用于共聚焦显微镜观察动态界面的微张力测定仪

摘要

本文描述了一种微张力计/共聚焦显微镜的设计与操作方法，可用于在观察界面形貌的同时，同步测量界面张力和界面膨胀流变学性质。该方法可实时构建在技术和生理过程中具有重要意义的界面结构-性能关系。

摘要

表面活性分子在流体-流体界面的吸附在自然界中普遍存在。表征这些界面需要测量表面活性剂的吸附速率，评估平衡表面张力随体相表面活性剂浓度的变化，并分析平衡后界面面积变化引起的表面张力响应。利用高速共聚焦显微镜进行荧光成像，可同时实现对界面的可视化，从而直接评估结构与功能之间的关系。在毛细管压力微张力仪（CPM）中，一个半球形气泡被固定在毛细管末端，浸入1 mL液体储液池中。通过调节气泡界面的毛细管压力实现控制 通过 一种商用微流控流体控制器，可根据拉普拉斯方程实现基于模型的压力、气泡曲率或气泡面积控制。与传统的朗缪尔槽和悬滴法等技术相比，该系统的测量与控制精度及响应时间显著提升；毛细压力的变化可在毫秒级时间内施加并实现精确控制。气泡界面的动态响应过程可被实时可视化观察。 通过 随着气泡的膨胀与收缩，通过第二片光学透镜进行观测。将气泡轮廓拟合为圆形轮廓，以确定气泡的曲率半径 R，以及任何偏离圆形的程度，后者可能导致结果无效。利用拉普拉斯方程计算界面的动态表面张力。在达到平衡后，可通过计算机控制的微流控泵施加微小的压力振荡，使气泡半径发生振荡（频率范围为 0.001–100 周/分钟），以测定扩张模量。该系统的整体尺寸足够小，可使微张力仪置于高速共聚焦显微镜的物镜下方，从而以亚微米级的横向分辨率对荧光标记的化学物质进行定量追踪。

引言

被表面活性剂膜覆盖的气-液界面在日常生活中普遍存在。表面活性剂-水混合物的注入被用于提高枯竭油藏的原油采收率，也用作页岩气和页岩油开采中的水力压裂液。气-液泡沫和液-液乳液在许多工业和科学过程中常见，例如作为润滑剂和清洁剂，并广泛存在于食品中。在包装、储存和给药过程中，界面处的表面活性剂和蛋白质可稳定抗体的构象^1,2,3,4,5，维持眼部泪膜的稳定性^6,7,8，以及参与肺部力学调节^{9,10,11,12,13,14,}

方案

1. 毛细管的制备

1. 将毛细管放入毛细管拉制仪中，运行所需的拉制程序，制备出两根尖端外径（OD）约为 1 µm 的锥形毛细管。
   注意：拉制前毛细管的外径必须符合微张力计样品池中毛细管夹持器所要求的规格。毛细管的内径（ID）可有所变化，但会影响拉制后毛细管的临界半径。应选择合适的拉制程序，使拉制初期毛细管的外径和内径迅速减小，随后接近目标外径和内径的半径，之后直径减小速度变慢。这样可获得更长的毛细管段，便于划痕断裂后获得内径为 30–100 µm 的可用毛细管。
2. 在毛细管尖端选定位置进行划痕，使其内径达到 30–100 µm，然后折断尖端。此时毛细管尖端的外径和内径即为所需的半径（图 1A）。毛细管可保存至进行第 2 步。
   注意：毛细管切割边缘必须为 90° 的整齐断裂。任何切割边缘缺陷都会导致气泡在毛细管上的固定不良，从而影响表面性质的测量结果。锥形毛细管尖端极为脆弱，若接触除溶液以外的任何物体（如小瓶壁、气流喷嘴），均会被破坏。

2. 毛细管的疏水化处理

1. 准备拉制好的玻璃毛细管、酸洗液、塑料镊子、去离子水（DI水）、疏水化溶液（乙醇中含2%硅烷）、真空泵和乙醇溶液。详见材料表。
   警告：酸洗液具有....

结果

测量误差的一个主要来源是毛细管在切割过程（图5A、B）或涂层过程（图5D）中产生的缺陷。这两类缺陷均会导致光学图像分析系统在确定气泡形状和尺寸时出现误差，从而导致表面张力值不准确。在将毛细管插入CPM之前，必须在光学显微镜下仔细检查每一根新制备的毛细管。有切割缺陷的毛细管必须弃用；而涂层不良的毛细管则可通过酸洗清洁后重新涂层，以改善毛细管末端的气泡钉扎效果（实验方案步骤2）。毛细管的最佳工作状态要求其端面切割完全垂直于毛细管轴线（图5C），且气泡恰好在毛细管末端处钉扎（图5E）。随着使用，毛细管上的疏水涂层在钉扎气泡方面的效果会逐渐下降，因此需要对毛细管进行重新清洗和重新涂层。

表面活性剂吸附随时间变化的代表性数据见图6。以往用于测量表.......

讨论

联合使用的共焦显微拉曼光谱法（CPM/CFM）是一种研究界面动力学、平衡状态及形貌的有力工具。本实验方案描述了利用CPM/CFM获取数据所需的各个步骤。

图2展示了带有毛细管、溶剂和热交换通道的池体设计。溶剂交换的入口应位于池体底部，出口应位于顶部，以确保在交换过程中池体不会溢出。实际操作中，即使使用相同的蠕动泵，入口和出口的流速也可能略有不同。这种池体设计的一个常见问题是发生泄漏。这通常是由于池体与某个连接部件之间的密封不良所致；但如果所有连接处均干燥且无泄漏，则可能是由于紧固池体周围的螺栓时过度拧紧，导致玻璃片出现裂纹所致。

图3展示了各种泵与细胞之间的连接关系，以及细胞与共聚焦显微镜（CFM）和明场显微镜（CPM）物镜的对准情况。CPM相机（4）用于在运行期间成像气泡的形状。CPM相机必须配备一个光学滤光片，以防止CFM激发激光进入CPM相机。否则，CFM激光会使CPM相机中的图像噪声极大，难以通过图像.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 O.D. Tygon 软管	Fischer Scientific		软管
A1RHD 多光子直立共聚焦显微镜	Nikon		共聚焦显微镜
酸性清洗液			浓硫酸与 Alnochromix 按体积比 50% 用水稀释，待溶液澄清后方可进一步稀释
Alnochromix	Alconox	2510	与硫酸按包装说明混合后稀释，用于制备酸性清洗液
陶瓷玻璃切割器	Sutter Instruments
氯仿	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		肺表面活性物质
去离子水			18.5 MΩ - cm
乙醇	任意品牌		200 proof 用于疏水化处理，变性乙醇用于清洗
Fiber-Lite Model 190 光纤照明系统	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	光源；其他光源亦可使用
Flow EZ F69 mbar 带 Link 模块	Fluigent	LU-FEZ-0069	微流控泵
Fluigent SDK VIs	Fluigent		CPM 虚拟界面所必需
氟橡胶垫圈			由 1 mm 厚 Viton 片材加工而成，见图 3
气体过滤器	Norgren	F07-100-A3TG	安装于微流控泵与压力调节器之间
气体调节器	Norgren	10R0400R	将气源压力降至泵的工作范围，连接至气体过滤器，压力范围为 2–120 psi
玻璃毛细管	Sutter Instruments	B150-86-10	硼硅酸盐玻璃，外径 1.5 mm，内径 0.86 mm
载玻片	任意品牌		75 mm × 25 mm
玻璃注射器	Hamilton	84878	25 μL 玻璃注射器
疏水化试剂	Sigma-Aldrich	667420	1H,1H,2H,2H-八氟辛基三乙氧基硅烷，纯度 98%；其他疏水性三乙氧基硅烷可替代
不溶性表面活性剂	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC 溶于氯仿
LabVIEW 软件	National Instruments		2017
长通滤光片	ThorLabs	FEL0650	650 nm 长通滤光片，波长需能滤除激发激光频率
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酰胆碱
Masterflex L/S 可调速模拟控制泵系统，配 Easy-Load II 泵头	Masterflex	HV-77916-20	蠕动泵
MATLAB	Mathworks		R2019
微电极拉制仪 P-1000	Sutter Instruments		毛细管拉制仪
微张力计样品池及支架			样品池由 PEEK 材料加工而成，支架由铝材加工而成，见图 3 和图 4
微张力计物镜	Nikon		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI 视觉开发模块	National Instruments		CPM 虚拟界面所必需
PEEK 手拧接头	IDEX	F-120x	10-32 锥形接口
PEEK 堵头	IDEX	P-551	10-31 锥形接口
移液器吸头	Eppendorf	22492225	100 μL - 1000 μL，已高压灭菌
塑料镊子	Thermo Scientific	6320-0010
塑料注射器	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
管路配件	Fischer Scientific		三通阀及其他管路配件，用于连接软管
Research Plus 单通道 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	微量移液器
硫酸	任意品牌		用于配制酸性清洗液
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	Nikon		共聚焦显微镜物镜
Texas Red DHPE 三乙基铵盐	Thermo Fischer Scientific	1395MP	荧光染料
真空泵	Gast	DOA-P704-AA