍有效。黑色素瘤细胞来源或小鼠品系的细微差异可能解释这一结果差异。因此，建议对植入的肿瘤细胞数量进行滴定优化。在先前的研究中也观察到原发肿瘤内CD8+ T细胞浸润增加的现象7。此外，我们还观察到肿瘤内CD103+CD1.......
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
我们感谢 Stephen Schoenberger 博士提供 B16-Flt3L 细胞，以及 LJI 动物实验中心和流式细胞术实验室工作人员提供的出色支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 10% 热灭活胎牛血清 | Omega Scientific | FB-02 | 批号# 209018 |
| 30G 针头 | BD Biosciences | 305106 | |
| 96 孔 V 型底板 | SARSTEDT | 83.3926.500 | |
| 表达 Fms 样酪氨酸激酶 3 配体的 B16 细胞系（B16-Flt3L） | 由 LJI 的 Stephen Schoenberger 博士惠赠 | Flt3L cDNA 克隆至 pMG-Lyt2 逆转录病毒载体，参见参考文献 5 的补充图 1 | |
| B16-F10 细胞系 | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuge 5810R 离心机 | Eppendorf | ||
| Cytofix 固定缓冲液 | BD Biosciences | BDB554655 | 细胞固定缓冲液（4.2% 多聚甲醛） |
| Cytofix/Cytoperm 试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | 固定/通透溶液试剂盒 |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 （DMEM） | Corning | 10013CV | |
| 电子数显卡尺 | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| FlowJo 软件 | Tree Star | 流式细胞仪数据分析 | |
| GolgiStop（蛋白转运抑制剂） | BD Biosciences | 554724 | 1:1500 稀释 |
| HEPES（1M） | Gibco | 15630-080 | |
| 离子霉素 | Sigma | I0634 | |
| Iscove’s 改良 Dulbecco’s 培养基（IMDM） | Thermo Fisher | 12440053 | |
| LSR-II 流式细胞仪 | BD Biosciences | 流式细胞仪 | |
| MEM 非必需氨基酸 | Gibco | 11140-050 | |
| 青霉素和链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | GE17-0891-02 | 密度梯度专用培养基 |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| 红细胞裂解缓冲液 Hybri-Max 液体 | Sigma | R7757-100ML | |
| RPMI 1640 培养基 | Corning | 10-040-CV | |
| RS2000 X 射线照射仪 | Rad Source Technologies | ||
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360-070 | |
| 无菌细胞筛 40 μm | Fisherbrand | 22-363-547 | |
| 无菌细胞筛 70 μm | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| TL Liberase | Roche | 477530 | |
| Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒 | BioLegend | 423101 | |
| 抗体 | |||
| 抗小鼠 CD45 | BioLegend | 103135 | 克隆号：30-F11 荧光染料：BV570 稀释比例：1:200 |
| 抗小鼠 CD3ε | BioLegend | 100327 | 克隆号：145-2C11 荧光染料：PerCP-Cy5.5 稀释比例：1:200 |
| 抗小鼠 CD8 | BioLegend | 100730 100724 | 克隆号：53-6.7 荧光染料：Alexa Fluor 700, Alexa Fluor 647 稀释比例：1:200 |
| 抗小鼠 CD4 | BioLegend | 100414 | 克隆号：GK1.5 荧光染料：APC-Cy7 稀释比例：1:200 |
| 抗小鼠 Foxp3 | Thermo Fisher Scientific | 11577382 | 克隆号：FJK-16s 荧光染料：FITC 稀释比例：1:100 |
| 抗小鼠/人 GzmB | BioLegend | 372208 | 克隆号：QA16A02 荧光染料：PE 稀释比例：1:100 |
| 抗小鼠 IFNγ | BioLegend | 505826 | 克隆号：XMG1.2 荧光染料：PE-Cy7 稀释比例：1:100 |
| 抗小鼠 CD19 | BioLegend | 115543 | 克隆号：6D5 荧光染料：BV785 稀释比例：1:100 |
| 抗小鼠 Gr1 | BioLegend | 108423 | 克隆号：RB6-8C5 荧光染料：APC/Cy7 稀释比例：1:200 |
| 抗小鼠 CD11b | BioLegend | 101223 | 克隆号：M1/70 荧光染料：Pacific blue 稀释比例：1:100 |
| 抗小鼠 F4/80 | BioLegend | 123114 | 克隆号：BM8 荧光染料：PECy7 稀释比例：1:100 |
| 抗小鼠 CD11c | BioLegend | 117328 | 克隆号：N418 荧光染料：PerCP Cy5.5 稀释比例：1:100 |
| 抗小鼠 MHCII | BioLegend | 107622 | 克隆号：M5/114.15.2 荧光染料：AF700 稀释比例：1:400 |
| 抗小鼠 CD103 | BioLegend | 121410 | 克隆号：2E7 荧光染料：Alexa Fluor 647 稀释比例：1:200 |
| 抗小鼠 CD86 | BioLegend | 105007 | 克隆号：GL-1 荧光染料：PE 稀释比例：1:200 |
| FC 阻断剂（大鼠抗小鼠 CD16/CD32） | BD Biosciences | 553141 | 克隆号：2.4G2 稀释比例：1:200 |
参考文献
- Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell & Molecular Immunology. 17 (8), 807-821 (2020).
- Banchereau, J., Steinman, R. M.
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