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评估测量寿命和健康寿命的低成本方法 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/64091

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2022年5月18日

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1Leonard Davis School of Gerontology, University of Southern California

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

Caenorhabditis elegans 是一种优秀的模式生物系统，具有高效且低成本的方法，可用于评估健康寿命、寿命以及对压力的恢复力。

摘要

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式生物的发现与发展对生物学领域产生了深远影响，尤其是在衰老研究领域。许多历史性和当代研究已鉴定出数千种影响寿命的实验范式，包括基因突变、转基因表达以及应激的低剂量刺激效应（hormesis），即对压力的有益性低强度暴露。由于其具有寿命短、易于且低成本维护、基因组已完全测序且与人类近三分之二的基因具有同源性等诸多优势，C. elegans 已迅速成为研究应激与衰老生物学的杰出模型。本文综述了多种可用于测定寿命和健康寿命的标准化方法，这些方法可轻松适应几乎任何研究环境，尤其适用于设备和经费有限的实验室。文中重点展示了C. elegans的极高实用性，突出其在无需庞大基础设施的情况下即可开展强大的衰老相关遗传学分析的能力。最后，还讨论了每种分析方法的局限性及可供选择的替代方案，以供研究者参考。

引言

自《遗传学》出版以来 秀丽隐杆线虫，西德尼·布伦纳（Sydney Brenner）于1974年发表的最具影响力的论文之一，该显微线虫一直被视为研究生物学奥秘的杰出模式系统11977年，Michael R. Klass发表了测定线虫寿命的方法 秀丽隐杆线虫 并建立了该模型系统用于研究衰老2. 为理解压力与寿命之间关系而开展的研究始于单个基因突变的发现 age-1 基因，导致了寿命的延长 秀丽隐杆线虫3此外，近期研究已鉴定出其他可延长寿命的突变，这些突变揭示了寿命延长的突变型线虫表现出对压力的抗性增强4,5,6具有多种优势，包括生命周期短、易于维护、基因组已完全测序且包含约三分之二人类致病基因的同源基因、可获取且易于使用RNA干扰（RNAi）文库，以及与人类相近的生理特性7,8,9, 秀丽隐杆线虫 已迅速成为应激与衰老生物学研究的杰出模型。

或许最大的用途在于 秀丽隐杆线虫 其维护成本极低、实验操作简便，以及可用于研究的丰富遗传工具。 秀丽隐杆线虫 通常在固体琼脂培养基上培养 E. coli 食物来源。两种常用 E. coli 菌株为标准的OP50，一种B型菌株，可能是最常用的菌株10，以及HT115，一种主要用于RNAi实验的K-12菌株11,12HT115 K-12 菌株携带 RNAIII 核糖核酸酶的缺失突变，该突变对于 RNAi 方法至关重要，其中质粒表达与特定基因对应的 dsRNA 秀丽隐杆线虫 基因被使用。dsRNA 饲喂载体可实现高效的基因敲低 秀丽隐杆线虫 无需复杂的杂交或基因组编辑即可研究基因功能，因为携带这些质粒的细菌可直接饲喂线虫。在HT115背景下已存在数千种此类细菌RNAi载体，包括最常用的Vidal RNAi文库，其包含 >19,000 个独立的RNAi构建体13 以及包含16,757个RNAi构建体的Ahringer RNAi文库14然而，OP50 和 HT115 细菌食物在代谢谱上存在显著差异，包括维生素 B12 的差异15,16因此，建议尽可能使用单一细菌来源进行所有实验，以避免基因-饮食相互作用可能引入的多种混杂因素，正如前文所述。17,18,19由于操作简便，所有实验条件下均使用OP50进行动物培养，但所有实验均如前所述在HT115上进行20简而言之，为保持RNAi与非RNAi实验之间的一致性，动物在OP50上培养，并在同步化后（漂白后）转移至HT115。 alternatively，可使用一种具有RNAi能力的OP50菌株，该菌株携带与HT115中相同的RNAIII核糖核酸酶缺失。 E. coli K12 HT115 菌株也可使用21.

RNAi实验的一个主要局限性可能是 秀丽隐杆线虫 是关于敲低效率的问题。虽然敲低效率可以通过验证 通过 qPCR 或蛋白质印迹法需要昂贵的仪器和试剂，且仅限于整体分析。对于特定细胞（如神经元）而言，这一问题尤为突出，因为这类细胞对 RNA 干扰（RNAi）具有抗性（敏感性较低）。尽管可通过某些方法提高 RNAi 在特定细胞中的效率 通过 过表达SID-1（一种介导双链RNA摄取的关键跨膜蛋白）22，这仍然受限于这些构建体所用启动子的细胞类型特异性表达模式，因此基因敲除和基因突变是耗竭基因功能最可靠的方法。除了RNAi介导的基因敲低之外， 秀丽隐杆线虫 也高度适用于基于CRISPR的基因组编辑策略23,24,25 通过显微注射实现转基因构建体的过表达，并可选择通过辐照或基于转座子的整合方法将转基因构建体整合到基因组中26,27,28,29然而，这些方法需要昂贵的显微注射设备，且向导RNA或Cas9酶的高成本可能使资金有限的机构难以采用这些技术。相比之下，在秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）和国家生物资源项目（National Bioresource Project，NBRP），仅需数美元即可轻松获得数千种转基因品系和突变体。NBRP提供了大量基因的分离突变体 秀丽隐杆线虫 基因，包括已发表且经过验证的突变株、来自初步研究项目的突变体，以及尚未完成表征的突变体。相比之下，CGC 主要保藏已发表并确立的 秀丽隐杆线虫 来自科研社区的菌株。两者均以非常合理的价格向全球运送菌株，并为那些在本单位合成菌株能力有限的研究者提供多种选择。

本文提供了一套精选的方法集合，这些方法可能是测定C. elegans寿命与健康寿命的最低成本方案。所介绍的所有方法均仅需低成本设备与耗材，并且仅使用可从秀丽线虫遗传中心（CGC） readily 获得的品系。在C. elegans中进行寿命与生存率测定的最大限制因素可能是线虫生长培养基（NGM）平板的成本。由于C. elegans为雌雄同体并能自体受精，标准的生存率测定要求持续将成虫从其后代中移开，以避免子代污染。这一过程不仅耗时，而且由于每组条件通常需要约100个平板才能完成一次寿命测定，成本可能显著上升。本文提供了两种替代方案：使用温度敏感型生殖系缺失突变体glp-4(bn2)，或使用5-氟-2'-脱氧尿苷（FUDR）进行化学性生殖抑制。glp-4编码缬氨酰-tRNA合成酶，温度敏感型glp-4(bn2)突变体在限制性温度下因蛋白质翻译水平降低而丧失生殖能力30,31。FUDR是一种通过抑制DNA复制从而阻断C. elegans繁殖的高效化学性绝育方法32。尽管FUDR对部分实验室而言可能价格较高，但其用量极小即可实现线虫的化学性绝育，且其粉末形式具有良好的稳定性，因此大多数研究团队仍可负担。使用温度敏感型glp-4(bn2)突变体无疑是成本最低的选择，仅需一个可调节至25 °C的恒温培养箱即可实现生殖抑制；但需注意，在25 °C下培养可能引起轻微的热应激33,34。无论采用何种方法，使用无生殖能力的线虫均可显著降低与衰老相关实验所需的耗材成本。

研究衰老时，标准的寿命测定是常规方法，因为影响寿命的范式会直接作用于衰老过程。然而，健康寿命和应激耐受能力的测量可提供有关生物体健康状况的额外信息。本文提供了几种测量健康寿命的方法：1）以生殖能力作为生殖健康的指标；2）以子代产仔数作为发育健康及所产后代存活能力的指标；3）以运动行为作为肌肉功能和活动能力的指标，这两者均与衰老直接相关。此外，本文还提供了应激耐受性的测定方法：内质网应激存活率、线粒体/氧化应激存活率以及热应激存活率。事实上，对内质网应激35,36、线粒体应激37和热应激38具有更强抵抗能力的动物通常表现出更长的寿命。通过将C. elegans暴露于衣霉素（tunicamycin）来诱导内质网应激，该药物可阻断N-连接糖基化，导致错误折叠蛋白的积累39。线粒体/氧化应激则通过百草枯（paraquat）处理诱导，该化合物可特异性在线粒体中引发超氧阴离子的生成40。热应激通过将动物置于34–37 °C条件下孵育实现33,41。本文所述所有测定方法均可在设备和资金投入最少的情况下完成，为不同研究团队提供了多种研究衰老的工具。

方案

1. 线虫（C. elegans）的培养与维持

  1. 倾倒线虫生长培养基（NGM）平板
    1. 培养 秀丽隐杆线虫 在含有1 mM CaCl₂的标准2%琼脂平板上，使用线虫生长培养基（NGM）2, 5 µg/mL 胆固醇，25 mM KPO4 （pH 6.0），1 mM MgSO₄4，0.25% w/v 蛋白胨，以及 51.3 mM NaCl。
    2. 对于1 L NGM-琼脂平板，称取2.5 g蛋白胨、3.0 g NaCl和20 g琼脂，加入含搅拌子的1 L烧瓶中。
      注意：建议固定使用特定来源的琼脂，因为不同品牌的琼脂在硬度上可能存在差异，这可能影响实验的可重复性。本文中严格使用Bacto-Agar。此外，建议将琼脂直接加入将要进行高压灭菌的烧瓶中，因为琼脂在未加热的情况下无法完全溶解，而转移含有琼脂的溶液会导致琼脂损失和浓度误差。
    3. 加入去离子水2O 至多 970 mL。
      注意：灭菌后加入 30 mL 液体添加剂可使最终体积达到 1 L。据我们实验，约 951 mL 去离子水2O 将需要达到最终体积 970 mL。
    4. 使用标准高压灭菌器或培养基灭菌器对NGM-琼脂溶液进行灭菌，以实现高效灭菌。
      注意：此时，无菌NGM-琼脂可在室温下保存数月。如需储存，可通过微波加热（每次15–45秒脉冲）重新液化NGM-琼脂，以防止溶液沸腾溢出，也可使用加热的水浴进行液化。
    5. 让溶液搅拌至冷却至60-75 °C. 冷却过程中搅拌至关重要，可防止冷却不均，避免部分琼脂凝固。
    6. 当溶液冷却时，将水浴或金属珠浴加热至 65-70 °C.
    7. 待溶液冷却至60–75℃时 °C，加入液体添加剂：2.0 mL 0.5 M CaCl2，1 mL 5 mg/mL 胆固醇，25 mL 1 M KPO4 （pH 6.0）和 0.5 M MgSO₄4 （参见 表1 配制所有试剂的配方），并让溶液混合约 5 分钟以确保充分混匀。
      注意：此处也可在平板中加入药物（例如，加入1 mL 100 mg/mL羧苄青霉素和1 mL 1 M IPTG；加入10 mL 2.5 mg/mL衣霉素；加入10 mL 400 mM百草枯）。
    8. 将含有 NGM-琼脂的烧瓶浸入 65–70 ℃ 水浴中 °C 水浴中，以防止在倒入培养皿时 NGM-琼脂凝固。
    9. 将9-11 mL溶液加入每个60 mm培养皿，或将20-30 mL溶液加入每个100 mm培养皿。
      注意：建议使用最小量程的移液器，以避免因移液器内空气膨胀导致NGM渗漏。移取比每块平板所需量多1-2 mL的培养基，避免将移液器完全排空，有助于防止气泡形成。 Alternatively，也可直接从瓶中手工倾注培养基至平板，但强烈推荐使用移液操作，以确保各平板间培养基体积相等。体积一致的平板对于采用将溶液直接加在平板表面的方法时（见步骤1.1.17）保持溶液浓度一致至关重要。此外，相同体积也有利于显微观察时在不同平板间维持相似的焦平面。
    10. 将移液器放回加热溶液中以维持温度，并防止NGM-琼脂凝固。
    11. 对所有培养板重复上述两个步骤。
    12. 让NGM-琼脂平板静置过夜使其凝固。
    13. 平板凝固后，可在 4℃ 保存长达 3 个月 °C 或进入步骤 1.1.14 以细菌接种平板。将平板储存于密封容器中，以帮助保持湿度，维持平板质量。
    14. 在室温（约22–25℃）下，将OP50菌株接种于LB（Lysogeny broth）或同等适宜培养基中，培养24–48小时 °C) 或在 LB 培养基中加入抗生素（建议 HT115 使用氨苄青霉素/羧苄青霉素和四环素）并置于 37 °C 摇床中培养 HT115 菌液 °C，12-16 小时。
      注意：建议在室温下培养OP50，因为在37℃条件下OP50的生长更为旺盛。 °C，其影响 秀丽隐杆线虫 寿命。相比之下，HT115 生长速率较慢，形成的菌液密度较低；因此建议在 37 ℃ 下培养 HT115 °C，同时振荡。
    15. 接种 100–200 微升体积的样品 µ60 mm 培养皿中加入 L 量的饱和 OP50/HT115 培养物，或 100 mm 培养皿中加入 1 mL。
    16. 让培养板在实验台上过夜晾干，若培养板仍然潮湿，则额外再干燥一天。将培养板储存于密封容器中，置于 4 °C 下培养约 2 个月。
    17. 可选：将药物直接加入已接种的 NGM-琼脂平板中（例如，100 µ10 mg/mL 氟脱氧尿苷（FUDR）溶液的 L）以化学方法使线虫无菌。
  2. 维持 秀丽隐杆线虫 品系
    1. 正确标记已接种的NGM-琼脂平板底部。在平板底部的边缘处做标记，以避免遮挡标准解剖显微镜下的光线通路。
    2. 使用标准解剖显微镜，挑取所需细菌 秀丽隐杆线虫 挑取
      注意：本实验方案中使用的接种针由连接在玻璃巴斯德移液管末端的90%/10%铂/铱合金丝制成。
    3. 使用细菌收集10-20个卵、L1、L2或L3期动物，并转移至新标记的接种NGM-琼脂平板上。
      注意：最好收集较年轻的动物；根据作者的经验，对于标准的野生型动物，转移10–20个卵或幼年个体可使培养板在15℃下正常生长 °C，且不使其饥饿。对于繁殖力降低的转基因或突变型线虫，应向平板中转移更多个体。
    4. 对于具有野生型繁殖力且在15℃下培养的动物 °C，每隔7天重复步骤1.2.1–1.2.3，以维持每周的种群传代。对于在20℃下培养的动物 °C，每隔4-5天重复步骤1.2.1-1.2.3，以防止饥饿。
  3. 同步蠕虫 通过 漂白
    注意：一个完整的60 mm NGM-琼脂平板（例如，在15 °C下培养1周的储备平板） °C）将为所述的大多数标准检测提供足够数量的动物。通常，一只产卵期成虫（充满卵的成虫）可提供10–15个卵42，一个完整的60 mm NGM-琼脂平板含有100–200条产卵成虫，可提供约1000–2000个卵。
    1. 对于需要更多线虫的大规模实验，将一整块60 mm NGM-琼脂切成四至六等份，并转移至接种过的100 mm培养皿中进行扩增。
      注意：此处的“切块转移”（chunking）是指切割含有线虫的NGM-琼脂平板片段，将整块含线虫的琼脂转移至新平板上，线虫面朝下放置，以便线虫爬行至新平板。作为参考，若在20 °C条件下培养，具有野生型繁殖力的线虫可在一个100 mm平板上长满全板 °在分割后于 C 条件下培养 2-3 天。
    2. 开始收集线虫时，倒入少量M9溶液（表1) 加入含有线虫的平板中，注意不要加满培养皿。轻轻摇晃M9溶液，使线虫从细菌菌苔上脱落。
    3. 用移液管收集带有卵的成虫线虫，注意不要用移液管尖刺破琼脂。
      注意：建议使用玻璃血清移液管，因为 秀丽隐杆线虫 tends to adhere to plastic. 若无玻璃移液管，建议起始使用的线虫数量多于实际所需，因为部分线虫会因黏附于塑料移液管而损失。
    4. 通过离心以 1,100 x g 的速度离心 30 秒，使线虫沉淀 g吸走上清液。
      注意： C. elegans 沉淀非常松散，因此在吸除上清液时需小心，避免振荡或破坏沉淀。
    5. 在动物离心的同时，为每种品系准备 5 mL 漂白液（参见 表1 配方详情参见相关说明）；配制 5 mL 溶液，需混合 1.5 mL 6% 次氯酸钠（漂白剂）、0.75 mL 5 M NaOH 或 KOH 以及 2.75 mL dH₂O2O.
      警告：次氯酸钠和高浓度氢氧化物溶液具有腐蚀性，操作时建议佩戴手套和实验服。
    6. 向线虫沉淀/M9 混合物中加入 5 mL 漂白液。
    7. 每隔几分钟在解剖显微镜下检查一次线虫，直到所有成虫虫体均被溶解，混合液中仅剩卵为止。剧烈振荡线虫/漂白剂混合液以加快漂白过程。
      注意：将卵留在漂白剂混合液中过长时间会损伤卵，影响动物的存活率。对于野生型动物，漂白通常需要4-6分钟并伴随振荡。因此，建议从第4分钟开始，每隔30秒在显微镜下检查动物。
    8. 将卵/次氯酸钠混合液在1,100 x g下离心30秒，使卵沉淀 g.
      注意：某些15 mL圆锥形离心管的管内壁带有刻度梯度线。对于此类离心管，建议以较高速度离心卵子（例如，2,000 x g条件下离心30秒）。 g以确保卵子沉淀至管底，而不会停留在梯度线上。
    9. 吸出漂白液。
      注意：卵团块比虫体团块更硬，但仍容易被破坏。因此，离心后请勿摇晃离心管。
    10. 加入M9溶液至15 mL，将离心管颠倒4到5次，使卵充分分散于M9溶液中。
    11. 离心30秒（1,100 x g）以收集卵块 g 并吸出 M9 溶液。
    12. 重复上述两个步骤，共进行四次洗涤，以彻底清除卵混合物中的次氯酸钠。
    13. 将卵重悬于 100 µ最后一次洗涤后，加入 1 至 2 mL M9 溶液（具体体积取决于漂白的线虫总数）。充分振荡卵液以打散团块，并确保沉淀物完全重悬。
    14. 或者，可将动物进行L1期 Arrest 以实现更精确的时间同步；进行L1期 Arrest 时，向卵团中加入M9溶液至约10 mL，置于15 mL锥形管中。将线虫在20℃旋转器上旋转孵育最多24 h。 °C 或环境温度。L1 期动物通常比第 1.3.16 步中描述的卵发育至成虫所需时间少约半天。
    15. 通过移液约4 µ将 L 的卵/M9 混合物加到接种了细菌的 NGM 平板上。计数并计算每单位中存在的卵数 µL 型平板接种。重复计数三到四次以提高估算准确性。
      注意：估算卵的浓度可确保接种足够数量的动物以满足实验所需的适当样本量，同时避免过度接种导致饥饿。
    16. 根据估算，将适量的卵接种到接种了所选细菌的NGM-琼脂平板上。对于OP50平板，每个60 mm平板接种最多200只动物，每个100 mm平板接种最多1,000只动物。对于HT115平板，每个60 mm平板接种最多150只动物，每个100 mm平板接种最多600只动物。
      注意：这些数值是基于本实验室条件的估算值，具体数值可能因细菌菌苔厚度不同而有所变化。在15℃下培养的卵 °C 约需 5 天达到第 1 天成虫期（约 140 小时达到产卵高峰的成熟成虫阶段）。在 20 ℃ 下培养的卵 °C 品系约需 4 天达到第 1 天成虫期（约 96 小时达到产卵高峰的成熟成虫阶段）。在 25 ℃ 下培养的卵 °C 约需 3.5 天达到第 1 天成虫期（约 62 小时达到产卵高峰期的成熟成虫阶段）。
  4. 产卵作为同步化的替代方法 秀丽隐杆线虫 群体
    1. 如果无法进行漂白处理（例如，没有可用的离心机），可采用以下替代方法对种群进行同步化 秀丽隐杆线虫，进行产卵操作。请注意，该方案劳动强度较大，且获得的动物数量较少。
    2. 对于产卵，将8-12只性成熟的成虫置于接种有选定细菌的标准NGM琼脂平板上，并记录放置到平板上的动物确切数量。
      注意：产卵操作应在实验所用温度下进行。
    3. 让动物产卵4-8小时。
      注意：可根据需要调整动物在培养皿中的停留时间。例如，当可用时间较短时，可将较大量的动物放入培养皿中以缩短产卵时间。 秀丽隐杆线虫 通常以成簇方式产卵，产卵速率可估计为野生型繁殖力个体每小时约五个卵43. 按照步骤1.3.16中的建议操作，避免动物接种过量。
    4. 移除平板上的所有成年个体。
      ​注意：任何留在培养皿中的成年线虫将继续产卵，导致种群不同步。
    5. 将卵置于15 °C 培养约 5 天或 20 °在约 4 天内发育至成年第 1 天。

2. 测定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的寿命

  1. 标准寿命测定
    1. 通过在培养皿中接种100 µL选定的细菌来制备NGM-琼脂平板。为保证一致性，所有重复实验应使用相同的细菌。由于线虫在成虫产卵阶段每天需转移一次，因此需为整个寿命实验期间准备5至7组NGM-琼脂平板，每种品系还需准备2至4个平板用于培养至成虫阶段（例如，若寿命实验使用8个平板，每个平板15只线虫，则每种条件下需准备40–56个平板）。
    2. 平板在室温下过夜干燥后储存。
      注：建议将平板储存在4 °C，每天从冷藏中取出所需数量的平板，以防止细菌形成过厚的菌苔，从而影响线虫的转移和寿命计数。确保在接种线虫前将平板恢复至室温。
    3. 使用标准的次氯酸钠漂白法（如步骤1.3和1.4所述）获得同步化的秀丽隐杆线虫（C. elegans）群体。
    4. 将10–15只第1天成虫分别转移到8–12个平板上。进行标准寿命测定时，起始数量约为120只，以确保在剔除事件后样本量不会远低于100只（例如，8个平板×15只 = 120只；12个平板×10只 = 120只）。
      注：目前情况下，每个平板10–15只线虫对大多数研究者而言是可管理的数量，尽管使用6个平板、每个平板20只线虫也可行，以降低耗材成本。
    5. 在前7–8天或直到不再观察到子代为止，每隔1–2天将成虫从其子代中移出。
      注：为节省材料，可每隔一天转移一次线虫，但需注意避免将卵或幼虫随成虫一同转移，以防子代污染成虫群体。本研究中，最简单的方法是在产卵高峰期的第1–3天每天转移一次，之后在产卵量最低的第5–8天改为每隔一天转移一次。采用此方法时，在第1–3天即使有卵或幼虫被转移也无妨，因为成虫每天都会被转移，而卵或幼虫无法在1天内发育至成虫阶段。
    6. 当线虫停止产生子代后，每隔一天记录一次寿命，直至所有线虫均被判定为死亡或剔除。将所有死亡或剔除的线虫从平板上移除，以避免混淆和重复计数。
      注：死亡判定标准为用挑针轻轻触碰后无任何运动反应的线虫。剔除标准包括“袋状死亡”（bagged）、出现外阴或肠道突出，或爬至平板边缘干燥致死的个体。
  2. 使用氟脱氧尿苷（FUDR）进行化学绝育的寿命测定
    1. 通过在培养皿中接种100 µL选定的细菌来制备NGM-琼脂平板。为保证一致性，所有重复实验应使用相同的细菌。每种品系准备8–12个用于寿命实验的平板，另准备2–4个平板用于培养至成虫阶段。平板在室温下过夜干燥。
    2. 向用于寿命测定的8–12个平板的菌苔中央各加入100 µL浓度为10 mg/mL的FUDR。注意保留2–4个不含FUDR的平板作为起始培养平板，以便线虫正常发育至成虫。平板再次过夜干燥。
      注意：FUDR可抑制DNA合成，因此操作时建议佩戴手套。
    3. 使用标准的次氯酸钠漂白法（如步骤1.3和1.4所述）获得同步化的C. elegans群体。
      注：这些线虫必须在不含FUDR的平板上培养，因为FUDR会导致线虫发育停滞或死亡。
    4. 将10–15只第1天成虫分别转移到含FUDR的8–12个平板上。进行标准寿命测定时，起始数量约为120只，以确保在剔除事件后样本量不会远低于100只（例如，8个平板×15只 = 120只；12个平板×10只 = 120只）。
      注：若必须完全避免子代产生，也可在L4阶段将线虫转移至含FUDR的平板，但不可过早转移，否则会增加外阴或肠道突出的风险，导致剔除率上升。
    5. 每隔一天记录一次寿命，直至所有线虫均被判定为死亡或剔除。将所有死亡或剔除的线虫从平板上移除，以避免混淆和重复计数。
      注：对于使用FUDR的寿命实验，所有子代均可忽略，因其将在L1阶段停滞并最终死亡。
  3. 使用温度敏感型不育突变体进行寿命测定
    1. 通过在培养皿中接种100 µL选定的细菌来制备NGM-琼脂平板。为保证一致性，所有重复实验应使用相同的细菌。每种品系准备8–12个用于寿命实验的平板，另准备2–4个平板用于培养至成虫阶段。平板在室温下过夜干燥。
    2. 使用标准的次氯酸钠漂白法（如步骤1.3和1.4所述）获得同步化的C. elegans群体。注意将线虫在限制性温度25 °C下培养，以确保其不育。
    3. 将10–15只第1天成虫分别转移到8–12个平板上。进行标准寿命测定时，起始数量约为120只，以确保在剔除事件后样本量不会远低于100只（例如，8个平板×15只 = 120只；12个平板×10只 = 120只）。
    4. 每隔一天记录一次寿命，直至所有线虫均被判定为死亡或剔除。将所有死亡或剔除的线虫从平板上移除，以避免混淆和重复计数。
      ​注：对于寿命较短的品系，建议每天记录一次寿命，因为在25 °C下寿命显著缩短，动态范围有限。根据作者经验，若更倾向于在20 °C下进行寿命记录，可在第2天后将线虫转移回20 °C，此时线虫仍可保持不育状态。

3. 测量健康寿命 秀丽隐杆线虫

  1. 运动行为的测量 通过 摆动
    1. 收集同步化的种群 秀丽隐杆线虫 使用标准的漂白实验方法，如步骤1.3和1.4所述。
    2. 在解剖显微镜下，将一小团第1天成虫期的线虫转移至NGM-琼脂平板上，数量为10–20条 µM9 溶液的体积为 L。建议计数 10–15 只动物，以便于操作。
    3. 一次只观察一条线虫，记录其在15秒内从凹形变为凸形的次数。使用手持计数器和计时器，以便在整个检测过程中保持对线虫的专注。
      注意：可对培养皿进行录像，以便更全面或更便捷地分析。例如，大多数智能手机和数码相机均可使用标准的显微镜目镜附件（15-30美元），此类附件是低成本录制剧烈运动视频的优选方案。
    4. 对液体中的其他线虫重复步骤 3.1.3，计算 10–15 条线虫的平均总运动能力。若需增加样本量，重复步骤 3.1.2–3.1.4。
    5. 将线虫培养至目标年龄。可采用步骤2.1-2.3中所述寿命测定的类似方法进行线虫的衰老处理。重复步骤3.1.2-3.1.4，以在目标年龄检测线虫的摆动行为。
      注意：步骤 3.1.2 的一种替代方法是加入约 30 µ将1升或更多的M9溶液加入培养皿中的一组线虫上。这种方法可节省手动转移线虫的时间，但由于线虫在培养皿中的位置具有随机性，无法保证一组线虫会保持在培养皿的同一位置。
  2. 繁殖力（产卵数）的测量 秀丽隐杆线虫
    1. 收集同步化的种群 秀丽隐杆线虫 使用标准的漂白实验，如步骤1.3和1.4所述。卵数检测从L4阶段开始，该阶段约为成虫第1天前约1天（在15 °C下约为第3天） °C 或约 20 摄氏度下 2 天 °C 在 L1 期阻滞之后）
    2. 将L4期线虫单独挑至已接种所选细菌的NGM-琼脂平板上。建议每份繁殖力测定使用约10–15只线虫。
      注意：建议将所选细菌稀释50%（即非饱和培养物），以提高细菌菌苔中虫卵的可见度。
    3. 让动物在20℃下过夜生长 °C. 确保新接种的一批平板已准备好供第二天使用。
    4. 在成虫期第1天，将成虫线虫转移至铺有稀释后所选细菌的新鲜NGM琼脂平板上。
      注意：建议使用新接种的平板，或在 4 ℃ 条件下储存平板 °C 保存以防止细菌菌苔过厚。
    5. 统计每个NGM-琼脂平板上产下的卵的总数。
      注意：为了便于扫描平板，可在平板盖上绘制网格，并将其置于用于计数卵的平板下方。随后可沿网格线扫描平板，以便在移动平板时保持方向，防止重复计数任何卵。
    6. 重复步骤 3.2.4–3.2.5，持续 7–8 天，或直至平板上不再可见卵。
      注意：在产卵率较高的第1至3天，建议每12小时转移线虫一次，并每天进行两次卵数检测。然而，这会增加工作量和耗材成本，因此也可将转移线虫和检测次数限制为每天一次，但必须注意确保所有卵及已孵化的线虫均被准确计数。在此实验中，任何已孵化的线虫均按卵计数。
  3. 子代数量（发育）的测定 秀丽隐杆线虫 后代
    1. 收集同步化的种群 秀丽隐杆线虫 使用标准的漂白实验，如步骤1.3和1.4所述。子代数量测定从L4阶段开始，该阶段约为成虫第1天前约1天（在15 °C下约为第3天） °C 或约 20 摄氏度下 2 天 °C 在 L1 期阻滞之后）
    2. 将L4期线虫单独挑至已接种所选细菌的NGM-琼脂平板上。建议每组用于繁殖力测定的线虫数量约为10–15条。
    3. 让动物在20℃下过夜生长 °C. 确保新接种的一批平板已准备好供第二天使用。
    4. 在成虫期第1天，将成虫线虫转移至新制的、铺有选定细菌的NGM琼脂平板上。
    5. 每12-24小时（每天2次或1次），将成虫线虫转移至新铺有选定细菌的NGM-agar平板上，持续7-8天，或直至不再观察到子代。所有含卵的平板均置于20℃培养 °C.
    6. 重复步骤 3.3.5，持续 7–8 天，或直至不再观察到子代。将所有含有卵的培养板保持在 20 °C.
      注意：子代培养板也可在15℃下保存 °C 以延长其在需要评分之前的时间。
    7. 在转移线虫两天后，统计培养板上发育的子代数量。统计处于L4阶段的发育中线虫（即在20℃条件下孵化后2天） °C）或更早阶段进行，以确保F2代（即子代的子代）不会干扰实验结果。统计所有存活的线虫。
      1. 将所有线虫从培养皿中移除并计数。在再次评分前，将培养皿继续培养额外1-2天，以确保不会遗漏任何孵化或发育延迟的个体。
    8. 对收集的每一块产卵板重复步骤 3.3.7。
      ​注意：可通过将子代数量检测与卵数检测（步骤3.2）结合进行，从而在一次实验中获取两组数据，减少人力和耗材成本。这种方法还可实现同一批线虫子代数量与产卵数的直接比较。

4. 测定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的应激恢复力

  1. 使用衣霉素测量内质网应激敏感性
    1. 通过在含有衣霉素的平板上接种100 µL选定细菌来制备NGM-琼脂平板（参见步骤1.1.7，注意）。
      注意：操作衣霉素时应佩戴手套。
    2. 为保证一致性，确保所有重复实验使用相同的细菌。每种品系准备8–12个含衣霉素的平板用于生存分析，每种品系另准备2–4个不含衣霉素的平板用于培养动物至成年。让平板过夜干燥。
    3. 使用步骤1.3和1.4中所述的标准漂白法收集同步化的 C. elegans 种群。
      注意：动物必须在不含衣霉素的平板上培养至成年第一天，因为动物在含衣霉素的平板上会停滞发育或死亡。
    4. 将10–15只成年第一天的动物分别转移到8–12个平板上。对于标准生存分析，起始数量约为120只动物，以确保在剔除事件（如死亡或逃逸）后样本量不会远低于100只（例如，8个平板，每个15只动物 = 120只动物；12个平板，每个10只动物 = 120只动物）。
      注意：与FUDR实验类似，由于衣霉素会导致L1期幼虫死亡或停滞，因此可在不转移动物的情况下进行衣霉素生存分析。然而，在使用DMSO作为对照时，子代会在DMSO平板上发育，因此需要每天转移成虫，或采用灭菌技术（可使用第2节中用于寿命实验的相同方法进行生存分析）。
    5. 生存分析的评分方法与寿命测定类似。将所有死亡或被剔除的动物从平板上移除，以避免混淆和重复计数。
      注意：尽管可以每隔一天评分一次，但由于动物在衣霉素平板上死亡迅速，建议每日进行生存分析评分。
  2. 使用百草枯测量线粒体/氧化应激敏感性
    1. 通过在含有百草枯的平板上接种100 µL选定细菌来制备NGM-琼脂平板（参见步骤1.1.7；注意）。
      注意：操作百草枯时应佩戴手套，因其具有环境危害性。请咨询所在机构的环境健康与安全部门关于废弃物处理的要求，因为许多研究机构对环境危害物的丢弃有特定规定。
    2. 为保证一致性，确保所有重复实验使用相同的细菌。每种品系准备8–12个平板用于生存分析，每种品系另准备2–4个不含百草枯的平板用于培养动物至成年。让平板过夜干燥。
    3. 使用步骤1.3和1.4中所述的标准漂白法收集同步化的 C. elegans 种群。
      注意：请记住，动物必须在不含百草枯的平板上培养至成年第一天；然而，由于部分动物可在含百草枯的平板上发育至成年，因此有必要采用灭菌技术或将成虫与子代分离（参见步骤2.2–2.3）。
    4. 将10–15只成年第一天的动物分别转移到8–12个平板上。对于标准生存分析，起始数量约为120只动物，以确保在剔除事件后样本量不会远低于100只（例如，8个平板，每个15只动物 = 120只动物；12个平板，每个10只动物 = 120只动物）。
    5. 生存分析的评分方法与寿命测定类似。将所有死亡或被剔除的动物从平板上移除，以避免混淆和重复计数。
      注意：尽管可以每隔一天评分一次，但由于动物在百草枯平板上死亡迅速，建议每日进行生存分析评分。当使用在25 °C下培养的 glp-4(bn2) 动物时尤其如此，因为其死亡速度极快。
  3. 通过升高温度测量热应激敏感性（耐热性）
    1. 使用步骤1.3和1.4中所述的标准漂白法收集同步化的 C. elegans 种群。
    2. 在将动物转移至平板前，将NGM-琼脂平板置于37 °C培养箱中至少1小时，使其预热至37 °C。
    3. 将10–15只成年第一天的动物分别转移到4–6个预热的平板上。对于标准耐热性实验，起始数量约为60只动物（例如，4个平板，每个15只动物 = 60只动物；6个平板，每个10只动物 = 60只动物）。
    4. 将动物放入37 °C培养箱，并每2小时记录一次死亡情况。死亡定义为用挑针轻轻触碰后无任何运动反应的动物。将所有死亡或被剔除的动物从平板上移除，以避免混淆和重复计数。
    5. 确保平板从37 °C培养箱中取出的时间尽可能短，因为在评分过程中若平板长时间处于室温下，会影响耐热性实验结果。
      注意：建议每次仅取出一个品系进行评分，因为在一个品系的评分时间内，琼脂温度不应发生显著变化。
    6. 通常在7–9小时内达到中位耐热时间；因此，应在7小时、9小时和11小时进行准确的检测。
      注意：虽然可以跳过1–5小时的时间点，但由于各实验室培养箱的差异、平板厚度及其他混杂因素，若计划跳过某些时间点，必须在每个实验室中仔细优化时间安排。详见参考文献44中关于耐热性实验的完整指南。
    7. 或者，可将耐热性实验在34 °C而非37 °C下进行。
      注意：在34 °C下的中位耐热时间出现得更晚（本研究中为10–14小时），这允许在深夜准备实验（放入34 °C培养箱），并在次日清晨开始评分。这种方法可实现约8小时的持续评分，而无需像37 °C耐热性实验那样通常需要12小时。

结果

秀丽隐杆线虫 是衰老研究的优秀模式生物，因为大多数衰老机制在人类和该生物之间是保守的。尤为重要的是，其维护和实验成本极低，对仪器和耗材的需求极少，使其成为资金有限机构所青睐的模型系统。此外，大量操作简便、学习门槛低的检测方法使其成为即使是最年轻的、缺乏或几乎没有经验的研究者也能轻松上手的理想系统。结合其强大的遗传学工具， 秀丽隐杆线虫 包括基因组编辑的便捷性、数千种可获得的突变体和转基因动物且成本低廉，以及可用于几乎每个基因遗传敲降的RNAi文库，使其成为本科院校的理想研究系统。本文介绍了一些研究衰老的最低成本方法 秀丽隐杆线虫 进行调查，主要关注那些所需设备和耗材成本较低、且学习曲线较平缓的检测方法。事实上，全部实验方案的撰写与数据收集均由初级研究人员完成 <5 个月的研究经验，主要为本科生。

由于 C. elegans 的寿命较短，通常为 14–20 天，因此对其开展的长寿研究非常简便。重要的是，寿命测定实验已高度标准化，仅需一个培养箱、一台常规解剖显微镜、一把标准线虫挑取工具以及制备 NGM-琼脂平板所需的耗材。在 C. elegans 寿命测定中，可能最具成本限制的因素是所需耗材的数量。这是因为 C. elegans 为雌雄同体，可自体受精；因此，在进行寿命测定时，需每天将成虫从其后代中移出。然而，可通过使用 FUDR 处理或选择特定突变体（例如在 25 °C 高温下培养的温度敏感型无生殖系 glp-4(bn2) 突变体）来实现动物的无菌化，从而减少耗材的使用量30,31,32。本实验中采用 FUDR 或 glp-4(bn2) 无生殖系突变体进行寿命测定，所得结果与在非无菌动物中进行的标准寿命实验相似。尽管由于 FUDR 的影响45 或在 25 °C 下培养对寿命的作用2，野生型的寿命并不完全一致，但短寿的 hsf-1 沉默动物在所有条件下均稳定地表现出寿命显著缩短（图 1）。hsf-1 编码热休克因子 1（HSF-1）转录因子，该因子参与热应激反应的调控，其表达下调会导致寿命显著降低38,46。

尽管寿命是衰老生物学中需要考虑的一个重要因素，但寿命的延长往往并不伴随健康状况的改善，即使在C. elegans47中也是如此。因此，作为补充方法，我们提供了多种评估生物体健康状况的手段，包括生殖健康、运动行为以及应激抗性。生殖健康可通过两种方式之一进行测量。首先，通过统计产卵数量可直接反映单个自体受精雌雄同体个体所产卵子的数量。然而，由于线虫产生的卵母细胞数量多于精子，部分未受精的卵子也会被产出，而这些卵子无法发育为可存活的后代48。因此，为了更准确地评估个体真正的生殖能力，可通过子代数量（brood size）来衡量其可育后代的数量。通常情况下，应激抗性的增强实际上可能降低生殖能力，这可能是由于应激感知对生殖过程本身具有抑制作用所致49。类似地，与野生型对照相比，hsf-1过表达个体的产卵数和子代数量均显著减少（图2A、B）。事实上，部分hsf-1过表达个体表现出完全不育，这一现象表明生殖健康可能与寿命呈负相关关系。

尽管生殖健康对于理解种系健康、功能性减数分裂以及生殖能力至关重要，但总体而言，寿命与子代数量之间并无直接相关性50。因此，作为一种补充方法，运动行为被作为评估衰老过程中 C. elegans 健康寿命的金标准方法51。测量运动行为的方法有多种，但大多数方法需要复杂的相机、追踪软件或昂贵的化学试剂。相比之下，摆动实验几乎不需要标准 C. elegans 实验室以外的设备：体视显微镜、线虫挑取工具、移液器以及制备NGM-琼脂平板所需的耗材。摆动频率为测量衰老过程中的健康寿命提供了可靠的方法，其依据是老年个体的摆动频率相比年轻个体显著降低（图2C）。

最后，生存至应激实验是衡量生物体韧性的另一种生理指标。在衰老过程中，激活应激反应的能力通常会下降，导致生物体韧性降低、对压力更为敏感。因此，应激韧性可作为机体健康状况的可靠替代指标。本文提供了以下三种应激敏感性检测方法：1）通过暴露于衣霉素（tunicamycin）检测内质网（ER）应激敏感性，该化学试剂可阻断N-连接糖基化，导致未折叠蛋白在内质网中积累；2）通过百草枯（paraquat）暴露检测线粒体/氧化应激，该化学试剂可诱导线粒体中超氧化物的生成；3）通过高温暴露检测热应激。在进行衣霉素和百草枯实验时，需在制备NGM-琼脂平板时将药物加入平板中。对于高浓度的衣霉素，后代通常无法发育，因此无需使用灭菌技术。本方案推荐衣霉素的终浓度为25 ng/µL，但对于经费有限的研究者，10 ng/µL的浓度也能显著降低生存率（图3A）。这两个浓度均能抑制后代发育，因此无需采用灭菌方法；但DMSO对照组则需要使用灭菌技术或将动物转移至新的平板。这是因为衣霉素的毒性可阻止后代发育，而DMSO几乎无毒，因此在含衣霉素的平板上，若使用DMSO作为溶剂对照，后代仍可完全发育。

进行百草枯实验时，需要采用灭菌技术或转移动物，因为百草枯处理无法阻止后代发育至成虫阶段。高浓度百草枯（4 mM）会显著缩短寿命，而低浓度百草枯（0.25 mM）则由于激素效应延长寿命（图3B），这与先前发表的结果一致52。最后，热耐受实验仅需能够达到30–37 °C的培养箱，无需额外试剂。如先前研究所示，hsf-1 的过表达可提高在37 °C下的热耐受性（图3C）53。然而，正如其他研究者先前指出并结合本研究数据所示，热耐受实验的主要问题是其变异性。多种因素可能导致热耐受实验中的变异性，包括不同培养箱之间的差异，以及每小时记录热耐受时动物在培养箱外停留的时间。有关热耐受实验的详细操作指南，请参见参考文献41。

显示不同条件下生存率的寿命分析图：N2、FUDR、glp-4(bn2)、温度20-25°C。
图1：有无灭菌处理的寿命测量结果比较。（A）野生型N2线虫在接种空载体（ev）或hsf-1 RNAi细菌的NGM-琼脂平板上于20 °C培养的寿命。成虫期第1、3、5和7天将动物移离后代。（B）野生型N2线虫在接种空载体（ev）或hsf-1 RNAi细菌的NGM-琼脂-FUDR平板上于20 °C培养的寿命。动物在标准的空载体或hsf-1 RNAi平板上培养至成虫期，然后在成虫期第1天转移至FUDR平板。（C）glp-4(bn2)突变体动物在接种空载体（ev）或hsf-1 RNAi细菌的NGM-琼脂平板上于25 °C培养的寿命。所有条件下，每2天记录一次动物死亡情况，直至所有动物被记录为死亡或删失。出现产卵袋、阴门突出或破裂，或爬至平板边缘干枯的个体予以删失处理。所有统计分析采用Log-Rank Mantel-Cox检验，结果见表2。请点击此处查看该图的放大版本。

蠕虫运动能力、产卵数量、子代数量的比较；柱状图；统计分析结果。
图 2：以产卵数、子代数量和运动能力作为健康寿命的衡量指标。 （A）在接种空载体的 NGM-琼脂平板上、25 °C 条件下培养的 glp-4(bn2) 突变型线虫，在第 1 天（蓝色）、第 4 天（红色）和第 9 天（绿色）进行运动能力检测。将线虫置于 M9 溶液中，在 NGM-琼脂平板上进行检测，使用安装在常规解剖显微镜目镜上的标准智能手机摄像头录制视频，并以慢动作回放计数运动频率。每组 n = 15 条线虫。 （B）在野生型 N2（蓝色）和 sur-5p::hsf-1（红色）线虫中测定产卵数量。线虫在 20 °C 下培养，并转移至新鲜平板，每 12 小时计数一次所产卵数，最终累加总产卵数。野生型组 n = 7 条线虫，sur-5p::hsf-1 组 n = 9 条线虫。 （C）子代数量测定使用与（B）相同的线虫，将所产卵在 20 °C 下培养 2 天以完成孵化，统计所有孵化出的子代数量。*** = 通过非参数 Mann-Whitney 检验计算得到 p < 0.001。每个点代表一条线虫，线条表示中位数和四分位间距。 请点击此处查看该图的放大版本。

Kaplan-Meier生存分析，不同处理条件下的寿命曲线；图表；研究研究。
图3：应激韧性作为生物体健康的代理指标。 (A) 在空载体RNAi细菌上培养的N2动物的生存分析 20 °C. 将动物转移至含有1% DMSO或10 ng/的培养板中，µL 衣霉素（TM），或 25 ng/µL 成年第1天的TM。B) 在空载体RNAi细菌上培养的N2动物的生存分析 20 °C动物在含有水、0.25 mM 百草枯（PQ）或 4 mM PQ 的平板上从孵化开始培养。对于 A-B每隔2天记录一次动物的死亡情况，直至所有动物死亡或被删失。若动物出现阴门膨出、突出或破裂，或爬至培养皿侧壁而干枯死亡，则予以删失处理。所有统计分析均采用Log-Rank Mantel-Cox检验进行。表2). (C) 所有数据的汇总 37 °C 野生型N2动物与过表达株的耐热性检测 hsf-1 (sur-5p::hsf-1）。数据表示在热耐受实验中时间为9小时时的存活百分比，每条线代表同一天进行的匹配实验。动物在空载体RNAi细菌上培养 20 °C 并转移到 37 °C 在成虫期第1天进行检测。每菌株每重复使用60只动物。 请点击此处以查看此图的放大版本。

试剂配方
漂白液1.8% (v/v) 次氯酸钠，0.375 M KOH
羧苄青霉素100 mg/mL 储存液（1000倍），溶于水。4 °C 可保存最多6个月，或 -20 °C 长期保存
FUDR10 mg/mL 水溶液。-20 °C 保存。
IPTG1 M 水溶液。
溶菌肉汤（LB）本实验方案中使用商业 LB 培养基（见材料表），但所有使用 Bacto-tryptone、酵母提取物和 NaCl 配制的标准自制 LB 培养基均可使用。
M9 溶液22 mM KH2PO4（酸式磷酸盐），42.3 mM Na2HPO4，85.6 mM NaCl，1 mM MgSO4
线虫生长培养基（NGM）1 mM CaCl2，5 µg/mL 胆固醇，25 mM KPO4（pH 6.0），1 mM MgSO4，2% (w/v) 琼脂，0.25% (w/v) Bacto-Peptone，51.3 mM NaCl
NGM RNAi 平板1 mM CaCl2，5 µg/mL 胆固醇，25 mM KPO4（pH 6.0），1 mM MgSO4，2% (w/v) 琼脂，0.25% (w/v) Bacto-Peptone，51.3 mM NaCl，1 mM IPTG，100 µg/mL 羧苄青霉素/氨苄青霉素。4 °C 避光保存，最多3个月
NGM RNAi DMSO1 mM CaCl2，5 µg/mL 胆固醇，25 mM KPO4（pH 6.0），1 mM MgSO4，2% (w/v) 琼脂，0.25% (w/v) Bacto-Peptone，51.3 mM NaCl，1 mM IPTG，100 µg/mL 羧苄青霉素/氨苄青霉素；1% DMSO
（衣霉素对照）
NGM RNAi TM1 mM CaCl2，5 µg/mL 胆固醇，25 mM KPO4（pH 6.0），1 mM MgSO4，2% (w/v) 琼脂，0.25% (w/v) Bacto-Peptone，51.3 mM NaCl，1 mM IPTG，100 µg/mL 羧苄青霉素/氨苄青霉素；1% DMSO，25 ng/µL 衣霉素
百草枯400 mM 水溶液——需新鲜配制
四环素10 mg/mL 储存液（500倍），溶于100%乙醇。-20 °C 保存
衣霉素2.5 mg/mL 储存液，溶于100% DMSO。-80 °C 长期保存。此为100倍浓缩液（工作浓度为25 ng/µL）

表1. 实验方案中试剂与培养基的配制配方。

对应图版菌株、处理中位寿命死亡数/总数p值
(对数秩检验)
1AN2，空载RNAi，20 °C1774/120--
N2，hsf-1 RNAi，20 °C1165/120<0.001
1BN2，空载RNAi，FUDR，20 °C19120/120--
N2，hsf-1 RNAi，FUDR，20 °C11116/120<0.001
1CN2，glp-4(bn2)，空载RNAi，25 °C13115/121--
N2，glp-4(bn2)，hsf-1 RNAi，25 °C4120/120< 0.001
2AN2，空载RNAi，20 °C，1% DMSO1985/120--
N2，空载RNAi，20 °C，10 ng/µL 衣霉素15109/120<0.001
N2，空载RNAi，20 °C，25 ng/µL 衣霉素12117/120<0.001
2BN2，空载RNAi，20 °C1984/120--
N2，空载RNAi，20 °C，0.25 mM 百草枯2491/120<0.001
N2，空载RNAi，20 °C，4 mM 百草枯650/120<0.001

表2. 寿命与应激韧性统计结果。

讨论

寿命最简单的定义是生命的持续时间，在大多数生物中表现为一种明确的二元现象——生物要么存活，要么死亡。然而，长寿并不总是与生物体的健康状况相关。例如，线粒体激素效应模型中，暴露于线粒体应激可显著延长寿命，这类动物通常是寿命最长的个体，但却表现出生长迟缓和代谢功能下降37,54。类似地，内质网应激反应过度活跃的动物尽管表现出显著改善的蛋白质稳态和更长的寿命，但也展现出某些可与健康状况下降相关联的行为和表型36,49。最后，在模式生物中，许多延长寿命的范式，如HSF-1功能增强55、XBP-1功能增强56以及FoxO信号通路的改变57，均与癌症风险增加相关。如果生物体长期处于与癌症及其他健康问题的持续斗争中，那么延长寿命显然并不具有益处。因此，在衰老生物学研究中，寿命不能作为独立的衡量指标。

因此，健康寿命（healthspan）已成为衰老生物学中一个日益重要的研究领域。健康寿命大致定义为个体保持健康状态的生命时长，其确定难度较寿命更为复杂。然而，与寿命不同的是，健康寿命这一概念 "健康" 很复杂，因为生物体健康的衡量指标多种多样：在个体水平上，包括肌肉功能/力量、神经/认知功能、生殖健康等；在细胞水平上，包括蛋白质稳态、脂质稳态、葡萄糖稳态、代谢等。2014年，衰老生物学研究者明确界定了衰老的生物学标志，其定义需满足以下条件：该特征必须在自然衰老过程中发生渐进性衰退，并可通过实验手段进行干预，即实验性加剧应能加速衰老，而实验性干预则应能延缓衰老。这九大衰老标志包括基因组不稳定性、端粒缩短、表观遗传改变、蛋白质稳态（proteostasis）丧失、干细胞耗竭、细胞间通讯改变、线粒体功能障碍、营养感应失调和细胞衰老58此后，大量研究认为应纳入其他因素，包括细胞外蛋白以及免疫和炎症等系统生理过程59最终，由于健康寿命的定义复杂，必须采用多种不同方法来测量生物体的健康状况。

因此，本论文介绍了利用线虫模型 C. elegans 测量健康寿命多个方面的多种方法。我们通过摆动实验检测运动行为，通过产卵计数和子代数量评估生殖健康，并检测对压力的敏感性。事实上，运动行为是测量健康寿命的金标准方法，因为生物体在衰老过程中会表现出显著的运动能力下降51。运动行为的丧失可归因于多种衰老特征，因为 C. elegans 的肌肉功能依赖于正常的蛋白质稳态60、线粒体功能障碍61以及神经-肌肉信号传导62。尽管本论文仅聚焦于一种运动行为的测量方法，但需指出的是，还存在许多其他方法，包括动物在固体琼脂平板上的运动能力、对触碰的反应51以及趋化性实验63。然而，这些方法通常需要更复杂的记录设备、蠕虫追踪软件，或使用昂贵、危险或易挥发的化学物质，这些因素在某些研究环境中可能构成限制。

此外，产卵量和子代数量检测被用作评估生殖健康的指标，同时也是测量成年线虫细胞分裂的最简单方法，因为成年线虫的体细胞已退出有丝分裂，只有生殖细胞和胚胎在成年个体中进行细胞分裂64。作为细胞分裂的衡量指标，生殖健康与细胞衰老和干细胞耗竭等衰老特征相关。生殖健康可受多种因素影响，包括病原体感染65或应激暴露49，但目前尚无证据表明生殖健康与寿命之间存在直接相关性。事实上，一些长寿个体表现出子代数量显著减少49，甚至可能存在寿命与子代数量之间的负相关关系50。这种现象并非C. elegans所特有，繁殖对寿命的不利影响在人类66、伴侣犬67和小鼠68中早已被观察到。尽管如此，我们仍提供产卵计数和子代数量作为评估生殖健康的可靠且低成本的方法，但需注意的是，生殖健康可能与寿命或健康寿命无直接相关性。

最后，生存实验可作为生物体健康状况的间接衡量指标。重要的是，细胞应激反应（包括对热应激69和内质网应激35的反应）在衰老过程中会迅速下降，这与衰老的核心特征之一——蛋白质稳态失衡（proteostasis）70,71直接相关。相反，过度激活应激反应可通过增强对压力的适应能力而显著延长寿命35,37,38。尽管本研究聚焦于最简单且成本最低的方法，但针对热耐受性41和氧化应激66的应激抗性检测仍存在大量替代方法，每种方法需要不同的仪器设备和耗材。除了简单的应激暴露实验外，还可根据设备条件开展其他生理学检测。例如，细胞外通量分析仪可用于监测线粒体功能和细胞呼吸73；荧光解剖显微镜可用于检测应激反应激活相关的转录报告系统20；而高分辨率的复式显微镜或共聚焦显微镜则可结合线粒体74、内质网75,76以及肌动蛋白细胞骨架77的荧光探针，用于检测细胞器形态。

最后，关于寿命测量的一个警示：尽管化学和遗传方法可用于使线虫不育，从而显著降低成本，但必须注意，这两种方法都可能直接影响寿命。例如，已有报道指出，FUDR 暴露会影响寿命和热耐受性45。虽然 glp-4(bn2) 突变体本身对寿命无直接效应，但在 25 °C 下培养属于轻度热应激33,34，因此可能影响寿命2。目前还存在其他使 C. elegans 不育的方法，包括依赖于生长素的不育技术78 或其他温度敏感型无精突变体79。然而，所有方法均存在一定的局限性，应谨慎选择对各实验室科研需求影响最小的实验方案。寿命研究的另一个最终局限在于，由于样本量过小或研究者客观操作误差，可能导致结果出现变异性。随着自动化寿命测定技术的出现，这一问题可得到缓解80，但这些系统成本较高，且需要一定的工程和计算设备与技能。最终，本文所提供的这一系列方法是一套可靠且易于在几乎所有机构中快速适应和掌握的工具，为衰老生物学研究奠定了坚实的基础。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

G.G. 由美国国家老龄化研究所的 T32AG052374 和 R.H.S. 由 R00AG065200 资助。我们感谢CGC（由美国国立卫生研究院研究基础设施项目 P40 OD010440 资助）提供菌株。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
APEX IPTGGenesee18-242用于RNAi
Bacto AgarVWR90000-764用于NGM平板
Bacto PeptoneVWR97064-330用于NGM平板
二水氯化钙VWR97061-904用于NGM平板
羧苄青霉素VWR76345-522用于RNAi
胆固醇VWR80057-932用于NGM平板
DMSOVWRBDH1115-1LP药物溶剂
LB肉汤VWR95020-778用于LB培养基
七水硫酸镁VWR97062-132用于NGM平板和M9培养基
百草枯Sigma-Aldrich36541用于氧化应激/线粒体应激
氯化钾VWR97061-566用于漂白液
磷酸氢二钾VWREM-PX1570-2用于NGM平板
磷酸二氢钾VWREM-PX1565-5用于M9培养基
S7E解剖显微镜Leica10450840标准解剖显微镜
氯化钠VWREM-SX0420-5用于NGM平板和M9培养基
次氯酸钠VWRRC7495.7-32用于漂白液
磷酸氢二钠VWR71003-472用于M9培养基
盐酸四环素VWR97061-638用于RNAi
衣霉素Sigma-AldrichT7765-50MG用于内质网应激

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