通过鼻内博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

摘要

已采用博来霉素建立多种肺纤维化动物模型，以阐明肺纤维化的发病机制并寻找新的药物靶点。然而，大多数针对肺组织的肺纤维化模型存在药物分布不均的问题。本文提出一种通过鼻腔雾化博来霉素诱导的均匀性肺纤维化模型。

摘要

肺纤维化是多种人类肺部疾病的特征，这些疾病由不同病因引起。由于治疗选择较为有限，小鼠模型仍然是开发新型抗纤维化策略的重要工具。本研究通过鼻腔雾化给予博来霉素（BLM），建立一种能紧密模拟临床疾病特征的肺纤维化小鼠模型。C57BL/6小鼠通过鼻腔雾化接受BLM（7 U/mL，每日30分钟），连续给药3天，并于第9、16或23天处死，以观察肺组织中的炎症和纤维化变化。经鼻腔雾化的BLM直接作用于肺部，导致广泛且均匀的肺部炎症和纤维化。因此，我们成功构建了一种典型的人类肺纤维化实验小鼠模型。该方法可广泛用于研究不同鼻腔雾化制剂对肺部病理生理的影响，并可用于验证新型抗炎和抗纤维化治疗手段。

引言

肺纤维化是一种进行性疾病，其特征是肺间质中细胞外基质成分（主要为I型胶原）过度沉积，导致肺功能受损¹。肺纤维化的病理生理机制复杂，目前的治疗选择十分有限。小鼠模型仍是研究该疾病发生与发展相关致病机制以及新药研发策略的重要工具。

多种肺纤维化动物模型依赖于博来霉素的气管内灌注^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}然而，博来霉素（BLM）在肺部引起的纤维化改变分布并不均匀，且动物在灌注过程中存在窒息风险。尽管腹腔注射BLM可诱导肺部产生相对均匀的纤维化改变，但由于药物靶向性不足，需要多次给药。经气管雾化给药 通过 喉镜给药无需气管切开或穿刺，药物在肺部的分布效果最佳。然而，气溶胶颗粒较大（5–40 µm），因此无法到达肺组织的胸膜下区域。

本研究通过鼻腔雾化给予博来霉素（BLM）。雾化过程中，小鼠自主呼吸并吸入药物颗粒。雾化颗粒的大小为2.5–4 µm，不仅可在肺内均匀分布，还能到达胸膜下区域。在低倍镜下，特发性肺纤维化（IPF）患者最显著的肺组织病理学特征包括：病变程度不一、分布不均、不同阶段的病变呈交替分布，以及间质性炎症、纤维化病变和蜂窝肺改变与正常肺组织交替存在。这些病理改变主要累及外周胸膜下实质或细支气管周围的肺小叶间隔。因此，由于该方法能使BLM颗粒到达肺部胸膜下区域，该模型能够很好地模拟人类疾病的临床特征。

方案

中日友好医院（中国北京）动物实验伦理委员会批准了本研究中涉及小鼠的所有实验程序（编号：190108）。小鼠饲养于中日友好医院临床医学研究所的无菌动物房内，室温为20–25 °C，相对湿度为40%–70%，动物照度为15–20 LX，光照与黑暗交替各12小时。动物可自由获取食物和饮水。

1. 小鼠

1. 确保所有动物在雾化前已在饲养设施中适应环境7天。
2. 使用8至10周龄的雄性C57BL/6小鼠进行雾化。

2. 鼻内博来霉素雾化

1. 博来霉素制备
   注意：博来霉素（BLM）是一种化学毒物，可杀伤肿瘤，但也可能损伤正常细胞和正常组织。
   1. 在洁净工作台中配制BLM溶液。
      1. 为获得工作浓度（7 U/mL），将15 U的盐酸博来霉素溶于2.14 mL生理盐水中。轻轻混匀复溶后的BLM，直至完全溶解。
   2. 将工作液置于4 °C或冰上保存，并在1天内使用。雾化前将BLM溶液恢复至室温。
2. 麻醉
   1. 通过将0.1 g戊巴比妥钠溶解于10 mL生理盐水中来配制麻醉液。将配制好的麻醉工作液储存在避光、4 °C环境中，3天内使用完毕。
   2. 使用1 mL注射器配合26 G针头，向小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，按75 mg/kg体重的终剂量进行麻醉。
      注：本研究中，小鼠对该剂量的反应持续时间不少于30分钟。如有必要，可根据小鼠反应在兽医指导下调整剂量。
   3. 数分钟后，用食指和拇指按压麻醉小鼠的脚趾，确认其肢体回缩反射已消失。
3. 雾化系统的准备
   1. 仪器校准后，用柔软的网状罩固定麻醉后的小鼠（图1A），用移液器将工作浓度的BLM溶液加入暴露塔顶部的雾化头中（图1B），运行雾化器30分钟，以实现稳定的雾化效果。
      注：工作流程见图1C、D。软件操作的详细步骤请参见补充图S1和补充图S2，其中展示了步骤2.3.1.1–2.3.1.9的具体内容。
      1. 双击flexiWare 8图标（补充图S1A），点击experimentation session（补充图S1B），然后点击New Study按钮（补充图S1C）。
      2. 编辑实验名称（补充图S1D），并编辑标题和负责人（补充图S1E）。
      3. 选择IX-4DIO模板（补充图S1F），输入操作员信息（补充图S1G），点击确认按钮（补充图S1H）| 下一步按钮（补充图S1I）。
      4. 选择泵，然后依次点击下一步（补充图S1J）| 下一步（补充图S2A）| 下一步（补充图S2B）| 完成按钮（补充图S2C）。
      5. 点击Continuous-1Lmin的设置（三个点，补充图S2D）| DIO1，将占空比（%）设为25%，然后点击确定（补充图S2E）。
      6. 点击DIO2，将占空比（%）设为25%，然后点击确定（补充图S2F）。
      7. 点击DIO3，将占空比（%）设为25%，然后点击确定（补充图S2G）。
      8. 点击DIO4，将占空比（%）设为25%，然后点击确定（补充图S2H）。
      9. 点击左侧的顶部绿色按钮开始运行，点击右侧的红色按钮停止工作。点击右上角的x退出程序（补充图S2I）。
   2. 在BLM组中，每次雾化12只小鼠，共进行四次，总计48只小鼠。在正常对照组中，每次使用生理盐水雾化6只小鼠。
4. 动物恢复
   1. 在雾化器中处理30分钟后，将小鼠转移至配备加热垫的恢复笼中。
   2. 观察小鼠直至其完全清醒。
   3. 确认小鼠状态良好（即能够自由活动）后，将其放回原笼。在完全恢复前，不得将其与其他动物同笼饲养。
   4. 在BLM处理后的24小时内，每天两次检查生理指标，包括呼吸频率、存活情况及任何症状。

3. 肺组织处理

1. 在第9、16和23天 在给予博来霉素（BLM）数天后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（终剂量为100 mg/kg体重）处死6只小鼠。
2. 取出气管和肺，并立即用冷的磷酸盐缓冲液冲洗。
3. 将左肺置于10%中性福尔马林缓冲液中固定24小时，然后进行石蜡包埋。
4. 苏木精-伊红染色（H&E染色）
   1. 将固定的肺组织在脱水机中进行脱水。
   2. 将脱水的肺组织块置于56 °C的融蜡盒中1 h。
   3. 包埋时，将熔化的石蜡倒入模具盒中，然后迅速将浸透石蜡的组织块置于模具盒底部，冷却并凝固。
   4. 将包埋的蜡块固定在切片机上，上下调节切片台至适当位置，推进刀片，调整刻度，切出厚度为4 µm的切片。用镊子将切片放入盛有水的展片盒中（正面朝上）以展平。
   5. 修补并烘烤切片。当石蜡切片完全展平后，以135°角将载玻片贴近石蜡切片，用镊子将切片移至载玻片上，提起载玻片，并根据需要调整石蜡切片的位置。将贴好切片的载玻片置于47 °C恒温台上1 min，使切片再次充分展平；待切片完全平整后，将载玻片放入62 °C培养箱中孵育1 h。
   6. 脱蜡：将烘烤后的切片先后浸入二甲苯中，每次20分钟，共两次。
   7. 用于复水，将切片置于梯度酒精系列中以复水肺组织切片：100% 酒精中 2 分钟，95% 酒精中 1 分钟，90% 酒精中 1 分钟，85% 酒精中 1 分钟，75% 酒精中 1 分钟，最后置于蒸馏水中 3 分钟 最小
   8. 将切片置于苏木精染液中染色5分钟，用流水冲洗1分钟，重复两次；然后放入0.5%盐酸酒精分化液中5秒，再用流水冲洗1分钟，重复两次；接着置于蓝染液中8–10秒，用自来水冲洗两次；最后用伊红染色30秒。
   9. 染色后脱水与脱色：将染色切片依次置于75%乙醇中1分钟、85%乙醇中1分钟、90%乙醇中1分钟、95%乙醇中1分钟、100%乙醇中1分钟，再放入二甲苯中2次，每次1分钟，最后用吸水纸吸去所有残留液体。
   10. 封片时，在切片中央滴加一滴中性树胶封片剂，然后盖上盖玻片。
5. 小鼠肺组织形态学分级标准
   1. 根据 Ashcroft 等人描述的方法，由一名对实验分组不知情的研究人员从每个样本中随机选取三个显微视野，在100倍放大下观察肺纤维化程度：0级，肺组织正常；1级，肺泡轻度肿胀，局部轻度纤维化；2级，明显纤维化（肺泡壁厚度超过正常的三倍），伴有纤维灶；3级，连续性纤维化区域（肺泡壁厚度为正常的三倍以上）；4级，纤维灶融合，纤维化区域占肺组织面积不足10%；5级，纤维灶融合，纤维化区域占10%至50%，肺泡结构显著破坏；6级，大范围连续纤维灶（占肺组织面积大于50%）；7级，肺泡腔被纤维组织填充，出现肺大疱；8级，完全纤维化。
   2. 为每个视野分配与等级相对应的分数（例如，等级4等于4分），并对每组六个样本分别评分。

结果

通过雾化博来霉素（BLM）诱导肺损伤，对照组动物则雾化等体积的生理盐水。小鼠每天雾化一次，每次30分钟，连续3天，BLM浓度为7 U/mL。在给予BLM后的第9、16和23天处死小鼠，进行H&E染色（图2B）。与对照组小鼠相比，接受BLM的小鼠肺组织中出现弥散性肺炎性病变，表现为正常肺泡结构丧失、间隔增厚、肺泡扩大，以及间质和支气管周围区域炎性细胞浸润增加。通过观察显微镜下视野，评估每份肺组织切片中纤维化改变的严重程度，并以平均严重程度评分（Ashcroft评分）表示。BLM-D9、BLM-D16和BLM-D23组小鼠的Ashcroft评分均高于对照组小鼠（图2C）。

讨论

经气管注射博来霉素可在双肺诱发急性炎症和纤维化反应，可被视为建立人类间质性肺疾病实验小鼠模型的有效方法。经气管给药是最常用的给药途径。^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}药物进入气管后，通过直立旋转使博来霉素在肺组织中均匀分布，从而导致肺部一致性的纤维化。博来霉素可被给予 通过

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
博来霉素	Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd	DP721	纤维化模型药物
注射用0.9%生理盐水	贝朗医疗（天津）有限公司		博来霉素配制
1 mL注射器	BD	300481	动物麻醉
10%中性福尔马林缓冲液	泰和立达生物科技有限公司		肺组织固定
15 mL离心管	Corning	430790	麻醉前准备
20 °C冰箱	New-fly集团	BCD-213K	药物储存
4 °C冰箱	New-fly集团	BCD-213K	药物储存
Adobe Illustrator CC2020	Adobe		图像处理
蓝色背衬液	北京化工厂		组织染色
超净工作台	苏州苏洁净化设备有限公司		博来霉素配制
分化液	北京化工厂		组织染色
电子天平	METTLER TOLEDO	AA-160	麻醉前准备
伊红染液	北京益利精细化学品有限公司		组织染色
加热垫	HIDOM		小鼠孵育
苏木精染液	北京益利精细化学品有限公司		组织染色
磷酸盐缓冲液（PBS）	Hyclone	SH30256.01	清洗肺组织
Photoshop绘图软件	Adobe		图像处理
SCIREQ INEXPOSE	EMKA生物技术（北京）有限公司		雾化装置
正置荧光显微镜	Olympus	BX53	观察切片