利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除肌肉细胞系

摘要

本方案介绍了如何从设计向导RNA开始，到细胞克隆及基因敲除克隆的鉴定，利用CRISPR/Cas9技术生成敲除型成肌细胞。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 的一个重要应用是构建基因敲除细胞系，特别是用于研究在遗传诊断过程中发现的与疾病相关的新基因/蛋白质的功能。在构建此类细胞系时，需要解决两个关键问题：一是将CRISPR工具（Cas9和向导RNA）高效导入目标细胞，二是将Cas9的活性限制在特异性删除目标基因的范围内。本文所述的方案专门针对难以转染的细胞（如肌肉细胞）中CRISPR工具的导入。该方案基于使用慢病毒进行递送，所用质粒公开可得，并详细描述了所有克隆步骤，以靶向特定目的基因。Cas9活性的控制则采用了一种此前报道的KamiCas9系统的改良版本，即通过慢病毒转导表达靶向Cas9的向导RNA，从而逐步消除Cas9的表达。本方案已成功应用于构建RYR1基因敲除的人源肌肉细胞系，并在蛋白水平和功能水平上对该细胞系进行了进一步表征，以确认这一关键钙离子通道基因的敲除效果；该基因参与肌肉细胞内钙释放及兴奋-收缩耦联过程。本文所述方法可轻松推广至肌肉细胞或其他难转染细胞中其他基因的研究，为在人源细胞中研究这些基因提供有价值的工具。

引言

随着基因测序技术的进步以及在特定组织中发现功能未知基因的突变，建立相应的细胞模型以研究新靶基因的功能并验证其在相关病理生理机制中的作用，已成为一项至关重要的工具。此外，这些模型对于未来的治疗开发具有重要意义^1,2，并且相较于直接构建基因敲除动物模型，它们提供了一种符合国际减少实验动物使用建议的可行替代方案。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑是目前最强大的工具之一，已成功用于构建大量基因敲除/敲入模型，而基于CRISPR/Cas9的靶向基因验证也是该技术应用最为广泛的领域之一³。基因编辑的成功依赖于将CRISPR工具（即向导RNA和核酸酶Cas9）有效递送至目标细胞模型，然而在许多转染困难的细胞（如肌细胞）中，这一过程仍具挑战性⁴。使用病毒载体（通常为慢病毒）可克服这一难题，其主要优势在于能够高效转导多种细胞类型并递送外源基因。但其主要缺点是外源基因会整合到宿主细胞基因组中，可能导致整合位点附近基因发生改变，并引起外源基因的持续表达；以核酸酶Cas9为例，其长期表达可能带来严重的细胞损伤⁵。Merienne及其同事提出了一种巧妙的解决方案⁶，即向细胞中导入一种靶向Cas9基因自身的向导RNA，从而实现Cas9的失活。本文介绍的是一种对该策略的改进方案，提供了一种用户友好且用途广泛的实验流程，可用于在转染困难的细胞中实现几乎任意基因的敲除。

本方案旨在诱导永生化肌肉细胞中目标基因的失活。该方法可用于在不同类型的永生化细胞中敲除任何目标基因。本文所述方案包括设计向导RNA并将其克隆至慢病毒质粒、在慢病毒载体中构建CRISPR工具、利用不同慢病毒感染细胞，以及对细胞进行单克隆筛选以获得均一的基因编辑细胞系。

利用本实验方案，已成功构建出缺失1型兰尼碱受体（RyR1）的永生化人骨骼肌细胞系。RyR1是一种参与细胞内钙释放及肌肉收缩的关键钙离子通道⁷。该基因的敲除（KO）已在蛋白水平通过Western blot检测确认，并在功能水平通过钙成像技术加以验证。

方案

肌肉活检样本由研究用组织库（Myobank，欧洲生物库网络 EuroBioBank 的合作单位，法国巴黎）提供，采集过程符合欧洲建议和法国法律法规。所有个体均签署了书面知情同意书。永生化成肌细胞由 V. Mouly 博士（法国巴黎肌病研究所）协助制备，相关实验方案已获肌病研究所伦理委员会（MESRI，编号 AC-2019-3502）批准。

1. CRISPR 引导序列设计

1. 确定待删除基因的区域。使用基因组浏览器工具（如 ensembl.org 或 genome.ucsc.edu）搜索其基因组序列，并确定待删除区域两侧用于查找向导RNA（gRNA）的两个区域的染色体坐标。
   1. 对于本实验所用的基因，按以下步骤获取RYR1基因的FASTA序列以及第101号外显子的序列：在ensembl中搜索最新版本人类基因组中的RYR1基因，选择第一个条目，点击蛋白质编码序列的转录本，然后点击外显子（Exons），进入该基因外显子列表页面。
   2. 点击下载序列（Download Sequence），选择仅基因组序列（Only Genomic Sequence）以下载整个基因的完整共识序列。向下滚动该基因的外显子和内含子列表，选择目标外显子。
   3. 在基因中找到对应的核苷酸序列。选择待删除外显子上下游紧邻的内含子核苷酸序列，用于后续gRNA的搜索。
2. 使用在线工具（如 Crispor.tefor.net⁸），在步骤1.1中确定的区域（即待删除区域上下游的内含子）设计两条gRNA，分别称为向导1（guide 1）和向导2（guide 2）。选择两条间隔数百个碱基对（bp）的gRNA，每条gRNA序列长度恰好为20个核苷酸，不包含原间隔序列邻近基序（PAM）。应选择脱靶效应最小的最优向导序列。向导设计示例见图1。
   1. 两条向导之间的序列预期将被删除，从而导致目标基因的敲除。因此，应选择合适的向导位置，使其删除目标基因中的关键序列或关键外显子。需确认被删除的序列/外显子并非仅存在于该基因的某个可变剪接转录本中，且其编码的蛋白区域具有重要功能，以确保删除后可实现功能性基因敲除。
      注意：尽管Cas9的切割位点通常预测位于原间隔序列邻近基序（PAM）上游3 bp处，但切割也可能发生在更远的位置。因此，一个稳妥的策略是不依赖切割位点的精确定位（例如避免仅依赖内含子中的切割）。
3. 确定每条gRNA（不含PAM）的反向互补（RC）序列，从而获得以下序列：向导1（Guide 1）和向导1反向互补序列（Guide 1-RC），向导2（Guide 2）和向导2反向互补序列（Guide 2-RC）。
4. 订购表1中列出的引物以进行质粒克隆。在整个实验流程中，使用浓度为10 nM的引物溶于无菌H₂O中。
   ​注意：这些引物中添加在gRNA序列两端的序列（加粗并下划线部分）分别对应质粒上向导序列、启动子及反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）前后区域的序列，不应修改，以确保引物与质粒之间具有良好的重叠区域。

2. 质粒克隆

注意：在此步骤中，gRNA 将被插入到质粒骨架中以用于慢病毒的生产。首先使用重叠引物通过连续的聚合酶链式反应（PCR）扩增出编码两个 gRNA 的片段，然后将该新片段插入慢病毒骨架质粒 #87919 中。

1. 获取以下质粒：质粒 #87919，编码慢病毒载体中的 CRISPR 指导 RNA；质粒 #87904，编码慢病毒载体中的 SpCas9 序列。
2. 盒式结构构建
   注：克隆流程总结于图 2。
   1. 进行 PCR（A）反应，体系包含 2 µL 质粒 #87919、2 µL primer_XmaIF、2 µL primer_Guide1R、25 µL 聚合酶混合液和 19 µL H₂O。运行以下 PCR 程序（程序 1）：98 °C 预变性 5 分钟，随后进行 30 个循环：98 °C 变性 30 秒，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分 45 秒，最后 72 °C 终延伸 7 分钟。步骤 1.4 中所述引物的 Tm 值为 60 °C。
      注：尽管程序 1 中的延伸时间相对较长，但选择该时长是为了确保生成足量正确大小的产物。实际上，由于质粒中存在重复序列（在 RNA 指导序列后的 tracrRNA 序列在质粒 #87919 中重复了三次），目标 DNA 的 PCR 扩增较为困难，并会在后续 PCR 中产生额外的小片段条带。因此，由于不同 PCR 产物之间的竞争，要么延长延伸时间（以利于最长片段的扩增并最终获得足够纯化的材料），要么对长片段使用降落 PCR（程序 2）（如步骤 2.2.6 中 PCR（最终）所述）。
   2. 在 TBE 缓冲液中用 1% 琼脂糖凝胶分离 PCR 产物，切下并纯化 300 bp 片段。使用专用试剂盒按照制造商说明进行纯化，最终洗脱体积为 20 µL。可直接使用纯化后的片段，或在 -20 °C 保存以用于步骤 2.2.5。
   3. 进行 PCR（B）反应，体系包含 2 µL 质粒 #87919、2 µL primer_Guide1F、2 µL primer_Guide2R、25 µL 聚合酶混合液和 19 µL H₂O，使用 PCR 程序 1。在 TBE 缓冲液中用 1% 琼脂糖凝胶分离 PCR 产物，切下并纯化 400 bp 片段，洗脱于 20 µL 洗脱缓冲液中。可直接使用纯化后的片段，或在 -20 °C 保存以用于步骤 2.2.5。
   4. 进行 PCR（C）反应，体系包含 2 µL 质粒 #87919、2 µL primer_Guide2F、2 µL primer_BlpIR、25 µL 聚合酶混合液和 19 µL H₂O，使用 PCR 程序 1。在 TBE 缓冲液中用 1% 琼脂糖凝胶分离 PCR 产物，切下并纯化 600 bp 片段，洗脱于 20 µL 洗脱缓冲液中。可直接使用纯化后的片段，或在 -20 °C 保存以用于步骤 2.2.6。
      注：由于引物与质粒中重复区域发生杂交（如步骤 2.2.1 注释所述），可能会出现另一条约 900 bp 的条带。若存在，应弃去该条带。
   5. 进行 PCR（D）反应，体系包含 2 µL PCR A 洗脱液（来自步骤 2.2.2）、2 µL PCR B 洗脱液（来自步骤 2.2.3）、2 µL primer_XmaIF、2 µL primer_Guide2R、25 µL 聚合酶混合液和 19 µL H₂O，使用 PCR 程序 1。在 TBE 缓冲液中用 1% 琼脂糖凝胶分离 PCR 产物，切下并纯化 700 bp 片段，洗脱于 20 µL 洗脱缓冲液中。可直接使用纯化后的片段，或在 -20 °C 保存以用于步骤 2.2.6。
      注：由于引物与重复区域发生杂交，可能在 >1,000 bp、400 bp 和 300 bp 处出现其他条带，应弃去。
   6. 进行 PCR（最终）反应，体系包含 4 µL PCR C 洗脱液（来自步骤 2.2.4）、4 µL PCR D 洗脱液（来自步骤 2.2.5）、4 µL primer_XmaIF、4 µL primer_BlpIR、50 µL 聚合酶混合液和 34 µL H₂O。所用程序如下（PCR 程序 2）：98 °C 预变性 5 分钟；6 个循环：98 °C 变性 30 秒，66 °C 退火（每个循环退火温度降低 1 °C），72 °C 延伸 1 分 45 秒；再进行 35 个循环：98 °C 变性 30 秒，60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分 45 秒，最后 72 °C 终延伸 5 分钟。
      注：此最终扩增的 PCR 程序为降落 PCR，与之前的程序不同，原因是最终扩增片段较大，且在每个指导序列后均含有两个重复的 tracrRNA 序列。
   7. 在 TBE 缓冲液中用 1% 琼脂糖凝胶分离 PCR 产物，切下并纯化最终盒式结构，其迁移位置约为 1,300 bp，洗脱于 20 µL 洗脱缓冲液中。对洗脱产物进行定量。可直接使用纯化后的片段，或在 -20 °C 保存以用于步骤 2.3.2.1。此即最终将插入慢病毒质粒的产物。
      注：可能在 >1000 bp、400 bp 和 300 bp 处出现其他片段，对应于不完整的 PCR 产物，应弃去。
3. 将 gRNA 盒式结构插入慢病毒质粒骨架。
   1. 通过限制性内切酶 XmaI 和 BlpI 双酶切线性化质粒 #87919。
      1. 反应体系包含 15 µL 推荐缓冲液、15 µL 质粒（1 µg/µL）、7.5 µL BlpI 酶（10 U/µL）、7.5 µL XmaI 酶（10 U/µL）和 112.5 µL H₂O。37 °C 孵育 1 小时，随后 65 °C 孵育 20 分钟。将全部反应产物上样至 1% 琼脂糖凝胶，切下并使用适当试剂盒纯化约 10 kb 的质粒片段。洗脱于 20 µL 缓冲液中，并通过光密度测定对洗脱产物进行定量。
         注：应使用适用于大片段 DNA 的纯化方案，例如 Sun 等人⁹所述方案。
   2. 连接 gRNA 盒式结构与质粒。将步骤 2.2.7 获得的 gRNA 盒式结构与步骤 2.3.1.1 获得的线性化质粒混合，加入 2 µL 连接酶和 H₂O 至终体积 10 µL。50 °C 孵育 15 分钟，获得最终质粒，命名为 p_guides。
      注：gRNA 盒式结构的 DNA 用量应在 50–100 ng 之间，质粒用量应在 100–200 ng 之间，摩尔比为 2:1。
4. 取 2 µL 新制备的质粒转化化学感受态 E. Coli（如 Stbl3（50 µL）或 XL10-Gold），在 37 °C 无抗生素条件下培养 1 小时后，涂布于含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板。37 °C 过夜培养。挑取数个单菌落，使用商业试剂盒按照制造商说明进行质粒小提。
5. 以小提质粒 DNA 为模板，使用 Primer_XmaI 和 Primer_BlpR 进行 PCR 扩增，PCR 程序采用程序 1（见图 2）。在 TBE 缓冲液中用 1% 琼脂糖凝胶分离 PCR 产物。挑选数个（约 5 个）具有预期大小（约 1300 bp）条带的菌落。
6. 对筛选出的菌落进行 DNA 测序，使用 Primer_XmaI 或 Primer_BlpR，以确认 gRNA 盒式结构的正确插入。
   ​注：其中一个测序验证正确的菌落将用于后续研究，该质粒命名为 p_guides。
7. 从步骤 2.2（盒式结构构建）开始重复操作，使用 Primers-Killer F 和 R，以及 Primers-mCherry F 和 R。选取一个测序验证正确的菌落用于进一步分析。该质粒命名为 p_Killer。

3. 慢病毒生产

1. 使用无内毒素大提试剂盒，按照制造商说明书大量制备并纯化所有必需的质粒。将质粒分装为 2 µg/µL 的等份，于 -20 °C 保存。
2. 细胞准备（第1天）
   1. 准备18个145 cm²培养皿，每皿接种1 × 10⁶个HEK293细胞，加入16 mL培养基，培养基成分为含高糖丙酮酸的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。于37 °C、5% CO₂培养箱中扩增细胞3天。
      注意：慢病毒的制备必须在生物安全二级（BSL2）实验室中小心操作，使用适当的防护装备，包括一次性防护服、防护帽和手套。所有实验均须在带有滤芯吸头的层流罩（BSLII安全柜）内进行。所有含慢病毒的溶液及使用过的塑料/玻璃废弃物必须用70%乙醇或其他病毒灭活剂进行灭活处理。
3. 细胞转染（第4天）
   1. 检查细胞融合度，确保其达到60%–65%融合度。
   2. 为每块培养皿配制转染溶液：20.8 µg目标质粒（p-guides、p-Killer或pCas9 #87904）、4.8 µg编码包膜蛋白的质粒（VSV-G, #8454）、20.8 µg慢病毒包装质粒psPAX2（#12260）、136 µL磷酸钙，用H₂O定容至终体积1,000 µL。将此溶液在持续振荡下逐滴加入1 mL 2x HEPES缓冲盐水（HBS）中。
      注意：为确保试剂的最佳配制效果，不要一次性为所有培养皿配制混合液；建议每次为六块培养皿配制混合液，例如对于18块培养皿，分三次每次配制六块的量。
   3. 室温（RT）孵育至少10分钟，然后将2 mL溶液逐滴加入细胞中。通过轻轻前后、上下晃动培养皿使转染试剂混匀，于37 °C、5% CO₂条件下孵育至少5小时。
      注意：从此时起直至慢病毒制备结束，需额外佩戴防护装备，包括第二副手套、防护袖套和一次性胸板。
   4. 转染5小时后，吸除培养皿中的培养基，并用PBS清洗以去除转染试剂。每皿加入12 mL新鲜培养基，于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育48小时。
4. 病毒颗粒收集（第6天）
   1. 收集所有培养皿的培养基并混合。于4 °C、800 × g离心5分钟，以沉淀细胞碎片。使用0.45 µm滤膜过滤上清液（需使用多个滤膜）。
   2. 在4 °C下使用水平转子于68,300 × g离心2小时。弃去上清液，将离心管倒置于安全柜内的纸巾上5–10分钟，尽可能去除残留液体。每管沉淀加入100 µL HEK增殖培养基。于4 °C静置至少2小时后，通过反复吹打重悬沉淀。将所有重悬的沉淀混合在一起。
      注意：分装前，沉淀可在4 °C培养基中过夜保存。
   3. 根据用途将慢病毒分装为10 µL或25 µL，使用液氮速冻，于-80 °C保存。已解冻的分装样品不得再次冷冻。
5. 使用其他目标质粒重复步骤3.2至3.4，以制备LV-guides、LV-Killer和LV-Cas9。
   ​注意：作为替代方案，慢病毒也可从公司或病毒核心设施购买获得。

4. 慢病毒滴定

注意：病毒滴定在 HEK293 细胞上进行。滴定对于在后续步骤中向目标细胞引入精确数量的慢病毒颗粒（无论慢病毒批次如何）至关重要。能够有效转导细胞的病毒颗粒数量称为感染复数（multiplicity of infection, MOI）：MOI 10 表示每个细胞引入 10 个病毒颗粒。由于冻融循环会影响慢病毒的活性，滴定应使用一份冻存的慢病毒分装样品进行，后续每个实验也应使用同一批次病毒库中的新分装样品。此处描述了一种滴定方法，但也可采用其他方法。

1. 第1天，在五个底部带有玻璃盖玻片的35 mm培养皿中，每皿接种1 × 10⁵个细胞，另准备两个无盖玻片的35 mm培养皿。
2. 第2天，从两个无盖玻片的培养皿中收集细胞，经胰酶消化后计数，确定每皿平均细胞数量（N）。
3. 将慢病毒用增殖培养基按1/10比例稀释，取100 µL。向五个培养皿中分别加入不同体积的稀释病毒液，范围为1至50 µL。本方案中，五个培养皿所用病毒液体积分别为：1 µL、5 µL、10 µL、20 µL、50 µL。于37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时。
4. 第4天，将带有盖玻片的培养皿在室温下用4%多聚甲醛固定20至30分钟。对于LV-Cas9，使用含0.1% Triton X100的磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下透化10分钟，再用含0.1% Triton X100、2%山羊血清和0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液在室温下封闭20分钟，随后在室温下用抗V5一抗（1/400稀释）孵育45分钟，再与荧光标记的二抗在室温下孵育30分钟。最后用Hoescht（10 µg/mL PBS溶液）在室温下染核10分钟。
5. 将盖玻片封片后，使用配备20倍物镜的荧光显微镜观察。对于LV-guides和LV-Killer，固定后直接进行核染色并封片。对每张盖玻片，在视野中计数总细胞核数（即总细胞数）以及标记阳性的细胞数（V5或mCherry阳性），并计算每张盖玻片中标记细胞的比例。
6. 选择一张转导细胞比例不低于10%且不超过50%的盖玻片，确定该盖玻片的转导效率（X），并记录达到此效率所用的稀释病毒体积（V，单位为µL）。
   
7. 根据以下公式计算病毒滴度（以感染性颗粒数表示，单位为ip/mL）：
   
   其中稀释倍数为第4.3步中慢病毒的稀释比例。在HEK细胞中测定，我们常规获得LV-Cas9的最终滴度为1 × 10⁹ ip/mL，LV-guide的最终滴度为1 × 10¹⁰ ip/mL。

5. 成肌细胞转导

注意：将之前制备的三种慢病毒依次转导至永生化成肌细胞中。细胞维持在低于50%的密度，培养于增殖培养基中，培养基成分为添加了20%胎牛血清、2%青霉素/链霉素和2% Ultroser G的Ham's F10培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养。

1. 根据以下公式，确定使用 MOI 10 处理选定数量细胞所需的慢病毒体积（LV-Cas9 和 LV-guides），以及使用 MOI 20 处理 LV-killer 所需的体积：
   
   注意：在平行实验中，已使用对照慢病毒（lenti-GFP）比较了成肌细胞与 HEK 细胞的转导效率，我们发现与 HEK 细胞相比，有效转导一个成肌细胞所需的慢病毒量约为其五倍。因此，在 HEK 细胞上测定的 MOI 10 相当于每个成肌细胞仅接触两个病毒颗粒。此处使用的 MOI 值均基于 HEK 细胞测定结果计算。
2. 第 1 天，在 96 孔板中每孔接种 10,000 个细胞，每孔加入 100 µL 增殖培养基。第 2 天，在生物安全柜内向每孔加入步骤 5.1 中计算出的适当体积的 LV-guides 和 LV-Cas9 进行转导。将细胞放回培养箱中继续培养至第 7 天。
   注意：特别是对于 LV-Cas9，使用高于 MOI 25 的感染复数可能不会提高编辑细胞的数量，反而因慢病毒浓度过高导致细胞死亡增加。
3. 第 7 天，进行胰酶消化并计数细胞。将细胞以 40% 至 50% 的汇合度接种至新培养板中，并放回培养箱。5 小时后，以 MOI 20（体积按步骤 5.1 计算）用 LV-Killer 对细胞进行转导。转导后扩增细胞 5 至 10 天，至少传代两次，并始终维持细胞在低于 <50% 的低汇合度。当细胞生长恢复至正常状态（通过细胞分裂时间评估）时，即可进入下一步——细胞克隆。
   ​注意：转导后细胞增殖速度可能略有减慢。正常细胞生长状态可在本实验操作前通过测定细胞分裂时间进行预估。

6. 细胞克隆

注意：由于成肌细胞的转导较为困难，即使使用慢病毒，其转导效率也无法达到100%，因此必须进行细胞克隆，以获得完全校正的细胞系。该过程仅适用于永生化细胞，或可在数周至数月内培养并扩增的细胞。

1. 用胰酶消化并计数细胞。将细胞用增殖培养基稀释至10个细胞/mL，每孔加入100 µL培养基，按每孔1个细胞接种到96孔板中。
   注意：接种的板数取决于预期基因编辑效率，通常使用2至10块板。
2. 监测细胞生长情况，并逐步将每个孔中的细胞扩增至更大的培养皿中，直至至少达到35 mm培养皿，同时保持成肌细胞的融合度低于50%。此步骤可能持续2至6周，具体时间取决于所用细胞类型及其在单孔中分离后的增殖能力。

7. 克隆筛选

注意：此步骤用于鉴定哪些生长的克隆已被正确修饰。

1. 设计一组引物，包括位于第一个向导序列之前的引物（Primer_BeforeGuide1F）和位于第二个向导序列之后的引物（Primer_AfterGuide2R），以扩增包含潜在修饰序列的区域。此处所用引物见表1。
2. 从每个克隆中收集细胞，保留至少300,000个细胞用于后续扩增，并对剩余细胞采用任何标准方法提取基因组DNA。
   1. 若培养的克隆数量较多，为剔除非编辑克隆，可将五个克隆的细胞混合于同一管中进行DNA提取，并通过PCR快速检测。根据需要重复此步骤。随后，将含有编辑细胞的混合样本进一步拆分，进行单个克隆分析。
3. 通过以下方法进行PCR编辑验证：在PCR反应体系中加入1 µL Primer_BeforeGuide1F、1 µL Primer_AfterGuide2R、12.5 µL聚合酶混合液、3 µL基因组DNA和7.5 µL H₂O。按照聚合酶制造商说明及引物参数在PCR仪中进行扩增。在1%琼脂糖凝胶上电泳，以鉴定编辑成功的克隆。
4. 通过测序进一步验证编辑效果：对筛选出的克隆进行Sanger测序，确认缺失情况，并明确每个克隆中编辑的具体方式。保留多个编辑克隆，以确保仅目标基因被修饰且为所观察到的生理效应的原因；同时保留一个未编辑克隆，作为后续实验中的对照克隆（CTRL）。
5. 扩增筛选出的克隆：当各克隆细胞融合度达到约50%时，用胰蛋白酶消化细胞并接种至更大的培养皿中，持续扩增至足以进行生化与功能表征的细胞数量（通常每个克隆超过1 × 10⁶个细胞），并为每个克隆保存冻存样品以备后续使用。

8. 编辑后克隆的表征

注意：在挑选出若干克隆并经DNA测序确认后，可通过Western blot在蛋白质水平确认目标基因的缺失，若有针对该基因的细胞功能检测方法，也可在功能水平进行验证。以RYR1基因敲除（KO）为例，由于RyR1是一种钙离子通道，其功能表征可通过培养细胞的钙成像实验来完成。

1. 编辑克隆中的蛋白表达
   注意：RyR1 仅在分化的成肌细胞中表达¹⁰。已通过 Western blot 在成肌细胞中评估其表达，以确认 RyR1 蛋白水平的缺失以及 Cas9 蛋白的缺失。
   1. 将 200,000 个细胞接种于 35 mm 培养皿中，培养皿表面经层粘连蛋白包被（包被面积约为 1.76 cm²，对应于在 PBS（含钙）中浓度为 10 mg/mL 的层粘连蛋白 200 µL 液滴）。细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 2–3 小时贴壁后，更换为分化培养基（由低糖 DMEM + 10% 马血清 + 1% 青霉素/链霉素组成），并将细胞放回培养箱继续培养 6 天。
   2. 分化 6 天后，用 200 µL 含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液收集并裂解细胞。采用 Folin-Lowry 法测定蛋白浓度¹¹。
   3. 取 15 µg 蛋白，在室温下用 Laemmli 变性缓冲液变性 30 分钟后，上样至 5%–15% 的梯度丙烯酰胺凝胶。电泳分离后，在 0.8 V 条件下将蛋白转移至 Immobilon P 膜，持续 4 小时¹¹。
   4. 将膜在含 0.1% Tween 20 和 5% 脱脂奶粉的 PBS 中室温封闭 30 分钟后，加入用相同缓冲液稀释的一抗，室温孵育 2 小时或 4 °C 过夜。用 PBS-0.1% Tween 20 洗涤膜 5 次，每次 5 分钟，随后加入二抗，室温孵育 1 小时。所用一抗包括：抗 V5 标签抗体（稀释度：1/5000）用于检测 Cas9，抗 GAPDH 抗体（稀释度：1/1000）作为上样对照，抗 RyR1 抗体^12,13（稀释度：1/10,000），抗 DHPR α1 亚基抗体（稀释度：1/1000）以及抗肌球蛋白重链 MF20 抗体（稀释度：1/1000）。
   5. 用 PBS-0.1% Tween 20 洗涤膜 5 次，每次 5 分钟，吸干多余液体后加入化学发光底物。按照底物供应商推荐的方法检测化学发光信号。
2. 编辑克隆的功能表征
   注意：RyR1 的功能通过钙成像技术在由对照（CTRL）或敲除（KO）克隆衍生的分化成肌细胞中进行评估¹⁴。
   1. 将 50,000 个细胞接种于 35 mm 培养皿中央，接种面积为 0.2 cm²，培养皿经层粘连蛋白包被（包被面积由 50 µL 浓度为 10 mg/mL 的层粘连蛋白液滴覆盖）。按照步骤 8.1.1 所述诱导分化 6 天。每种刺激条件准备三块培养皿，以获得生物学三重复。
   2. 用 50 µL fluo 4-direct 溶液（以分化培养基 1:1 稀释）负载成肌细胞，在 37 °C 孵育 30 分钟。用含 1 mg/mL 葡萄糖的 KREBS 缓冲液清洗细胞两次。
   3. 使用倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜（配备 10 倍物镜）检测荧光变化。将培养皿置于显微镜载物台上，以每秒 1 帧的速度连续采集 90 秒的图像。
   4. 在第 25 帧时移除剩余 KREBS 缓冲液，并加入 2 mL KCl（终浓度 140 mM）以诱导膜去极化，或加入 2 mL 4-CmC（终浓度 500 µM）直接激活 RyR1。确保记录视野中至少包含 10 个成肌细胞。
   5. 使用专用软件量化每个成肌细胞的荧光变化。每皿选择至少 10 个成肌细胞进行分析（理想情况下每皿 20–30 个），沿每个成肌细胞的长轴绘制一条线（或定义一个感兴趣区域，ROI），并收集所有帧中沿该线的荧光强度 F。
   6. 确定初始荧光值 F0，对应第 1 至第 24 帧。绘制 (F-F0)/F0 随时间（0–90 秒）的变化曲线。重复实验三次，以获得来自三个独立培养样本中至少 90 个成肌细胞的荧光变化数据。合并所有 90 个成肌细胞的结果，计算每个时间点 (F-F0)/F0 的均值 ± 标准误（SEM）。量化每种刺激条件下各克隆钙释放的峰值幅度。

结果

本方案应用于来自健康受试者的永生化成肌细胞¹⁵（即所谓的人类成肌细胞，简称 HM 细胞），其中 RyR1 已有前期研究表征¹⁶，旨在敲除编码 RyR1 蛋白的 RYR1 基因。向导 RNA 的设计目标是删除包含基因第101外显子部分区域及第101内含子的序列。预计第101外显子部分区域的缺失将导致阅读框的破坏。此外，第101外显子编码蛋白的孔道结构域，因此对于形成功能性钙离子通道至关重要。许多患有严重 RyR1 相关肌病的患者在该基因区域存在突变⁷。我们使用 Crispor 软件预测并筛选出脱靶效应最少且编辑效率最高的向导 RNA。为确保大部分细胞实现基因敲除，并便于通过 PCR 检测编辑后克隆中的缺失情况，我们选择在同一病毒载体中同时使用两条向导 RNA。两条选定的向导 RNA（见表2和图1）分别位于第101外显子的末端和第101内含子的起始端，导致326 bp片段的缺失及随后的读码...

讨论

对参与病理过程但功能未知的基因进行表征，其关键步骤之一是建立相关的细胞模型以研究这些基因的功能。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的研究领域正在呈指数级增长，而本文所介绍的基因敲除模型的构建正是其中应用最广泛的技术之一。在此背景下，我们提出了一种通用的实验方案，用于构建针对任意目的基因的人源细胞系敲除模型，从而能够在相关的人类细胞模型中对该基因进行功能表征。本方案适用于永生化成肌细胞以及诱导多能干细胞（iPSC），因此理论上可应用于构建任何目的基因的人源细胞敲除模型。

该方法的局限性在于，应将其应用于永生化细胞，因为该过程需要数周的培养、细胞克隆以及多次连续扩增。或者，也可使用能够扩增并维持培养数周至数月的细胞。采用此方法，针对目的基因（此处为 RYR1 基因）敲除的人类永生化肌肉细胞系可在约3至4个月内构建完成（不包括细胞功能表征所需时间）。

该策略适用于难以转染的细胞（如肌细胞），因为它依赖慢病毒将所有工具导入靶细胞，因此比转染或电穿孔等其他方法更有效。其主要缺点是会整合到宿主基因组中；为避免慢病毒对...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CACNA1S抗体	Sigma-Aldrich	HPA048892	一抗
Blp I	NE BioLabs	R0585S	限制性内切酶
CalPhos 哺乳动物转染试剂盒	Takara	631312	转染试剂盒
Easy blot 抗小鼠IgG	GeneTex	GTX221667-01	HRP二抗
Easy blot 抗兔IgG	GeneTex	GTX221666	HRP二抗
Fluo-4 direct	Molecular Probes	F10472	钙成像
GAPDH(14C10) 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	#2118	一抗
HindIII	Fermentas	ER0501	限制性内切酶
InFusion HD Precision Plus	Takara	638920	连接试剂盒
MasterMix Phusion High Fidelity with GC	ThermoFisher Scientific	F532L	含高保真Taq DNA聚合酶和dNTPs的PCR反应混合液
肌球蛋白重链抗体	DHSB	MF20	一抗
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	REF 740424	质粒纯化用大提试剂盒
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609	DNA纯化
NucleoSpin Tissue	Macherey-Nagel	740952	从细胞中提取DNA的试剂盒
One Shot Stbl3 化学感受态 E. coli	ThermoFisher Scientific	C737303	化学感受态细胞
质粒 #87904	Addgene	87904	编码SpCas9的慢病毒质粒（用于LV-Cas9）
质粒 #87919	Addgene	87919	用于插入向导序列盒的慢病毒骨架质粒（用于LV-guide-target）
质粒 #12260	Addgene	12260	编码慢病毒包装蛋白GAG POL的慢病毒质粒
质粒 #8454	Addgene	8454	编码包膜蛋白的慢病毒质粒，用于产生慢病毒和MuLV逆转录病毒颗粒
V5标签单克隆抗体	Invitrogene	R96025	一抗
XL10-Gold 超感受态细胞	Agilent	200317	化学感受态细胞
Xma I	NE BioLabs	R0180S	限制性内切酶