剥离印迹技术：一种用于从多层或高浓度生物样品中分离单层结构的冷冻电镜样品制备方法

摘要

peel-blot 技术是一种冷冻电镜载网制备方法，可将多层且浓集的生物样品分离为单层，从而降低样品厚度、提高样品浓度，并有助于图像处理。

摘要

去层- blot 冷冻电镜载网制备技术是一种经过显著改进的反向注射方法，旨在减少多层样品的层数。在样品速冻之前去除部分层次，有助于将样品厚度降低至适合冷冻电镜数据采集的水平，改善样品的平整性，并促进图像处理。该去层-blot 技术可将多层膜结构分离为单层，将层状二维晶体分离为独立的晶体，同样也可将可溶性蛋白堆叠的片状结构分离成单层。这类样品通常厚度较大，给冷冻电镜数据采集和图像处理带来难以克服的困难，尤其是在需要倾斜显微镜载物台进行数据采集时更为明显。此外，利用该技术可制备出高浓度的载网样品，从而实现高效的数据采集，因为在载网制备前可提高样品浓度，并通过调整去层-blot 技术获得密集分布的单层样品。

引言

为了将膜蛋白的堆叠二维晶体分离成单层，从而获得适合进行冷冻电镜二维和三维数据采集的足够薄的样品，并促进图像处理，开发了剥离印迹（peel-blot）技术¹。该方案同样适用于其他类型的多层膜样品，也可用于在不增加样品Z方向厚度的情况下，在载网上实现上述任一样品类型的高浓度分布。

通过结合毛细压力和剪切力，该方案在原有反向注射法的基础上进行了大幅扩展和改进，可将样品层数减少至单层²。第一步为 blotting 步骤，使用亚微米级滤纸而非反向注射法中常用的 20–25 µm 孔径滤纸，使多层样品在 blotting 过程中紧密夹在碳膜与载网金属条之间，并牢固附着。当载网垂直压在海藻糖液滴上时，夹层结构受到强制分离，碳膜被推离载网金属条，从而实现单个样品层的分离或剥离（图 1）。下一步中，将载网再次用亚微米级滤纸进行 blotting，使碳膜进一步从其最初与载网金属条的接触点移开。这些步骤的重复次数可根据具体样品进行优化。此外，该方案还可用于提高样品浓度，同时避免在 Z 方向上发生聚集。由于该方法依赖样品对载网金属条和碳膜的附着性以及强制分离过程，因此可能不适用于某些高度脆弱的分子，例如特定的不稳定蛋白或蛋白复合物。

剥印法既不需要特殊设备，也不需要昂贵的耗材。然而，针对特定样品的应用需仔细考虑生物学参数。对于二维晶体，决策较为简单，因为需要碳膜以确保平整性，但操作过程仍需谨慎。 通过 剥片印迹技术可能影响样品的生物完整性或晶体有序性。该技术适用于单颗粒样品的情况仅限于那些需要碳膜且能耐受操作处理的颗粒，且需经测试验证。对于层间存在关键生物相互作用的样品，由于该技术会破坏此类相互作用，因而可能不适用于剥片印迹技术的表征。

通过在室温下使用负染色或未染色样品进行透射电子显微镜（TEM）测试与筛选，可最快地优化剥离印迹技术（"peel-blot"）。一旦确定了最佳的剥离印迹循环次数，即可确定玻璃化前控制样品厚度所需的时间。

方案

1. 剥离印迹技术的准备步骤

注意：准备过程中需将以下物品放置在彼此相邻的位置。

1. 叠加两片孔径为 20–25 µm 的滤纸（参见材料表）。
2. 将一片长约 8 cm × 10 cm 的石蜡膜放置在滤纸旁边，滤纸朝上。
3. 将一片亚微米级滤纸置于另外两片 #4 滤纸之上（图 1-1）。
4. 将防反毛细管镊子放置成弯曲端朝上、直端朝下。然后选择一片光滑/有光泽面朝上的 600 目载网。将镊子置于培养皿或其他抬高的表面上，以避免洁净载网接触其他物品。
5. 从石蜡膜上取下纸片，并拉伸两侧（约 5 mm）形成一个小边缘。用移液器在石蜡膜一端短边约 1–2 cm 处滴加两滴 150 µL 的 4% 海藻糖溶液，两滴之间相距约 1 cm。
6. 在另一个实验台或地面上，将液氮倒入一个小的聚苯乙烯泡沫容器中（参见材料表）。
   注意：必须接受相关培训，并佩戴手套和面罩，以防冻伤。
7. 将一个小型冷冻电镜载网盒放入液氮中，并用无尘擦拭布盖住聚苯乙烯泡沫容器。

2. 将碳膜放置到载网上

1. 使用Dumont #5镊子（见材料表）将碳膜从云母片上漂浮下来：将云母片一侧以轻微向下倾斜的角度（约20°–40°）接触海藻糖溶液液滴的一侧，缓慢向下移动云母片，利用水的表面张力使碳膜脱离云母片。当碳膜漂浮在液滴表面时，松开云母片。
2. 目视检查碳膜，避免使用带有裂纹等损伤的碳膜。
3. 用抗毛细作用力镊子夹住载网，以一定角度（约20°–30°）插入邻近碳膜下方的海藻糖液滴中，随后将载网中心对准碳膜下方，拾取碳膜（图1-2）。
4. 保持载网方向不变，缓慢将其放入第二个海藻糖液滴的表面，注意不要破坏液滴的表面张力，以去除可能缠绕在载网边缘并附着于粗糙面的多余碳膜。

3. 将多层二维晶体分离为单层

1. 旋转防毛细管镊子（参见材料表），将其放置在培养皿中，使载网的碳膜面朝下（图1-3）。
2. 用移液器吸取1.3 µL样品，加入到载网上方微小的海藻糖弯月面中。将溶液上下吹打约8–10次，以混合并使海藻糖和样品均匀分布在载网两侧。
3. 在溶液孵育1分钟的同时，将一滴或多滴1.7 µL海藻糖溶液滴加到石蜡膜上。
4. 将载网旋转回原始位置，使碳膜面朝上。
5. 使用防毛细管镊子将载网压在亚微米滤纸上（图1-4）。待滤纸吸收溶液且碳膜完全展平后，等待3秒，然后提起载网并垂直转移至1.7 µL海藻糖溶液液滴中（图1-5）。
   注意：对于高度堆积的样品，需重复此步骤多次；否则，载网即可进入下一步的玻璃化冷冻制备。
6. 将载网在两片滤纸上轻轻吸去多余液体，然后从滤纸上提起载网（图1-6）。根据湿度和样品缓冲液的不同，大约13秒后，将载网迅速浸入小型聚苯乙烯泡沫容器中的液氮中，并将载网放入冷冻电镜载网盒中，或直接用于冷冻电镜筛选或数据采集。
   注意：为快速优化实验方案，此步骤可对剥离后吸滤的载网进行负染色处理，而非将其浸入液氮。负染色方法为：在载网上加入3 µL 1% 醋酸铀溶液，孵育30秒，然后用撕成小块的20–25 µm孔径滤纸吸去多余染液。在海藻糖、单宁酸或葡萄糖中玻璃化的二维晶体载网通常采用手动浸入法进行冷冻，因为海藻糖、单宁酸和葡萄糖可在手动浸入的冷却速率下抑制结晶冰的形成²。

结果

成功的剥离印迹实验将获得通常为高浓度的单层样品。可以预期的是，在大多数网格方格中，部分区域仍会存在多层结构，尤其是在剥离印迹步骤的迭代次数较少时。然而，大多数网格方格中将出现大范围的单层区域，如人源白三烯C₄合酶的二维晶体（图2）和脂质体（在步骤3.2中加入，图3）所观察到的结果。对于未表现出理想层数减少的样品，可能需要测试额外的剥离印迹步骤。

成功完成剥离印迹实验最重要的指标，是高分辨率冷冻电镜数据采集和图像处理后所观察到的数据质量和生物学完整性。在数据分析时，需要仔细考虑层间接触区域可能发生的损伤或形变。

发生剥离印迹的电镜载网区域通常比未发生该现象的区域具有更高的样品浓度。这种明显的浓缩效应是由于多层样品附着在碳膜和载网条表面所致，随后在剥离印迹制样过程中，当两表面反复分离、轻微重新定位并再次接触时，样品进一步附着于这两个表面。结果是原始多层样品的不同层被展开，分布到更大的横向区域...

讨论

剥离印迹法是一种强大的方法，可用于克服多层二维晶体及类似样品在冷冻电镜数据采集和图像处理过程中存在的堆叠和厚度问题。是否使用剥离印迹法需根据样品的生物学参数来决定，并且在获得三维冷冻电镜模型后还需进一步评估。在此评估中，相互作用界面的生物学重要性以及接触区域可能存在的柔性尤为关键。

剥离印迹的数量将首先确定 通过 标准负染网格制备后的观察，若存在过多层或过厚的情况，则需采用不同于常规冷冻电镜网格制备的替代策略。对于层间有序堆叠的薄多层晶体，可直接用于微晶电子衍射（microED）分析³ 或对较厚的晶体进行聚焦离子束（FIB）切削⁴双层二维晶体通常无需进行剥离印迹，因为当两层晶体对齐时，可单独或同时处理各层。⁵这种方法可能有利于在溶液中剥离印迹前以及最终剥离印迹步骤后，使膜蛋白二维晶体的两侧均暴露于配体或抑制剂。此外，减小大尺寸、高度有序的双层二维晶体的尺寸可能有助于实现电子衍射^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
600目网格	SPI	2060-C-XA
防毛细作用镊子	Ted Pella	510-5
用于镀覆云母的碳膜
冷冻电镜			冷冻电镜网格可在120 kV或200 kV下进行筛选。  高分辨率数据在300 kV下采集。
Dumpont #5镊子	Ted Pella	5622
冷冻电镜样品储存盒	Ted Pella	160-40
Kim Wipes擦拭纸
液氮
云母	Ted Pella	56	云母需镀碳膜，并切割成略大于透射电镜网格的正方形。  碳膜厚度可能需要优化，以避免在多次剥离 blot 操作时碳膜过薄而易破裂。
负染			1–2% 醋酸铀适用于多种样品。  也可使用其他染料，如磷钨酸。
Parafilm封口膜
聚苯乙烯容器			用于玻璃化剥离 blot 网格。可回收聚苯乙烯运输容器，并内衬铝箔使用。
亚微米滤纸	MilliporeSigma	DAWP04700
透射电子显微镜	JEOL	JEM-1400	任何在80–120 kV加速电压下运行的透射电镜均适用于负染网格的筛选。
海藻糖			配制4%海藻糖溶液。
Whatman #4滤纸	MilliporeSigma	WHA1004150	对应本方案中孔径为20–25 μm的滤纸。