用于动态界面共聚焦显微镜可视化的微量天体测量仪

Summary

本手稿描述了微量血压计/共聚焦显微镜的设计和操作，以便在可视化界面形态的同时测量界面张力和表面膨胀流变学。这提供了在技术和生理学中重要的界面的结构 - 属性关系的实时构建。

Abstract

表面活性分子对流体 - 流体界面的吸附在自然界中无处不在。表征这些界面需要测量表面活性剂吸附速率，评估平衡表面张力作为块体表面活性剂浓度的函数，并关联表面张力如何随平衡后界面面积的变化而变化。使用荧光成像和高速共聚焦显微镜同时对界面进行可视化，可以直接评估结构 - 功能关系。在毛细管压力微量计（CPM）中，将半球形气泡固定在毛细管末端的1 mL液体储液器中。通过商业微流体流量控制器控制穿过气泡界面的毛细管压力，该控制器允许基于模型的压力、气泡曲率或基于拉普拉斯方程的气泡面积控制。与以往的Langmuir槽和吊坠落技术相比，测量和控制精度和响应时间大大提高;毛细管压力变化可以在几毫秒内应用和控制。气泡界面的动态响应通过第二个光学透镜可视化，因为气泡膨胀和收缩。气泡轮廓拟合到圆形轮廓，以确定气泡曲率半径 R，以及任何会使结果无效的圆度偏差。拉普拉斯方程用于确定界面的动态表面张力。平衡后，计算机控制的微流体泵可以施加小的压力振荡来振荡气泡半径（频率为0.001-100个周期/分钟），以确定膨胀模量系统的整体尺寸足够小，以至于微秒计适合高速共聚焦显微镜的透镜下，允许以亚微米横向分辨率定量跟踪荧光标记的化学物质。

Introduction

表面活性剂薄膜覆盖的空气-水界面在日常生活中无处不在。表面活性剂-水注入用于提高枯竭油田的采收率，并用作页岩气和石油的水力压裂解决方案。气液泡沫和液液乳液在许多工业和科学过程中作为润滑剂和清洁剂很常见，在食品中很常见。界面处的表面活性剂和蛋白质在包装、储存和给药过程中稳定抗体构象^{1，2，3，4，5}，眼睛中的泪膜稳定性^6，7，8 和肺力学^{9，10，11，12，13，14，15}

Protocol

1. 毛细管的制备

1. 将毛细管放入毛细管拉拔器中，并运行所需的拉拔程序，以制造两个锥形毛细管，其尖端的外径（OD）约为1μm。
   注意:拉动前毛细管的外径必须是指定适合微型血压计单元中毛细管支架的外径。毛细管的内径（ID）可以变化，但会影响拉动后毛细管的临界半径。选择拉拔程序，以便所得的锥度最初迅速减小毛细管OD和ID，然后达到所需毛细管OD和ID附近的半径，然后更慢地减小直径。这将产生更大的毛细管长度，可以对其进行评分以产生ID为30-100μm的可用毛细管。
2. 在所需位置对毛细管的尖端进行评分，以获得30-100μm的ID并折断尖端。毛细管现在将在尖端具有所需半径的OD和ID（图1A）。毛细血管可以储存到步骤2。
   注:毛细管的切割边缘必须为 90° 干净。切割边缘的任何缺陷都会导致气泡与毛细管的固定不良，并且表面性能测量较差。锥形毛细管尖端非常细腻。如果它们与溶液以外的任何东西（例如，小瓶壁，空气喷嘴）接触，它们将被破坏。

2. 毛细管的疏水

1. 收集拉出的玻璃毛细管，酸清洗液，塑料镊子，去离子（DI）水，疏水溶液（乙醇中2%硅烷），真空泵和乙醇溶液。有关详细信息 ，请参阅材料表 。
   注意:酸性清洁液具有剧毒，会引起皮肤和眼睛腐蚀/刺....

Results

测量误差的主要来源来自毛细管，这些毛细管在切割过程（图5A，B）或涂层过程（图5D）中具有缺陷。这两种类型的缺陷都会导致光学图像分析系统在确定气泡形状和尺寸时出现错误，从而导致表面张力值不准确。在将毛细管插入CPM之前，在将毛细管拉出并涂覆在光学显微镜下后，仔细检查每个毛细管非常重要。必须丢弃毛细管，但可以对包衣不良的毛细管进行酸洗并重新包衣，以改善毛细管末端的气泡固定（协议的步骤2）。如果末端切口完全垂直于毛细管（图5C），并且气泡销直接位于毛细管的末端（图5E），则毛细管效果最佳。毛细管上的疏水涂层在固定时使用时效果会降低，需要重新清洁和重新涂覆毛细管。

表面活性剂吸附与时间的代表性数据如图 6所示。 先前的实验技术如用于测量表面活.......

Discussion

CPM/CFM组合是检查界面动力学、平衡和形态的强大工具。此协议描述了使用 CPM/CFM 获取数据所需的步骤。

图2 显示了带有毛细管、溶剂和热交换通道的电池设计。溶剂交换的入口应位于电池的底部，而出口应位于顶部，以使电池在交换过程中不会溢出。在实践中，同一蠕动泵的入口和出口流量可能略有不同。这种电池设计的一个常见问题是从电池泄漏。这通常是由电池和其中一个连接之间的连接不良引起的，但如果所有连接都是干燥且未泄漏，则可能是由于电池周围的螺栓过度拧紧导致电池的载玻片出现裂缝。

图3 显示了各种泵和电池之间的连接，以及电池与CFM和CPM目标的对齐情况。CPM相机（4）用于在操作过程中对气泡形状进行成像。CPM相机必须配备光学滤光片，以防止CFM激发激光进入CPM相机。否则，CFM激光会使CPM相机中的图像变得非常嘈杂，并且难以使用图像分析进行拟合。安全阀连接毛细管和微流体泵（7），并允许对泵和气压源进行更改，而.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 外径 Tygon 管	Fischer Scientific		管
A1RHD 多光子正置共聚焦显微镜	尼康		共聚焦显微镜
酸清洗液			硫酸和 Alnochromix 用 50% 体积的水稀释，等到澄清后
Alnochromix	Alconox	2510	与硫酸混合包装说明并稀释制成酸性清洗液
陶瓷玻璃切割	Sutter Instruments
氯仿	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		肺表面活性剂
Di Water			18.5 MΩ - cm
乙醇	任何		200 度 用于疏水，变性 用于清洁
Fiber-Lite 190 型光纤照明器	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	光源;其他光源也应正常工作
Flow EZ F69 mbar w/Link 模块	Fluigent	LU-FEZ-0069	微流体泵
Fluigent SDK VIs	CPM 虚拟接口所需的	Fluigent
橡胶垫圈			由 1 mm 厚的氟橡胶板加工而成，见图 3
气体过滤器	Norgren	F07-100-A3TG	放在微流体泵和压力调节器之间
气体调节器	Norgren	10R0400R	将压力从泵范围降低到泵的范围，连接到气体过滤器范围 2-120 psi
Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	硼硅酸盐玻璃外径 1.5 毫米内径 0.86 毫米
玻璃滑轨	任何		75 毫米 x 25 毫米
玻璃注射器	Hamilton	84878	25 μL 玻璃注射器
疏水剂	Sigma-Aldrich	667420	1H，1H，2H，2H-全氟-辛基三乙氧基硅烷 98%，其他疏水性三乙氧基硅烷 不
溶性表面活性剂	Avanti	850355C-200mg	16：0 DPPC 在氯仿中
LabVIEW 软件	National Instruments		2017
长波通滤光片	ThorLabs	FEL0650	650 nm 长波通滤光片，波长必须去除激发激光频率
Lyso-PC	Avanti	855675P	16：0 Lyso PC 1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱
Masterflex L/S 变速模拟混合泵系统 w/ Easy-Load II 泵头	Masterflex	HV-77916-20	蠕动泵
MATLAB	Mathworks		R2019
微量移液器拉拔器 P-1000	Sutter Instruments		毛细管拉拔器
微量张力计单元和支架			单元由 PEEK 加工而成，支架由铝加工而成，参见图 3 和 4
微量张力计物镜	尼康		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI 视觉显影模块	CPM 虚拟接口所需的	国家仪器
PEEK 手紧接头	IDEX	F-120x	10-32 锥形端口
PEEK 插头	IDEX	P-551	10-31 锥形端口
皮管尖端	Eppendorf	22492225	100 μL - 1000 μL，高压灭菌
塑料镊子	Thermo Scientific	6320-0010
塑料注射器	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
管道部件	Fischer Scientific		三通阀和其他管道部件，用于连接管道。
Research Plus 1 通道 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	微量移液器
硫酸	任意		用于酸清洗液
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	尼康		共聚焦显微镜 物镜
德州红 DHPE 三乙基氨盐	Thermo Fischer Scientific	1395MP	荧光团
真空泵	GAST	DOA-P704-AA