利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除肌肉细胞系

摘要

本方案介绍了如何从设计向导RNA开始，到细胞克隆及基因敲除克隆的鉴定，利用CRISPR/Cas9技术生成敲除型成肌细胞。

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 的一个重要应用是构建基因敲除细胞系，特别是用于研究在遗传诊断过程中发现的与疾病相关的新基因/蛋白质的功能。在构建此类细胞系时，需要解决两个关键问题：一是将CRISPR工具（Cas9和向导RNA）高效导入目标细胞，二是将Cas9的活性限制在特异性删除目标基因的范围内。本文所述的方案专门针对难以转染的细胞（如肌肉细胞）中CRISPR工具的导入。该方案基于使用慢病毒进行递送，所用质粒公开可得，并详细描述了所有克隆步骤，以靶向特定目的基因。Cas9活性的控制则采用了一种此前报道的KamiCas9系统的改良版本，即通过慢病毒转导表达靶向Cas9的向导RNA，从而逐步消除Cas9的表达。本方案已成功应用于构建RYR1基因敲除的人源肌肉细胞系，并在蛋白水平和功能水平上对该细胞系进行了进一步表征，以确认这一关键钙离子通道基因的敲除效果；该基因参与肌肉细胞内钙释放及兴奋-收缩耦联过程。本文所述方法可轻松推广至肌肉细胞或其他难转染细胞中其他基因的研究，为在人源细胞中研究这些基因提供有价值的工具。

引言

随着基因测序技术的进步以及在特定组织中发现功能未知基因的突变，建立相应的细胞模型以研究新靶基因的功能并验证其在相关病理生理机制中的作用，已成为一项至关重要的工具。此外，这些模型对于未来的治疗开发具有重要意义^1,2，并且相较于直接构建基因敲除动物模型，它们提供了一种符合国际减少实验动物使用建议的可行替代方案。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑是目前最强大的工具之一，已成功用于构建大量基因敲除/敲入模型，而基于CRISPR/Cas9的靶向基因验证也是该技术应用最为广泛的领域之一³。基因编辑的成功依赖于将CRISPR工具（即向导RNA和核酸酶Cas9）有效递送至目标细胞模型，然而在许多转染困难的细胞（如肌细胞）中，这一过程仍具挑战性⁴。使用病毒载体（通常为慢病毒）可克服这一难题，其主要优势在于能够高效转导多种细胞类型并递送外源基因。但其主要缺点是外源基因会整合到宿主细胞基因组中，可能导致整合位点附近基因发生改变，并引起外源基因的持续表达；以核酸酶Cas9为例，其长期表达可能带来严重的细胞损伤⁵。Merienne及其同事提出了一种巧妙的解决方案⁶，即向细胞中导入一种靶向Cas9基因自身的向导RNA，从而实现Cas9的失活。本文介绍....

方案

肌肉活检样本取自组织研究库（Myobank，欧洲生物库网络 EuroBioBank 的合作单位，法国巴黎），符合欧洲建议和法国法律法规。所有个体均签署了书面知情同意书。永生化成肌细胞由 V. Mouly 博士（法国巴黎肌病研究所）协助制备，相关实验方案已获肌病研究所伦理委员会（MESRI，编号 AC-2019-3502）批准。

1. CRISPR 引导序列设计

1. 确定待删除基因的区域。使用基因组浏览器工具（如 ensembl.org 或 genome.ucsc.edu）搜索其基因组序列，并确定待删除区域两侧的染色体坐标，以寻找向导 RNA（gRNA）。
   1. 对于本实验所用的基因，按以下步骤获取 RYR1 基因的 FASTA 序列以及第 101 外显子的序列：在 ensembl 中搜索最新版本人类基因组中的 RYR1 基因，选择第一个条目，点击蛋白质编码序列的转录本，然后点击 Exons，进入该基因外显子列表页面。
   2. 点击 Download Sequence，选择 Only Genomic Sequence 以下载整个基因的完整共识序列。向下滚动该基因的外显子和内含子列表，选择目标外显子。
   3. 在基因中找到对应的核苷酸序列。选择待....

结果

本方案应用于来自健康受试者的永生化成肌细胞¹⁵（即所谓的人类成肌细胞，简称HM细胞），其中RyR1已得到先前表征¹⁶，旨在敲除编码RyR1蛋白的RYR1基因。向导RNA的设计目标是删除包含基因第101外显子部分区域及第101内含子的序列。预计第101外显子部分区域的缺失将导致读码框中断。此外，第101外显子编码蛋白的孔道区域，因此对于功能性钙通道的形成至关重要。许多患有严重RyR1相关肌病的患者在该基因区域存在突变⁷。我们使用Crispor软件预测并选择最优向导RNA，以尽可能减少脱靶效应，同时保持最高编辑效率。我们选择在同一病毒载体中同时使用两条向导RNA，以确保大部分细胞实现基因敲除，并便于通过PCR检测编辑后克隆中的缺失情况。两条选定的向导RNA（见表2和图1）分别位于第101外显子末端和第101内含子起始端，导致326 bp片段的缺失及随后的读码框移位。这可确保编辑后的细胞为<.......

讨论

对参与病理过程但功能未知的基因进行表征，其关键步骤之一是建立相关的细胞模型以研究这些基因的功能。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的研究领域正在呈指数级增长，而本文所介绍的基因敲除模型的构建正是其中应用最广泛的技术之一。在此背景下，我们提出了一种通用的实验方案，用于构建针对任意目的基因的人源细胞系敲除模型，从而能够在相关的人类细胞模型中对该基因进行功能表征。本方案适用于永生化成肌细胞以及诱导多能干细胞（iPSC），因此理论上可应用于构建任何目的基因的人源细胞敲除模型。

该方法的局限性在于，应将其应用于永生化细胞，因为该过程需要数周的培养、细胞克隆以及多次连续扩增。或者，也可使用能够扩增并维持培养数周至数月的细胞。采用此方法，针对目的基因（此处为 RYR1 基因）敲除的人类永生化肌肉细胞系可在约3至4个月内构建完成（不包括细胞功能表征所需时间）。

该策略适用于难以转染的细胞（如肌细胞），因为它依赖慢病毒将所有工具导入靶细胞，因此比转染或电穿孔等其他方法更有效。其主要缺点是会整合到宿主基因组中；为避免慢病毒对.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CACNA1S抗体	Sigma-Aldrich	HPA048892	一抗
Blp I	NE BioLabs	R0585S	限制性内切酶
CalPhos 哺乳动物转染试剂盒	Takara	631312	转染试剂盒
Easy blot 抗小鼠IgG	GeneTex	GTX221667-01	HRP二抗
Easy blot 抗兔IgG	GeneTex	GTX221666	HRP二抗
Fluo-4 direct	Molecular Probes	F10472	钙成像
GAPDH(14C10) 兔单克隆抗体	Cell Signaling Technology	#2118	一抗
HindIII	Fermentas	ER0501	限制性内切酶
InFusion HD Precision Plus	Takara	638920	连接试剂盒
MasterMix Phusion High Fidelity with GC	ThermoFisher Scientific	F532L	含高保真Taq DNA聚合酶和dNTPs的PCR反应混合液
肌球蛋白重链抗体	DHSB	MF20	一抗
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	REF 740424	质粒纯化用大提试剂盒
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609	DNA纯化
NucleoSpin Tissue	Macherey-Nagel	740952	从细胞中提取DNA的试剂盒
One Shot Stbl3 化学感受态 E. coli	ThermoFisher Scientific	C737303	化学感受态细胞
质粒 #87904	Addgene	87904	编码SpCas9的慢病毒质粒（用于LV-Cas9）
质粒 #87919	Addgene	87919	用于插入向导序列盒的慢病毒骨架质粒（用于LV-guide-target）
质粒 #12260	Addgene	12260	编码慢病毒包装蛋白GAG POL的慢病毒质粒
质粒 #8454	Addgene	8454	编码包膜蛋白的慢病毒质粒，用于产生慢病毒和MuLV逆转录病毒颗粒
V5标签单克隆抗体	Invitrogene	R96025	一抗
XL10-Gold 超感受态细胞	Agilent	200317	化学感受态细胞
Xma I	NE BioLabs	R0180S	限制性内切酶