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方法文章

使用聚胞苷酸（Poly(I:C)）建立可重复的中期妊娠母体免疫激活模型以研究子代的易感性与韧性

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DOI：

10.3791/64095

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2022年8月17日

 , 
1Center for Neuroscience, UC Davis

本文内容

摘要

母体感染是神经发育障碍的一个风险因素。母体免疫激活（MIA）的小鼠模型有助于阐明感染对大脑发育和功能的影响。本文提供了通用指南和一项实验方案，用于稳定地产生对MIA具有抗性或易感性的子代小鼠。

摘要

孕期母体免疫激活（MIA）始终与子代神经发育和神经精神障碍风险升高相关。MIA动物模型被用于验证因果关系、探究发病机制，并为这些障碍开发诊断方法和治疗手段。尽管此类模型被广泛使用，许多MIA模型仍存在可重复性差的问题，且几乎全部忽略了该风险因素的两个重要方面：（i）许多子代对MIA具有韧性；（ii）易感子代可表现出不同表型的组合。为提高可重复性，并同时模拟对MIA的易感性与韧性，本研究采用雌性小鼠在怀孕前的基础免疫反应性（BIR）来预测哪些妊娠将产生具有MIA暴露后行为和分子异常的子代，或产生具有韧性的子代。本文详细描述了一种诱导MIA的方法 通过 在妊娠12.5天时通过腹腔（i.p.）注射双链RNA（dsRNA）病毒模拟物poly(I:C)。该方法可在母体中诱导急性炎症反应，导致小鼠脑发育出现紊乱，这些紊乱所涉及的神经功能域与人类精神疾病和神经发育障碍（NDDs）中受类似影响的区域相对应。

引言

流行病学证据表明，母体感染与精神疾病和神经发育障碍（NDDs）风险增加相关，包括精神分裂症（SZ）和自闭症谱系障碍（ASD）1,2,3,4,5,6,7。母体免疫激活（MIA）小鼠模型的建立旨在验证MIA在这些疾病病因学中的因果关系和作用机制，同时用于识别分子生物标志物，并开发诊断和治疗工具4,6。尽管该模型具有重要研究价值且应用日益广泛，但目前领域内MIA诱导方案存在较大差异，导致不同研究之间的结果难以比较，且难以重复实验发现8,9。此外，大多数该模型的实验设计未探讨MIA的两个重要转化医学方面：（i）许多子代对MIA具有抵抗力；（ii）易感子代可表现出不同表型的组合8。

为了建立可重复的母体免疫激活（MIA）模型，研究者应至少报告一项针对母体MIA反应强度的定量指标。在妊娠期间诱导MIA时，本实验室采用腹腔内（i.p.）注射双链RNA病毒模拟物聚肌苷酸：聚胞苷酸[poly(I:C)]。poly(I:C)可被Toll样受体3（TLR3）识别，从而引发类似于流感病毒的免疫级联反应10。因此，poly(I:C)可激活急性期反应，导致促炎性细胞因子迅速升高8,11,12。既往研究表明，促炎性细胞因子（包括白细胞介素-6（IL-6））的升高是MIA导致子代出现行为异常和神经病理学改变的必要条件11,12,13。因此，在注射poly(I:C)后2.5小时母体血清中IL-6达到峰值时采集样本，其IL-6水平可作为评估MIA程度的一个有力定量指标，可用于该领域内不同实验室间研究结果的比较。

为了建立一种MIA模型，该模型通过单一诱导方案即可研究具有转化意义的韧性与易感性关键要素8,14，研究人员可将常规诱导方法与妊娠前母体基础免疫反应性（BIR）的表征相结合8。最近研究发现，未交配的C57BL/6雌性小鼠在妊娠前接受低剂量poly(I:C)暴露后，其IL-6反应存在广泛差异8。其中仅有一部分雌性会产生产生易感性子代的后代，且仅在由BIR与poly(I:C)剂量组合所决定的特定免疫激活强度下才会出现此现象8。母体免疫激活（MIA）诱导的表型呈倒U型模式；当母体具有中等程度的免疫反应性，且母体炎症程度达到但未超过某一临界范围时，其子代表现出最显著的行为和分子异常8。本文提供了一种详细的方法，用于通过妊娠中期注射poly(I:C)可靠地产生具有不同行为表型的韧性与易感性子代。

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方案

所有实验方案均在加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准下进行。

1. 动物准备

  1. 在获取实验动物时，应保持以下参数一致，以确保最大程度的可重复性。
    1. 供应商及供应商所在地：如先前报道所示，野生型 C57BL/6J 小鼠对相同剂量聚肌胞苷酸（poly(I:C)）的反应会因供应商不同而存在差异8。应选择对处理具有稳定反应的供应商和小鼠品系。在本实验中，来自 Charles River 的 C57BL/6 小鼠在经历中期母体免疫激活（MIA）后表现出一致的行为变化，而来自 Taconic 的小鼠反应幅度更大，且与 Charles River 小鼠相比，不同处理组之间存在一些差异8。
    2. 品系：C57BL/6J 小鼠是最常用的品系，但 BTBR 小鼠及其他品系对中期母体免疫激活（MIA）的反应存在差异9。需注意这些差异性反应，因其有助于提高方法的可重复性，并可能成为导致子代结果差异的潜在变量。
    3. 为确保最小变异，MIA 研究中仅使用未交配过的雌性小鼠8，并在方法部分明确记录相关细节。
    4. 运输时的年龄及适应期：在7周龄前运输的小鼠可能出现内分泌系统失调15。动物到达后应至少适应48小时16,17。订购时应确保小鼠运输时为7周龄（±2天），并在8周龄（±2天）时进行出生前免疫反应（BIR）注射。
    5. 交配时的年龄：动物的免疫系统在其生命周期中是动态变化的。应尽可能保持交配/注射时的年龄一致，以减少变异性18,19,20。雌性小鼠应在9周龄（±2天）时进行交配。用于交配的雄性小鼠年龄不应超过6个月。

2. 聚(I:C) 批次检测与制备

  1. 按以下方法制备高分子量聚(I:C)。
    1. 将1.5 mL微量离心管灭菌以备储存。重悬的poly(I:C)可保存于-20 °C，但反复冻融可能影响其活性。将水浴加热至 70 °C.
    2. 使用无菌技术，用注射器将 10 mL 无菌生理盐水（NaCl 0.9%）加入冻干的 poly(I:C) 中。加热于 70 °C 37℃水浴15分钟，以确保完全退火。取出后室温冷却。
    3. 在无菌操作台中，向瓶中加入额外的 40 mL 生理盐水，反复倒置数次以混匀。取下聚(I:C) 瓶的瓶盖，或使用移液器将其分装至 1.5 mL 微量离心管中。储存于 -20 °C.
  2. 按如下所述制备混合分子量的聚(I:C)。
    1. 将1.5 mL微量离心管灭菌以备储存。重悬的poly(I:C)可保存于-20 °C 但反复冻融可能影响活性。将水浴锅设定为 50 °C.
    2. 使用无菌技术，将 10 mL 无菌 0.9% NaCl 加入冻干的 poly(I:C) 中并拧紧瓶盖。加热于 50 °C 水浴25分钟以确保完全退火。取出后，室温冷却。
    3. 使用无菌技术分装至1.5 mL微量离心管中，于-20 °C.
  3. 通过腹腔（i.p.）注射给予聚肌胞苷酸（poly(I:C)），具体操作如下所述。
    1. 称重小鼠以确定准确的给药剂量。使用0.5 cc胰岛素注射针抽取重悬的聚(I:C)。抓住小鼠颈背部皮肤并翻转，使腹部暴露。
    2. 用另一只手将针头以约45度角插入前两个乳头之间的区域，深度约为0.5 cm 45°.
    3. 注射前回抽以确认无血液或尿液进入注射器。若出现上述情况，需重新调整针头位置后再次尝试。缓慢注射。若聚肌胞苷酸（poly(I:C)）外溢形成气泡，则可能为皮下注射。成功的注射操作应在针头插入后回抽无液体，拔出后无药液渗漏。
  4. 检测MMW poly(I:C)批次的效价，具体步骤如下8.
    1. 获取所需形式的聚肌胞苷酸（poly(I:C)）。部分生产商允许研究人员在检测效价期间预留整批或部分批次，以便后续同时获取多瓶样品。通常，这些样品可于-20°C以冻干形式保存。20 °C 如果避免冻融，可保存数年。
    2. 获取或培育30只怀孕母鼠用于实验。在E12.5时，对每剂量组至少10只小鼠进行腹腔注射，剂量分别为20、30和40 mg/kg。
    3. 注射后2.5小时采集血液 通过 尾部采血。需注意外周血与躯干血的细胞因子水平可能存在差异，因此在同项研究中应保持采血方法一致。
    4. 室温下静置过夜使血液凝固。12-24小时后，在3,768 x g离心血液样本 g 在 4 °C 8 分钟。收集血清并于 -80 °C 直至分析前。
    5. 分离血清并检测IL-6水平 通过 ELISA 或 Luminex。应保持检测工具的一致性，因为不同检测方法和不同厂商所测得的总浓度存在显著差异。利用小规模预试验队列确定诱导表型所需的 IL-6 反应幅度。

3. 基线免疫反应性（BIR）检测

注意：图1 展示了各步骤的示意图。在BIR检测中应使用与妊娠期不同的分子量的聚(I:C)，以降低对该化合物产生适应性免疫反应的可能性。

  1. 订购7周龄的未交配雌性小鼠。到达后，每笼饲养4至5只小鼠，并保持群养状态直至交配。使用耳缘剪孔或其他任何识别系统进行个体标识。
  2. 到达后1周，通过腹腔注射方式给予雌性小鼠5 mg/kg的聚肌胞苷酸（poly(I:C)）。注射后2.5小时，即循环IL-6水平达到峰值时6，采集注射后动物的全血 通过 尾部取样
  3. 室温下静置过夜使血液凝固。12-24小时后，在3,768 x g离心血液样本。 g 在 4 °C 8 分钟。
  4. 至少收集 32 µL 每份样品血清的采集。于 -80 °C 直至准备检测细胞因子时再进行后续操作。为最稳定地检测IL-6水平，建议使用多重检测方法（如Luminex）。应保持检测工具的一致性，因为不同检测方法和不同厂商所测得的总浓度存在显著差异。
    1. 有关Luminex检测方案，请参阅Bruce等人的研究。21.
  5. 根据IL-6的相对水平，将动物分为低BIR组（最低四分位数）、中BIR组（中间两个四分位数）和高BIR组（最高四分位数）。

4. 尾部采血法用于血液采集

注意：为避免使用可能具有免疫调节作用的镇静剂，应采用尾部采血法进行血液采集。

  1. 准备时，将焊台和固定杯放置在非惯用手一侧的台面上。在35 mm的培养皿中加入1–2 mL食品级可食用油。取下快速止血帽的盖子，并将其放在装置附近。
  2. 在焊台上铺几层纸巾，并将第一根毛细管用夹子夹住，放置在靠近小鼠尾尖将被固定的位置，使其与台面保持平行。准备好剃须刀片。
  3. 采集血液时，请执行以下步骤。
    1. 在规定时间，将小鼠从笼中取出，放入固定杯下，使其尾巴从底部的切口伸出。使用新的剃须刀片剪去尾尖末端（1–2 mm），并将第一滴血收集到夹在焊台上的毛细管中。
    2. 将惯用手的指尖浸入可食用油中，从尾根部向尾尖轻轻挤压，引导尾尖对准毛细管，收集后续血滴。持续操作直至收集约200 µL血液。
    3. 先将小端盖盖在毛细管的锥形末端，再盖上顶部盖帽。若先盖顶部盖帽，样本将从毛细管锥形末端被挤出。将毛细管放入保护性外管中。
    4. 室温静置过夜使其凝固。将微量离心机预冷至4 °C，并按照步骤3.3所述离心血液。

小鼠细胞因子检测流程图；使用Luminex/ELISA；血液采集时间线
图1测试未交配雌性个体基础免疫反应性及交配的时间线。 订购7周龄小鼠，到货后在设施中适应1周。以5 mg/kg剂量给予小鼠poly(I:C)注射，2.5 h后采血。血液室温静置过夜使其凝固，随后在3,768 x g离心 g, 4 °C 8 分钟后收集血清并检测相对 IL-6 水平 通过 ELISA 或多重检测。在9周龄时建立交配对。使用 BioRender.com 创建 请点击此处以查看此图的放大版本。

5. 基于体重的交配及妊娠E12.5注射方法

注意：图2展示了实验步骤的示意图。可通过两种方法建立交配对并确定E12.5时间点。第一种为定时交配法，已在其他文献中描述22。此外，也可采用基于体重的计算方法来判断是否处于E12.5妊娠阶段23。该方法的优势在于可锁定母鼠交配时的年龄，从而减少免疫反应的个体间差异。本实验采用此方法。

  1. 将雄性小鼠放入清洁的笼子中，使其适应环境至少2 h。这可以降低雌性攻击的可能性，因为雄性已在笼内形成优势气味。
  2. 将雌性小鼠放入雄性小鼠笼中，建立单雄单雌的繁殖配对。在放入笼前，称量雌鼠体重并记录数值。每笼添加少量葵花籽以提高交配效率。
  3. 为确定体重增加范围，请执行以下步骤。
    1. 获取一组雌性实验动物，建立交配对，并记录交配时的体重。
    2. 当雌性小鼠开始出现明显妊娠迹象时，称重并根据体重增加量分为8.5 g、9.5 g、10.5 g和11.5 g四个亚组。E12.5时期的胎鼠 paw 刚开始形成明显的趾部结构。利用胎鼠形态学特征确定达到E12.5时期的平均增重。
  4. 交配后第12天，称量雌性小鼠体重并计算体重增长量。在实验条件下，雌性小鼠从交配至E12.5期间体重通常增加9.5–10.5 g。注射 通过 腹腔注射第2.3.2步确定剂量的溶解型poly(I:C)，当雌性小鼠体重增长处于预定范围内时。
  5. 使用以下参数观察母鼠对MIA的反应。
    1. 疾病行为：在1-3分范围内对母鼠被操作时的活动程度进行主观评分，其中1分为对操作几乎无反应或无活动，3分为对捕捉和固定表现出正常抵抗反应。免疫反应较强的动物对操作的抗拒程度较低8.
    2. 发热反应：使用红外温度计采集注射前和注射后2.5小时的体温。免疫反应较强的动物常因免疫活动增强而出现低体温。8.
    3. 体重变化：注射后24小时称量动物体重。免疫反应较强的动物通常体重下降更明显。8.
    4. 测量妊娠期 IL-6 水平，步骤如下8.
      1. 注射后2.5小时，采用首选方法采集血液。室温静置过夜使血液凝固。12–24小时后，以3,768 x g离心血液样本 g 在 4 °C 8 分钟
      2. 收集血清并在 -80 °C 直至分析前保存。分离血清并检测IL-6水平 通过 ELISA 或 Luminex。应保持检测工具的一致性，因为不同检测方法和不同制造商测得的总浓度存在显著差异。
      3. 注射后将母鼠单独饲养，并提供适当 enrichment（如 nestlets 和其他丰富化装置）。所有丰富化装置应保持一致，因为丰富化环境的改变可能对啮齿类动物行为产生显著影响。24,25,26,27,28,29.
  6. C57小鼠的妊娠期为18.5至20.5天。应进行仔鼠检查，以确认出生时间在此范围内，确保注射在正确的时间点进行。检查仔鼠时，应尽量减少对鼠笼的干扰。分娩后立即受到应激可能增加母鼠食仔的风险。

小鼠实验示意图、细胞因子检测方法、生理盐水、聚肌胞苷酸（Poly(I:C)）注射、仔鼠检查流程
图2MIA 诱导. MIA 诱导需要评估妊娠状态、腹腔注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）以及检查产仔情况，以确保母体炎症时机正确。在确定妊娠天数后 通过 定时交配或根据体重增加法确定妊娠，在E12.5时进行腹腔注射poly(I:C)。注射后2.5小时采集血液样本，以确认免疫激活并测定IL-6激活水平。仔鼠将在约E18.5至E20.5出生。图示使用BioRender.com制作 请点击此处以查看此图的放大版本。

6. 成年MIA子代与对照子代行为改变的检测（可选）

  1. 从 P60 开始，在进行行为学测试之前，需连续 3 天每天对动物进行 1 分钟的温和抓握操作，使其适应与人类的接触。确保换笼日不与行为学测试当天重合。
  2. 每次开始行为学测试前，始终让小鼠在测试房间内适应 30–60 分钟。使用光线较暗（15–20 lux）的房间以尽量减少焦虑。
  3. 对于重复性理毛行为测试，将小鼠单独放置于清洁且无垫料、带盖的笼子中。使用摄像机记录小鼠在笼中的行为 20 分钟，前 10 分钟作为适应期，后 10 分钟为测试期。
  4. 利用保存的视频和秒表，记录每只小鼠在 10 分钟测试期内的累计理毛时间。从这些视频中还可评估其他行为，包括直立（以后肢站立）、僵直和跳跃8。
  5. 对 MIA 模型可使用其他常见的测试方法，如前脉冲抑制（PPI）14,30,31,32、开放旷场12,33,34、三室社交接近13,35,36、新物体识别37、Y 迷宫30、高架十字迷宫33以及情境/提示性恐惧条件反射38。
  6. 出生后免疫印迹分析8（可选）
    1. 在 P0 时迅速断头处死，于 HBSS 中解剖胎儿脑组织，用液氮速冻后于 −80 °C 保存。
    2. 使用探头式超声波破碎仪，在 2x Laemmli 缓冲液中以 20% 振幅处理 5 秒，裂解样品，随后在 85 °C 变性 5 分钟。室温下以 16,000 x g 离心 10 分钟，收集上清液并储存在 -80 °C。
    3. 使用商用 BCA 蛋白检测试剂盒测定总蛋白含量，按照制造商说明书操作，并以牛血清白蛋白作为校准标准品。
    4. 向样品中加入二硫苏糖醇作为还原剂，终浓度为 100 mM。上样前于 85 °C 加热 2 分钟。
    5. 在还原条件下，将 5 µg/泳道的蛋白质上样至 7.5% TGS 凝胶进行电泳，随后电转移至 PVDF 膜。用封闭缓冲液封闭膜，并与所选一抗孵育。
    6. 用 TBS + 0.05% Tween 20 洗涤三次，每次 45 分钟，然后与荧光标记的二抗孵育。
    7. 再用 TBS/Tween 20 额外洗涤四次，成像结果。使用抗-β-tubulin 抗体检测 β-tubulin 作为标准化参照。

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结果

并非所有在E12.5时期暴露于30 mg/kg聚肌胞苷酸（poly(I:C)）的动物都会产生具有持续性行为异常的子代8,31。尽管30 mg/kg和40 mg/kg的poly(I:C)均能稳定地在母体中引发疾病相关行为，包括活动水平降低、体温过低反应和体重减轻，并显著升高白细胞介素-6（IL-6）水平，但仅有一部分经历母体免疫激活（MIA）的窝仔会进一步发展出类似于人类精神疾病和神经发育障碍（NDDs）中所观察到的行为异常（图3A-C）8。较低剂量（20 mg/kg）的poly(I:C)也可诱导母体出现疾病行为和体重减轻，但与较高剂量不同的是，其引发的IL-6反应幅度通常不足以稳定地导致子代表现出行为异常，尽管该IL-6水平仍显著高于注射生理盐水母体的反应（图3D）

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讨论

母体感染会改变人类、啮齿类动物和非人灵长类动物的大脑发育进程4,5,7。本文概述了一种在小鼠妊娠中期使用聚肌胞苷酸（poly(I:C)）诱导母体免疫激活（MIA）的操作方法。该方法纳入了妊娠前对母鼠基础免疫反应（BIR）的评估，从而提高了实验的可重复性，并为深入研究子代对MIA产生适应性或易感性的潜在机制提供了可能8。在MIA处理后，中等BIR组母鼠（其IL-6水平处于中间50%范围）所产的成年子代稳定表现出重复性行为的改变；通过免疫细胞化学检测发现，其新生子代神经元上的MHCI水平发生变化；通过蛋白质印迹法（Western blot）检测发现，其新生子代纹状体中酪氨酸羟化酶、MEF2和STAT3蛋白水平升高8。

使用MIA作为环境模型可提高其转化相关性，因为它满足疾病模型的标准：构效效度、表面效度和预...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 Myka Estes 博士在解决小鼠 MIA 模型变异性的过程中所表现出的坚持不懈，以及 Estes 等人8中所有贡献者的工作，这些工作促成了本文所述方法方案的建立。本研究所报告的工作得到了 NIMH 2P50 MH106438-06（A.K.M.）和 NIMH T32MH112507（K.P.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% NaCl 生理无内毒素盐水Sigma-Aldrich7647-14-5Poly(I:C) 的对照和溶媒
35 mm 培养皿Thomas Scientific1219Z45尾静脉采血时用于盛放油类
7.5% TGX 凝胶Bio-rad4561084可选
Ancare NestletsFisher ScientificNC9365966可选
anti-β-tubulinMilliporeMAB3408可选
Bio-Plex Pro 小鼠细胞因子标准品组 IBio-rad171I50001
Bio-Plex Pro 试剂盒（含平底板）Bio-rad171304070M
牛血清白蛋白ThermoFisher23209可选
离心机Eppendorf5810R可选
Covidien Monoject 1/2 mL 胰岛素注射器，带 28G × 1/2 in. 针头Spectrum552-58457-083
二硫苏糖醇Sigma-AldrichD9779-10G可选
环境富集材料Bio-servK3327 和 K3322可选
EthovisionNoldusEthovision可选
荧光标记的二抗Li-cor925-32213 和 925-68072可选
食品级食用油（如橄榄油、菜籽油或葡萄籽油）多个供应商尾静脉采血时用于润滑尾巴
HBSSThermoFisher14060040可选
高分子量聚肌苷酸:聚胞苷酸Invivogen#tlrl-pic-5用于建立雌性小鼠的 BIR
人道小鼠固定器AIMS1000尾静脉采血时用于固定小鼠
Image Studio 软件Licor5.2可选
Laemmli 缓冲液Bio-rad1610737EDU可选
Luminex200ThermoFisherAPX10031
Microvette CB300 300μl 血清毛细管Sarstedt16.440.100
混合分子量聚肌苷酸:聚胞苷酸Sigma-Aldrich#P0913用于妊娠期 MIA 诱导
单克隆抗 MEF2A 抗体AbCamab76063可选
单克隆抗 STAT3 抗体Cell signaling12640S可选
ObserverNoldusObserver可选
Odyssey 封闭缓冲液（TBS）Li-cor927-50003可选
Odyssey CLx 成像系统Li-cor9140可选
Omnipure PBSMillipore65054L可选
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒ThermoFisher23227可选
多克隆抗 TH 抗体Pel-FreezP4101-150可选
PVDF 膜Bio-rad162-0177可选
Qsonica 超声破碎仪 Q500Fisher Scientific15-338-282可选
快速止血剂Petco17140
Seal-Rite 1.5 ml 微量离心管，透明非无菌USA Scientific1615-5500
焊台支架AmazonB08Y12QC73尾静脉采血时用于固定毛细管
葵花籽Bio-servS5137-1用于提高繁殖效率
Bio-Plex Pro 小鼠 IL-6 检测试剂盒Bio-rad171G5007M
Tris 碱Fisher ScientificBP152-1可选
Tween 20Bio-rad23209可选

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