使用聚胞苷酸（Poly(I:C)）建立可重复的中期妊娠母体免疫激活模型以研究子代的易感性与韧性

摘要

母体感染是神经发育障碍的一个风险因素。母体免疫激活（MIA）的小鼠模型有助于阐明感染对大脑发育和功能的影响。本文提供了通用指南和一项实验方案，用于稳定地产生对MIA具有抗性或易感性的子代小鼠。

摘要

孕期母体免疫激活（MIA）始终与子代神经发育和神经精神障碍风险升高相关。MIA动物模型被用于验证因果关系、探究发病机制，并为这些障碍开发诊断方法和治疗手段。尽管此类模型被广泛使用，许多MIA模型仍存在可重复性差的问题，且几乎全部忽略了该风险因素的两个重要方面：（i）许多子代对MIA具有韧性；（ii）易感子代可表现出不同表型的组合。为提高可重复性，并同时模拟对MIA的易感性与韧性，本研究采用雌性小鼠在怀孕前的基础免疫反应性（BIR）来预测哪些妊娠将产生具有MIA暴露后行为和分子异常的子代，或产生具有韧性的子代。本文详细描述了一种诱导MIA的方法 通过 在妊娠12.5天时通过腹腔（i.p.）注射双链RNA（dsRNA）病毒模拟物poly(I:C)。该方法可在母体中诱导急性炎症反应，导致小鼠脑发育出现紊乱，这些紊乱所涉及的神经功能域与人类精神疾病和神经发育障碍（NDDs）中受类似影响的区域相对应。

引言

流行病学证据表明，母体感染与精神疾病和神经发育障碍（NDDs）风险增加相关，包括精神分裂症（SZ）和自闭症谱系障碍（ASD）^{1,2,3,4,5,6,7}。母体免疫激活（MIA）小鼠模型的建立旨在验证MIA在这些疾病病因学中的因果关系和作用机制，同时用于识别分子生物标志物，并开发诊断和治疗工具^4,6。尽管该模型具有重要研究价值且应用日益广泛，但目前领域内MIA诱导方案存在较大差异，导致不同研究之间的结果难以比较，且难以重复实验发现^8,9。此外，大多数该模型的实验设计未探讨MIA的两个重要转化医学方面：（i）许多子代对MIA具有抵抗力；（ii）易感子代可表现出不同表型的组合⁸。

方案

所有实验方案均在加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准下进行。

1. 动物准备

1. 在获取实验动物时，应保持以下参数一致，以确保最大程度的可重复性。
   1. 供应商及供应商所在地：如先前报道所示，野生型 C57BL/6J 小鼠对相同剂量聚肌胞苷酸（poly(I:C)）的反应会因供应商不同而存在差异⁸。应选择对处理具有稳定反应的供应商和小鼠品系。在本实验中，来自 Charles River 的 C57BL/6 小鼠在经历中期母体免疫激活（MIA）后表现出一致的行为变化，而来自 Taconic 的小鼠反应幅度更大，且与 Charles River 小鼠相比，不同处理组之间存在一些差异⁸。
   2. 品系：C57BL/6J 小鼠是最常用的品系，但 BTBR 小鼠及其他品系对中期母体免疫激活（MIA）的反应存在差异⁹。需注意这些差异性反应，因其有助于提高方法的可重复性，并可能成为导致子代结果差异的潜在变量。
   3. 为确保最小变异，MIA 研究中仅使用未交配过的雌性小鼠⁸，并在方法部分明确记录相关细节。
   4. 运输时的年龄及适应期：在7周龄前运输的小鼠可能出现内分....

结果

并非所有在E12.5时期暴露于30 mg/kg聚肌胞苷酸（poly(I:C)）的动物都会产生具有持续性行为异常的子代^8,31。尽管30 mg/kg和40 mg/kg的poly(I:C)均能稳定地在母体中引发疾病相关行为，包括活动水平降低、体温过低反应和体重减轻，并显著升高白细胞介素-6（IL-6）水平，但仅有一部分经历母体免疫激活（MIA）的窝仔会进一步发展出类似于人类精神疾病和神经发育障碍（NDDs）中所观察到的行为异常（图3A-C）⁸。较低剂量（20 mg/kg）的poly(I:C)也可诱导母体出现疾病行为和体重减轻，但与较高剂量不同的是，其引发的IL-6反应幅度通常不足以稳定地导致子代表现出行为异常，尽管该IL-6水平仍显著高于注射生理盐水母体的反应（图3D）

讨论

母体感染会改变人类、啮齿类动物和非人灵长类动物的大脑发育进程^4,5,7。本文概述了一种在小鼠妊娠中期使用聚肌胞苷酸（poly(I:C)）诱导母体免疫激活（MIA）的操作方法。该方法纳入了妊娠前对母鼠基础免疫反应（BIR）的评估，从而提高了实验的可重复性，并为深入研究子代对MIA产生适应性或易感性的潜在机制提供了可能⁸。在MIA处理后，中等BIR组母鼠（其IL-6水平处于中间50%范围）所产的成年子代稳定表现出重复性行为的改变；通过免疫细胞化学检测发现，其新生子代神经元上的MHCI水平发生变化；通过蛋白质印迹法（Western blot）检测发现，其新生子代纹状体中酪氨酸羟化酶、MEF2和STAT3蛋白水平升高⁸。

使用MIA作为环境模型可提高其转化相关性，因为它满足疾病模型的标准：构效效度、表面效度和预.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% NaCl 生理无内毒素盐水	Sigma-Aldrich	7647-14-5	Poly(I:C) 的对照和溶媒
35 mm 培养皿	Thomas Scientific	1219Z45	尾静脉采血时用于盛放油类
7.5% TGX 凝胶	Bio-rad	4561084	可选
Ancare Nestlets	Fisher Scientific	NC9365966	可选
anti-β-tubulin	Millipore	MAB3408	可选
Bio-Plex Pro 小鼠细胞因子标准品组 I	Bio-rad	171I50001
Bio-Plex Pro 试剂盒（含平底板）	Bio-rad	171304070M
牛血清白蛋白	ThermoFisher	23209	可选
离心机	Eppendorf	5810R	可选
Covidien Monoject 1/2 mL 胰岛素注射器，带 28G × 1/2 in. 针头	Spectrum	552-58457-083
二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	D9779-10G	可选
环境富集材料	Bio-serv	K3327 和 K3322	可选
Ethovision	Noldus	Ethovision	可选
荧光标记的二抗	Li-cor	925-32213 和 925-68072	可选
食品级食用油（如橄榄油、菜籽油或葡萄籽油）	多个供应商		尾静脉采血时用于润滑尾巴
HBSS	ThermoFisher	14060040	可选
高分子量聚肌苷酸:聚胞苷酸	Invivogen	#tlrl-pic-5	用于建立雌性小鼠的 BIR
人道小鼠固定器	AIMS	1000	尾静脉采血时用于固定小鼠
Image Studio 软件	Licor	5.2	可选
Laemmli 缓冲液	Bio-rad	1610737EDU	可选
Luminex200	ThermoFisher	APX10031
Microvette CB300 300μl 血清毛细管	Sarstedt	16.440.100
混合分子量聚肌苷酸:聚胞苷酸	Sigma-Aldrich	#P0913	用于妊娠期 MIA 诱导
单克隆抗 MEF2A 抗体	AbCam	ab76063	可选
单克隆抗 STAT3 抗体	Cell signaling	12640S	可选
Observer	Noldus	Observer	可选
Odyssey 封闭缓冲液（TBS）	Li-cor	927-50003	可选
Odyssey CLx 成像系统	Li-cor	9140	可选
Omnipure PBS	Millipore	65054L	可选
Pierce BCA 蛋白定量试剂盒	ThermoFisher	23227	可选
多克隆抗 TH 抗体	Pel-Freez	P4101-150	可选
PVDF 膜	Bio-rad	162-0177	可选
Qsonica 超声破碎仪 Q500	Fisher Scientific	15-338-282	可选
快速止血剂	Petco	17140
Seal-Rite 1.5 ml 微量离心管，透明非无菌	USA Scientific	1615-5500
焊台支架	Amazon	B08Y12QC73	尾静脉采血时用于固定毛细管
葵花籽	Bio-serv	S5137-1	用于提高繁殖效率
Bio-Plex Pro 小鼠 IL-6 检测试剂盒	Bio-rad	171G5007M
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-1	可选
Tween 20	Bio-rad	23209	可选