本实验方案描述了一种适用于水稻茎秆的透明化技术，该技术可克服因组织坚硬、厚实或呈层状结构而难以进行内部结构观察的问题。该方法能够实现对成年水稻植株进行连续且深层的荧光观察。
本文内容
摘要
摘要
近年来开发的透明化技术通过消除折射率不匹配并减少自发荧光物质，使得在保持植物组织内部结构完整的同时，实现其三维（3D）观察成为可能。水稻（Oryza sativa L.）作为单子叶植物的模式物种及全球重要的粮食作物，其透明化技术已成功应用于根和叶等较易观察的器官。尽管已有研究报道了在茎尖分生组织（SAM）和茎中的应用，但由于透明化溶液（CS）在这些组织中的渗透性较差，相关应用仍十分有限。透明化溶液在这些组织中效率低下，主要归因于维管束和表皮发育过程中茎组织的自发荧光、增厚和硬化，以及SAM被具疏水性的叶片层层包裹。本实验方案报道了一种透明化方法的优化流程，可实现从茎尖分生组织/幼穗到茎基部在发育过程中基因表达的连续性与三维观察。表达荧光蛋白报告基因的固定组织样本，使用振动切片机切割成适当厚度的组织切片。当达到合适厚度后，施加透明化溶液。通过特异性针对组织中心区域处理，显著提高了透明化溶液的渗透速率与均匀性，同时缩短了组织透明所需时间。此外，对切片后组织进行透明化处理，还能够从宏观角度观察整个茎部的内部结构。该方法有望应用于其他难以透明化的植物物种组织的深层成像研究。
引言
近年来开发的透明化技术使得在保持植物内部结构完整的同时观察其深层组织成为可能1,2,3。在双子叶模式植物Arabidopsis中，已有大量研究利用透明化技术消除折射率不匹配并去除自发荧光物质，从而开展荧光蛋白成像4,5,6。尽管在单子叶模式植物及全球重要农作物水稻（Oryza sativa L.）中也已有应用透明化技术7,8和实现细胞分辨率的三维成像的报道9，但这些研究主要局限于根、叶和茎尖分生组织（SAM）等相对较薄且柔软、易于观察的器官。
茎是构成维管植物地上部分的主要器官。在水稻中，茎由一系列垂直堆叠的"植物体节"组成，每个植物体节包括腋芽、叶片和茎秆10。在茎的顶端，茎尖分生组织（SAM）由中央未分化的干细胞构成。植物体节由源自SAM的细胞分化形成。当植株从营养生长阶段转入生殖生长阶段后，水稻茎秆伸长，SAM分化为幼穗10。这一发育转变伴随着茎秆及SAM/幼穗中多种基因表达水平的波动。为了理解细胞分化为不同组织的机制，对茎内部组织的细胞形态和基因表达进行结构观察至关重要。然而，由于透明化试剂难以有效渗透组织，对茎（节和节间）进行深层成像仍面临挑战。茎在从SAM分化后会立即因侧向生长而迅速增加体积。此外，水稻节部组织因维管束增厚以及节部维管束间复杂的横向连接而硬化，加之水稻茎秆本身具有较强的疏水性，这些因素共同限制了透明化试剂（CS）在茎组织中的渗透10。
本研究旨在利用结构深层荧光技术观察水稻地上部分组织中的基因表达变化。该研究优化了适用于水稻的透明化实验流程，通过共聚焦激光显微镜，可在三维结构中连续观察从茎尖分生组织/幼穗到基部的基因表达，而非局限于平面观察。
方案
1. 固定剂溶液的配制
- 将70 mL无菌水转移至玻璃瓶中，并加入10 g多聚甲醛（PFA）。
注意：PFA具有毒性，建议佩戴手套操作。 - 加入2 mL的1 N NaOH以溶解PFA溶液。
- 在60 °C条件下持续搅拌（300–500 rpm）约1小时，直至PFA溶液变为透明。
- 加入无菌水将PFA溶液体积补至100 mL。
备注：PFA溶液应在使用前新鲜配制。此外，4 °C保存的PFA溶液可使用约2个月。 - 采样前立即向20 mL的10% PFA中加入25 mL的60 mM HEPES（pH 7.4）、3 mL的1 M蔗糖和2 mL无菌水，配制成50 mL固定液。
2. 透明溶液（CS）的制备
- 称取并混合 7.5 g 脱氧胆酸钠、5 g 木糖醇和 12.5 g 尿素（见材料表）于 50 mL 无菌水中。
注意：脱氧胆酸钠粉末在普通实验室通风橱中称量，以防止其在空气中扩散。 - 使用磁力搅拌器溶解组分（步骤 2.1），以配制透明溶液（CS）。
注意：本研究使用自行配制的透明溶液（CS），但也可使用市售的透明溶液 ClearSee（见材料表）。 - 将透明溶液（CS）转移至 50 mL 锥形管中，避光、室温（15–30 °C）保存。
注意：透明溶液（CS）可保存超过 1 年。
3. 取样
- 小心地剪除根部，避免损伤植株。用水清洗植株以去除污物。
注意：本方法研究了从三叶期（LS）至旗叶期（LS）的组织观察。本研究使用了水稻品种日本晴（Nip）和台中65（T65），处于8-10叶期。 - 用手和镊子剥去外部的老叶，保留约2-3片叶。
- 使用单刃剃刀沿滑动方向将茎尖分生组织/幼穗组织至基部切下，避免压碎细胞（图1A-C）。若茎尖分生组织/幼穗位置不可见，可切得稍长一些。
- 由于水稻茎横截面呈 椭圆形（图1D），需用双刃剃刀沿其长轴方向将椭圆一侧薄薄削去（图1E-F）。
注意：此步骤有助于固定液更好地渗透样品。水平的切面更便于样品粘附于振动切片机（见材料表）的样品盘上。 - 通过观察样品中出现的浅白色区域确认茎尖分生组织/幼穗的位置（图1G），并修剪掉多余组织。
注意：样品长度应调整至振动切片机能处理的最大长度。若样品过长，应将其分成若干段。
4. 样品固定
- 用移液器将1 mL固定液（按步骤1配制）加入1.5 mL微量离心管中，并立即放入样品。
注意：确保样品体积不超过固定液体积的20%。 - 将一块石蜡膜剪成2.5 cm2大小，揉成小球状，置于样品上方，以防止样品浮出固定液。
- 将装有样品的离心管放入干燥器中，盖上干燥器盖子，启动真空泵，缓慢降低干燥器内部压力至−0.095 MPa。
- 当干燥器内压力达到−0.095 MPa后，关闭真空泵，在室温下静置30分钟。
注意：此时真空程度应使样品中逐渐产生气泡。 - 稍微打开干燥器，缓慢恢复至常压。再次将干燥器内压力降至−0.095 MPa，关闭真空泵，在室温下静置30分钟。
- 稍微打开干燥器，缓慢恢复至常压。若样品已正确固定，则会沉入固定液中；若未下沉，需再次降低压力。
- 移除石蜡膜，盖上管盖，在4 °C条件下过夜保存。
注意：样品在固定液中至少固定2小时，可保存约1周。
5. 修剪固定后的样品
- 使用无尘擦拭布去除样本上多余的固定液。
注意：多余的固定液会阻碍样本在切片托盘上牢固粘附。 - 用瞬干胶将样本固定在振动切片机的托盘上。将样本平的一面朝下放置，该面为取样时削平的表面。
注意：由于水稻茎秆的结构特点，必须从基部向茎尖分生组织（SAM）/幼穗方向进行修整。 - 根据固定的样本设置修整参数。
注意：本研究中，修整参数设置为厚度（THICK）130 µm、宽度（WIDE）15 mm、频率（FREQUENCY）15%、切割速度（CUTTING SPEED）32 mm。 - 使用 RVS 或 FWD 按钮以及 UP 或 DOWN 按钮调整样本位置。向托盘中加入去离子水，直至所有样本完全浸没。加水完成后，按下 START 按钮。将修整后的样本置于载玻片上，并滴加一滴 1x PBS。
注意：每次修整后应将样本位置移至另一侧，因为较硬的样本会加速剃刀刀片的磨损。 - 在体视显微镜下确认样本包含目标部位后，将修整好的样本转移至含 1 mL 1x PBS 的多孔板中。
注意：根据样本大小选择合适的孔数。本研究使用了 12 孔多孔板。
6. 透明溶液处理
- 从多孔板中移除1x PBS，加入新鲜的1x PBS，静置1分钟。
- 移除1x PBS，加入透明溶液（CS）。
注意：透明溶液（CS）的用量必须为样品体积的五倍。 - 将含有样品的多孔板放入干燥器中，盖上干燥器盖子，启动真空泵，缓慢抽真空至干燥器内部压力达到−0.09 MPa。
- 当干燥器内压力达到−0.09 MPa并保持密闭后，关闭真空泵，在室温下静置1小时。
- 轻微打开干燥器盖子，缓慢恢复至常压。
- 向孔与孔之间的间隙中加入去离子水，以防止透明溶液（CS）蒸发。将多孔板置于避光、室温条件下保存，进行透明处理。
注意：每隔1–2天轻轻振荡多孔板，以促进叶绿素及其他组分的扩散。 - 当透明溶液（CS）变为绿色时，更换为新鲜溶液。
7. 使用化学染料对细胞壁进行染色
- 将荧光增白剂白溶液（1 mL，终浓度：在透明溶液中为 1 mg/mL，参见 材料表）移入多孔板中。将样品放入染色液中，孵育 1 小时。
注意：染料体积不得超过透明溶液（CS）体积的 10%。 - 在另一多孔板中用 1 mL 透明溶液（CS）清洗染色后的样品，清洗时间至少为 1 小时。
8. 使用共聚焦激光显微镜观察
- 在显微镜载玻片上滴加一滴 CS，并将经 CS 处理的样品转移至载玻片上。
注意：由于处理后的样品较软，必须使用镊子小心操作。 - 用玻璃盖玻片覆盖样品，以防止 CS 蒸发。
注意：CS 容易沉淀。 - 在共聚焦激光显微镜下观察处理后的样品。
注意：观察后，可将处理后的样品重新放回 CS 中，以便后续再次观察。
结果
首先，验证透明化处理对成年水稻植株坚硬且厚实组织的透明化程度。实验选用处于穗形成期（9-10叶龄期）的Nip植株，截取从幼穗至茎基部约12-16 mm长的组织。这些包含幼穗的样品经固定液固定后，分别在透明化处理1-4周前后进行观察（图2）。未经修剪的样品在透明化溶液中处理4周甚至3个月后仍保持绿色，未能实现透明化（图2A）。将所有叶片剥离的样品，在CS溶液中处理1周后节间变为白色，但节仍保持绿色；该样品在处理4周后仍未透明化（图2B）。经CS溶液处理3个月后，仅幼穗部分实现透明。手工修剪的样品在CS溶液中处理1周后，除外层叶片和维管束外，其余部分均变为白色；部分叶片、幼穗和节间呈现半透明状态，但处理4周后仍未达到透明（图2C）。处理3个月后，仅幼穗和内层叶片变得透明。使用振动切片机将样品修剪至130 µm厚度后，经CS溶液处理1周即呈现半透明状态，叶片开始透明化；处理2周后样品几乎完全透明，并在4周后保持稳定（图2D）。经3个月处理后，样品完全透明。
接下来，验证了透明化处理在T65的第8叶节（8 LS）中允许观察到基因表达的深度。实验使用了表达UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen（UBQpro::NGCN，见材料表）的茎组织。组织样本先用固定液固定，随后使用振动切片机修整至130 µm厚度。接着，在CS处理后的0至4周内，每周利用共聚焦激光显微镜（激光：488 nm/13%，物镜：20x，针孔：0.93 AU，平均次数：16，探测器增益：800）沿z轴方向以10 µm为间隔进行观察。代表性结果如图3所示。所有图像均经过相同的图像处理以比较荧光强度。在未经处理的节区，深度为−40 µm处仅观察到微弱的荧光信号（图3A）。经CS处理1周后，可观测深度达到−60 µm，2周后达到−90 µm，但在处理第1周和第2周时，深度−20 µm处均可见明显的细胞质自发荧光。自发荧光在第3周时有所减弱，至第4周时已不可见。在第3周时，荧光信号可在−80 µm深度处观察到，第4周时则达到−100 µm深度。在节间区域，未经CS处理时可在−60 µm深度处观察到荧光信号（图3B）。经CS处理1至3周后，可观测深度达到−90 µm，4周后达到−100 µm，但在处理第1周时，−20 µm深度处仍可见明显的细胞质自发荧光，至第2周后该自发荧光不再可见。在叶片中，未经CS处理时可在−90 µm深度处观察到荧光信号（图3C），荧光信号在叶片中的穿透深度大于节区和节间区域，但信号强度较弱。经CS处理1周后，荧光信号变得清晰，并可在−120 µm深度处观察到。处理2周和3周后，荧光信号可在−110 µm深度处观察到，4周后再次达到−120 µm深度。
最后，观察了转录因子OsMADS1511与mOrange12融合蛋白的表达，该因子调控茎尖分生组织（SAM）从营养期向生殖期的转变13。取携带OsMADS15-mOrange的Nip品系在第10叶龄期（10 LS）的组织样品，固定后修整至130 µm厚度，并用透明化溶液（CS）处理2周。图4显示，透明化溶液可同时用于观察天然基因表达的荧光蛋白（OsMADS15-mOrange）以及荧光染料染色（calcofluor white）。观察了深度从0至−130 µm的整个小花结构，并基于间隔为3 µm的43组z轴层析图像重建了三维图像（图4E）。
图 1：取样位置与处理过程。（A）短日照条件下处于第8叶龄期（8 LS）的水稻幼苗。（B）基部的放大视图。（C）从茎尖分生组织/幼穗到基部切下的样品。（D）来自C的椭圆形横截面（插图）。（E）用刀片轻轻削去茎的一侧。（F）削薄后的表面。（G）显示节间伸长的样品。箭头所指的白色部分为节。上部节的上方为幼穗。比例尺：（A）10 cm，（B-C、E-G）1 cm，（D）0.5 cm。请点击此处查看该图的高清版本。
图 2：组织透明化效果依赖于样本厚度和 CS 处理时间。（A）未修剪的样本，包含部分茎秆及幼穗。最大厚度：4 mm。（B）去除所有叶片以暴露幼穗的样本。最大厚度：2.5 mm。yp：幼穗，in：节间；箭头指示节位。（C）手工修剪至 1 mm 厚度的样本。（D）使用振动切片机修剪至 130 µm 厚度的样本。比例尺：5 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：荧光观察深度取决于组织类型和CS处理时间。 UBQpro::NGCN 在（A）节、（B）节间和（C）叶片中的深层成像。“Merge”表示图像与微分干涉差（DIC）图像及所有z轴层扫图像进行了融合。未观察到荧光的图像标记为“n.d.”（未检测到）。共聚焦激光显微镜的设置如下：激光：488 nm/13%，物镜：20x，针孔：0.93 AU，平均次数：16，探测器增益：800，层间间隔：10 µm。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：OsMADS15-mOrange 的深层荧光观察。（A）Nip 在第 10 个 LS 时期的 DIC 图像。yp：幼穗，le：叶片，no：节，in：节间；箭头指示小花。（B）OsMADS15-mOrange 的荧光图像。黄色点状信号表示 OsMADS15-mOrange 荧光蛋白在细胞核中的定位。细胞壁经 calcofluor white 溶液染色呈青色。（C）幼穗的放大视图。（D）小花的深层成像。pa：外稃，le：内稃，fm：花分生组织；星号表示雄蕊原基。共聚焦激光显微镜设置如下：OsMADS15-mOrange；激光：555 nm/13%，物镜：20x，针孔：0.96 AU，平均次数：16，探测器增益：800，层厚间隔：3 µm。Calcofluor white；激光：405 nm/3%，物镜：20x，针孔：0.93 AU，平均次数：16，探测器增益：470，层厚间隔：3 µm。（E）由 z-stack 图像构建的（D）的三维图像。比例尺：（A-B）1 mm，（C）500 µm，（D）40 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
实验方案的关键步骤
本实验方案中的关键步骤是固定和修块。水稻茎秆组织坚硬、厚实或呈层状结构，限制了固定液的渗透。为了提高固定液的渗透性，在取样时对组织的一侧进行了薄切处理，如图1E-F所示。 此外，采用较高压力重复进行两次真空处理。同时，样品在4 °C下固定过夜，而非通常的在4 °C下固定2小时。
修整步骤的关键在于确定组织的厚度，以便在经过短期CS处理后仍能保持其内部结构的同时观察荧光蛋白。如图2C所示，即使经过3个月的CS处理，手工修整至尽可能薄的1 mm厚样品，也仅在少数组织中实现透明化。因此，修整步骤对于成年水稻苗茎秆的深层荧光观察至关重要。本研究中，样品被修整至130 µm厚度，如图2D所示。该130 µm的厚度可在CS处理1周后使叶片透明化，2周后实现整个样品的透明化。本研究采用9-10叶期（LS）的成年水稻苗。较年轻水稻苗的组织虽较厚但质地较软，可能在CS处理下更快实现透明化。应根据待观察三维结构的组织类型、状态及厚度，调整样品厚度和CS处理时间。
修饰与故障排除方法
壳聚糖（CS）在低温下容易沉淀。沉淀的壳聚糖无法保护荧光蛋白，因此在保存样品时需注意维持适当的温度。此外，壳聚糖和固定液 均无防腐作用；因此，若发生污染，荧光蛋白将被降解。土培水稻容易滋生真菌，因此取样和样品处理过程中必须小心操作，避免污染。
缓冲液中过量的荧光染料可能会产生背景荧光，干扰显微观察。例如，先前曾使用含有伊文思蓝染料的荧光增白剂（calcofluor white）溶液。在染色1小时并洗涤1小时后，使用555 nm激光观察OsMADS15-mOrange荧光蛋白。然而，由于伊文思蓝染料产生的背景荧光，无法观察到荧光蛋白。通过将样品洗涤2小时，该背景荧光几乎完全消除。此外，若将样品放置过夜，荧光蛋白的信号更加清晰。因此，本研究采用了纯净的荧光增白剂溶液。在观察前，应使用不同激光波长检测荧光染料来源的背景荧光。
方法的局限性
如图3所示，在经过2周CS处理后，厚度为130 µm的样品中仍可观察到深层荧光蛋白。这与图2D中的结果一致，即厚度为130 µm的样品在经过2周CS处理后变得透明。然而，如图3A所示，在经过2周CS处理后，节段中的细胞质自发荧光仍然明显，只有在经过4周CS处理后才被完全去除。由于节段细胞密度较高，因此需要更长时间才能清除自发荧光物质。
如图3C所示，在未进行CS处理的叶片中观察到了深层荧光蛋白，但在相同20 µm深度下，其亮度弱于节和节间的荧光信号。经过1周的CS处理后，荧光蛋白的亮度增强。叶片中叶绿素含量丰富，会吸收488 nm的激发光，同时具有橙红色自发荧光，可能干扰使用555 nm激光对荧光蛋白的观察。经过1周的CS处理后，叶绿素及其他自发荧光物质被去除，从而获得了高信噪比的图像。
在使用CS处理2周和4周后，能够观察到的组织深度之间无显著差异，尽管在4周后荧光蛋白信号较弱（图3）。通常情况下，荧光蛋白和自发荧光的亮度会随着时间推移而减弱，导致信噪比升高。因此，通过调整显微镜条件和图像处理，可以更清晰地观察到荧光蛋白。根据这些结果，在本研究的样本条件下，2周的CS处理已足以促进深层荧光蛋白的观察。然而，要获得完全排除自发荧光物质的更清晰图像，则需要4周的处理时间。
具有强自发荧光的结构（如维管束和多臂细胞）无法在CS中清除。为了在无自发荧光干扰的情况下观察这些结构，必须采用时间门控方法12，或通过荧光光谱的光谱学手段获取图像。若需观察较厚的组织，双光子显微镜可能更适用于深层组织的观察。
该方法相较于现有及替代方法的意义
通常，水稻植株内部结构的观察依赖于冰冻切片机或振动切片机进行切片。冰冻切片机适用于制备薄切片，便于观察，但样品制备和设备操作耗时较长。此外，从薄切片中重建原始的三维结构也较为困难。振动切片机操作相对简便，适合制备厚切片，然而目标组织的厚切片仅能观察切面，无法观察光线无法穿透的深层组织。因此，这两种方法均不适用于深层荧光观察。
本研究通过整合现有方法，解决了在水稻茎秆中进行深层荧光观察所面临的挑战，例如化学固定剂（CS）组织穿透能力有限，以及共聚焦显微镜下目标物分辨率较差的问题。如图4所示，我们观察到成年水稻茎秆深层组织中表达的荧光蛋白（OsMADS15-mOrange），其观察范围从幼穗延伸至茎基部。图4D聚焦于小花结构，并以3 µm为间隔显示深层荧光蛋白的分布。经CS处理2周后，可观察到深度达−130 µm以下的组织；而在相同大小和生长阶段但未经CS处理的小花中，仅能观察到深度在−27 µm以内的组织（数据未显示）。当前优化的实验方案不仅能够用于观察基因的过表达，还可实现对成年水稻茎秆深层组织中天然基因表达的检测。
该方法在特定研究领域中的重要性及潜在应用
本实验方案通过切除不必要的组织并提高包埋剂（CS）的通透性，优化了成年水稻茎叶的深层荧光观察，从而实现对坚硬、较厚或分层组织的高效透明化处理。此外，通过优化分析样品的厚度，可在共聚焦激光显微镜下实现连续且具有结构分辨率的深层荧光观察；此类显微镜通常难以清晰成像较厚或不透明的组织。
由于荧光蛋白在固定剂和PBS溶液中会随着时间推移而降解，因此很难对处于不同生长阶段的水稻样品进行比较。然而，CS中的荧光蛋白可保存超过5个月1。CS较长的保存期限对于水稻的深层荧光观察具有重要意义。
近年来，许多透明化技术相继被开发出来，使得在保持组织内部结构完整的同时，能够以三维形式观察深层组织。这些技术不断演进，新的透明化溶液也陆续被研发出来。例如 iTOMEI14，可高效去除叶绿素并实现更明亮的荧光检测；另一个例子是 ClearSeeAlpha15，可在透明化处理过程中防止组织褐变，使其呈现透明状态。将这些透明化溶液与本方法结合，可能实现更高效、更有效的组织透明化。
预计该方法将有助于通过深度成像技术，不仅对水稻，也对其他植物获得新的认识。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢手岛隆史博士、岛谷丈博士和辻宏和博士提供OsMADS15-mOrange种子；栗原大辅博士提供NGCN载体构建；以及Shim R.博士对本文稿的编辑。本研究由日本学术振兴会（JSPS）科研费（课题编号JP20H05912、20H05778、20H05779）以及日本科学技术振兴机构（JST）与日本国际协力机构（JICA）联合实施的SATREPS项目（编号JPMJSA1706）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | BIO-BIK | ST-0150F | |
| 12 孔多孔板 | Corning | 353043 | |
| 50 mL 锥形管 | Corning | 352070 | |
| Calcofluor White 溶液 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| ClearSee | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 031-25151 | 可自行配制或购买。 |
| 共聚焦激光显微镜 | Carl Zeiss | LSM700 | |
| 干燥器 | SANPLATEC | 由丙烯酸材料定制制成，30 cm（长）× 30 cm（宽）× 14.5 cm（高） | |
| 玻璃盖玻片（18 × 18 No.1） | MATSUNAMI | C018181 | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 342-01375 | |
| 显微镜载玻片（76 × 26） | MATSUNAMI | S2441 | |
| 石蜡膜 | Bemis | PM-996 | |
| 多聚甲醛 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 162-16065 | |
| 脱氧胆酸钠 | Tokyo Chemical Industry | C0316 | |
| 蔗糖 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-00013 | |
| UBQpro::NLS-sGFP-nClover3-mNeonGreen (UBQpro::NGCN) | 由 Dr. Kurihara 提供 | ||
| 尿素 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| 真空泵 | AS One | AS-01 | |
| 振动切片机 | DOSAKA | DTK-3000 | |
| 木糖醇 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
参考文献
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