通过鼻内博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

Dingyun Song; Yicong Chen; Xin Wang; Xueying Chen; Shuwei Gao; Wenxiu Xu; Shengnan Yang; Zai Wang; Liang Peng; Huaping Dai

doi:10.3791/64097

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方法文章

通过鼻内博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

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DOI：

10.3791/64097

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2023年1月20日

Dingyun Song¹^,² , Yicong Chen¹^,³ , Xin Wang¹^,⁴ , Xueying Chen¹^,² , Shuwei Gao¹^,³ , Wenxiu Xu¹^,³ , Shengnan Yang⁵ , Zai Wang⁶ , Liang Peng⁷ , Huaping Dai¹^,²

¹Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Center of Respiratory Medicine, China-Japan Friendship Hospital, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Institute of Respiratory Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, ²Graduate School of Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, ³Capital Medical University, ⁴Beijing University of Chinese Medicine, ⁵Tianjin Chest Hospital, ⁶Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, ⁷Beijing Key Laboratory for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital

本文内容

摘要

已采用博来霉素建立多种肺纤维化动物模型，以阐明肺纤维化的发病机制并寻找新的药物靶点。然而，大多数针对肺组织的肺纤维化模型存在药物分布不均的问题。本文提出一种通过鼻腔雾化博来霉素诱导的均匀性肺纤维化模型。

摘要

肺纤维化是多种人类肺部疾病的特征，这些疾病由不同病因引起。由于治疗选择较为有限，小鼠模型仍然是开发新型抗纤维化策略的重要工具。本研究通过鼻腔雾化给予博来霉素（BLM），建立一种能紧密模拟临床疾病特征的肺纤维化小鼠模型。C57BL/6小鼠通过鼻腔雾化接受BLM（7 U/mL，每日30分钟），连续给药3天，并于第9、16或23天处死，以观察肺组织中的炎症和纤维化变化。经鼻腔雾化的BLM直接作用于肺部，导致广泛且均匀的肺部炎症和纤维化。因此，我们成功构建了一种典型的人类肺纤维化实验小鼠模型。该方法可广泛用于研究不同鼻腔雾化制剂对肺部病理生理的影响，并可用于验证新型抗炎和抗纤维化治疗手段。

引言

肺纤维化是一种进行性疾病，其特征是肺间质中细胞外基质成分（主要为I型胶原）过度沉积，导致肺功能受损¹。肺纤维化的病理生理机制复杂，目前的治疗选择十分有限。小鼠模型仍是研究该疾病发生与发展相关致病机制以及新药研发策略的重要工具。

多种肺纤维化动物模型依赖于博来霉素的气管内灌注²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²然而，博来霉素（BLM）在肺部引起的纤维化改变分布并不均匀，且动物在灌注过程中存在窒息风险。尽管腹腔注射BLM可诱导肺部产生相对均匀的....

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方案

中日友好医院（中国北京）动物实验伦理委员会批准了本研究中涉及小鼠的所有实验程序（编号：190108）。小鼠饲养于中日友好医院临床医学研究所的无菌动物房内，室温为20–25 °C，相对湿度为40%–70%，动物照度为15–20 LX，光照与黑暗交替各12小时。动物可自由获取食物和饮水。

1. 小鼠

确保所有动物在雾化前已在饲养设施中适应环境7天。
使用8至10周龄的雄性C57BL/6小鼠进行雾化。

2. 鼻内博来霉素雾化

博来霉素制备
注意：博来霉素（BLM）是一种化学毒物，可杀伤肿瘤，但也可能损伤正常细胞和正常组织。
1. 在洁净工作台中配制BLM溶液。
  1. 为获得工作浓度（7 U/mL），将15 U的盐酸博来霉素溶于2.14 mL生理盐水中。轻轻混匀复溶后的BLM，直至完全溶解。
2. 将工作液置于4 °C或冰上保存，并在1天内使用。雾化前将BLM溶液恢复至室温。
麻醉
1. 通过将0.1 g戊巴比妥钠溶解于10 mL生理盐水中来配制麻醉液。将配制好的麻醉工作液储存在避光、4 °C环境中，3天内使用完毕。....

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结果

通过雾化博来霉素（BLM）诱导肺损伤，对照组动物则雾化等体积的生理盐水。小鼠每天雾化一次，每次30分钟，连续3天，BLM浓度为7 U/mL。在给予BLM后的第9、16和23天处死小鼠，进行H&E染色（图2B）。与对照组小鼠相比，接受BLM的小鼠肺组织中出现弥散性肺炎性病变，表现为正常肺泡结构丧失、间隔增厚、肺泡扩大，以及间质和支气管周围区域炎性细胞浸润增加。通过观察显微镜下视野，评估每份肺组织切片中纤维化改变的严重程度，并以平均严重程度评分（Ashcroft评分）表示。BLM-D9、BLM-D16和BLM-D23组小鼠的Ashcroft评分均高于对照组小鼠（图2C）。

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讨论

经气管注射博来霉素可在双肺诱发急性炎症和纤维化反应，可被视为建立人类间质性肺疾病实验小鼠模型的有效方法。经气管给药是最常用的给药途径。²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²药物进入气管后，通过直立旋转使博来霉素在肺组织中均匀分布，从而导致肺部一致性的纤维化。博来霉素可被给予通过

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（编号：92068108）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
博来霉素	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	纤维化模型药物
注射用0.9%生理盐水	贝朗医疗（天津）有限公司		博来霉素配制
1 mL注射器	BD	300481	动物麻醉
10%中性福尔马林缓冲液	泰和立达生物科技有限公司		肺组织固定
15 mL离心管	Corning	430790	麻醉前准备
20 °C冰箱	New-fly集团	BCD-213K	药物储存
4 °C冰箱	New-fly集团	BCD-213K	药物储存
Adobe Illustrator CC2020	Adobe		图像处理
蓝色背衬液	北京化工厂		组织染色
超净工作台	苏州苏洁净化设备有限公司		博来霉素配制
分化液	北京化工厂		组织染色
电子天平	METTLER TOLEDO	AA-160	麻醉前准备
伊红染液	北京益利精细化学品有限公司		组织染色
加热垫	HIDOM		小鼠孵育
苏木精染液	北京益利精细化学品有限公司		组织染色
磷酸盐缓冲液（PBS）	Hyclone	SH30256.01	清洗肺组织
Photoshop绘图软件	Adobe		图像处理
SCIREQ INEXPOSE	EMKA生物技术（北京）有限公司		雾化装置
正置荧光显微镜	Olympus	BX53	观察切片

参考文献

Raghu, G., et al. Diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis. An official ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (5), e44-e68 (2018).
Moore, B. B., Hogaboam, C. M.

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