标准化大鼠冠状动脉环制备及血管直径动态张力变化的实时记录

摘要

本方案描述了用于测定大鼠冠状动脉血管反应性的血管环张力测定技术。

摘要

作为心血管系统疾病的关键事件，冠状动脉疾病（CAD）被广泛认为是动脉粥样硬化、心肌梗死和心绞痛的主要病因，严重威胁全球人群的生命与健康。然而，如何记录离体血管的动态生物力学特性，长期以来一直困扰着研究人员。同时，精确地定位和分离冠状动脉以进行测量 体外 动态血管张力变化已成为冠心病药物研发的趋势。本方案描述了大鼠冠状动脉的宏观鉴定与显微分离方法。利用已建立的多通道血管张力测定系统，监测冠状动脉环沿血管直径方向的收缩与舒张功能。从取样到数据采集，冠状动脉环张力测定的标准化与程序化操作流程极大提高了实验数据的可重复性，从而确保在生理、病理及药物干预后血管张力记录的真实性。

引言

冠状动脉疾病（CAD）作为一种典型且具有代表性的心血管疾病，已被广泛认知和关注，是发达国家和发展中国家最主要的死亡原因^1,2。作为维持心脏正常生理功能的血液和氧气供应通路，循环血液通过心肌表面的两条主要冠状动脉及血管网络进入并滋养心脏^3,4。胆固醇和脂肪在冠状动脉内的沉积会阻断心脏的血液供应，并引发血管系统的剧烈炎症反应，导致动脉粥样硬化、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌梗死或猝死^5,6。针对冠状动脉的病理性狭窄，机体可通过代偿性加快心率，增加左心室输出量，以满足心脏自身或身体重要器官的血液供应⁷。若冠状动脉长期狭窄未能及时缓解，心脏某些区域可能形成广泛的新生血管⁸。目前，临床上对CAD的治疗常采用药物溶栓或手术机械溶栓，以及外源性仿生血管旁路术，但需频繁用药且手术创伤大、并发症多⁹。因此，对冠状动脉生理功能的深入研究仍是心血管疾病领域亟待突破的关键方向¹⁰。

除了无线遥测系统外，目前尚无其他可用的技术手段来检测冠状动脉的生理活动，该系统可动态记录活体（in vivo）冠状动脉压力、血管张力、血氧饱和度和pH值¹¹。因此，考虑到冠状动脉结构的隐蔽性和复杂性，准确识别和分离冠状动脉无疑是体外（in vitro）研究冠心病（CAD）多种机制的最佳选择⁴。

一系列多通道肌动图系统，特别是导线式微血管张力检测仪（参见 材料表），是一种非常成熟的可销售设备，用于记录 体外 小血管、淋巴管和支气管管壁张力变化的高精度连续动态记录¹²该系统已被广泛用于记录 体外 直径为60 µm至10 mm的腔状结构的组织张力特性。导线显微图像平台的持续加热功能在很大程度上抵消了不利外部环境的干扰。同时，通过持续输入混合气体并维持稳定的pH值，我们能够在接近生理状态的条件下获得更为准确的血管张力数据¹³然而，考虑到大鼠冠状动脉解剖定位的复杂性（图1），其分离过程一直存在困难，限制了对多种心血管疾病机制的探索及药物研发。因此，本实验方案详细介绍了大鼠冠状动脉的解剖位置及分离步骤，并在丝线式肌动图平台上进行张力测定¹⁴.

方案

本动物实验方案已通过成都中医药大学管理委员会的审查与批准（记录编号：2021-11）。本研究采用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（体重260–300 g，8–10周龄）。实验期间，大鼠饲养于动物饲养室，可自由饮水和进食。

1. 溶液配制

1. 通过溶解 118 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、1.2 mM KH₂PO₄、1.2 mM MgSO₄、25 mM NaHCO₃ 和 11 mM 葡萄糖，制备生理盐溶液（PSS）。⁺，2.5 mM CaCl₂₂，1.2 mM KH₂PO₄，1.2 mM MgCl₂₂∙6H₂O₂，25 mM NaHCO₃₃，11 mM D-葡萄糖和 5 mM HEPES（参见 材料表).
2. 配制高 K⁺ 溶液⁺ 盐溶液，通过溶解 58 mM NaCl 和 60 mM K⁺，2.5 mM 的 CaCl₂，1.2 mM KH₂PO4，1.2 mM MgCl₂₂∙6H₂O₂，25 mM NaHCO₃₃，11 mM D-葡萄糖和5 mM HEPES。
3. 将上述两种溶液充分饱和，并用95% O₂₂ 和 5% CO₂同时，用 2 mM NaOH 将溶液的 pH 值维持在 7.38 至 7.42 之间。
   注：有关溶液配制的详细信息，请参见参考文献¹⁵.

2. 大鼠冠状动脉解剖

1. 通过吸入2%异氟烷对大鼠进行麻醉。通过夹趾法确认深度麻醉状态，必要时追加麻醉剂。随后立即在便携式手术台上打开胸腔，暴露心脏，操作参照先前发表的文献¹²。
2. 分离并取出心脏后，使用医用塑料镊子轻轻挤压，排出所有心腔内的残留血液。迅速将预处理后的心脏置于含有95% O₂ + 5% CO₂饱和PSS（pH值为7.40）的培养皿中，温度保持在4 °C。
3. 为准确识别冠状动脉的解剖位置，根据示意图（图2A）在体视显微镜下调整离体心脏的姿态。
   注意：正面观察时，右心耳位于左上方，肺动脉位于右上方。
   1. 使用手术剪和镊子从肺动脉根部沿室间隔切开左、右心室腔（图2B）。
4. 为从心肌组织中分离左、右冠状动脉，需在光学解剖显微镜下解剖右心室，充分暴露右冠状动脉分支。随后将心脏组织顺时针旋转45°，以确定左冠状动脉的位置（图2D）。
5. 去除周围黏连的心肌组织后，清晰辨认出搏动的左侧（约5 mm）和右侧（约5 mm）冠状动脉。立即在中段分离冠状动脉，并完全浸入4 °C的PSS溶液中。使用解剖剪将分离的动脉垂直切成约2 mm长的血管环，用于记录不同刺激下的血管张力（图2E）。

3. 动脉环的悬挂与固定

注意：有关此步骤的详细信息，请参见参考文献¹⁴。

1. 准备两根 2 cm 的不锈钢丝（参见材料表），并在 4 °C、充有 95% O₂ + 5% CO₂ 的 PSS 溶液中预浸泡。在光学解剖显微镜下，将两根钢丝平行穿过动脉环，沿血管走向穿入，并确保钢丝两端在血管腔两侧露出的长度相等。
2. 将带有钢丝的动脉环前后固定在充满持续通入 95% O₂ + 5% CO₂ 的 PSS 溶液的张力微测计浴槽中。调节水平旋钮，使前后间距适当，确保两根钢丝处于水平状态，且动脉环保持自然松弛状态。
3. 将 DMT 浴槽安装至恒温装置后，打开数据采集软件（参见材料表），确认相应通道信号已被记录。设置以下参数：目镜校准（mm/div）：0.36；目标压力（kPa）：13.3；IC1/IC100：0.9；在线平均时间：2 s；延迟时间：60 s。动脉环固定的步骤如图 3所示。

4. 大鼠动脉环血管张力的标准化

注意：对于不同的腔体样本，为使血管保持最佳活性，需设定最佳初始张力 体外. 详情请参见参考文献¹⁵.

1. 通过沿血管直径施加合理的张力，使动脉环达到最佳的初始张力。
   注意：根据先前的研究¹⁶，当因子k值为0.90时，可实现最大激动剂诱导张力，此时初始拉伸张力为1.16 ± 0.04 mN/mm（不同血管样本的参考值：k值为0.90–0.95；初始张力为1.16–1.52 mN/mm）。
2. 此时，将显示的血管张力值设为零。随后，通过旋转浴槽的螺旋轴，对动脉环施加3 mN的牵拉刺激。
3. 在37 °C、pH 7.40的氧饱和PSS缓冲液中孵育1小时后，再次将导丝微测张力仪的张力控制面板上的张力值设为0 mN。动脉环初始张力的设定过程见图4。

5. 冠状动脉环反应性检测

1. 采用丝状肌动描记技术（wire myograph technique）检测冠状动脉环的收缩活性¹⁴，并通过每次10分钟、共三次独立操作的60 mM K⁺溶液刺激进行验证。
2. 每次刺激后，用氧气饱和的PSS溶液冲洗浴槽，直至血管张力恢复至初始状态。
   注意：只有当三次平行测量的张力波动小于10%，且每次收缩幅度均大于1 mN/mm时，方可认为动脉环质量合格且具有高活性，可用于后续实验。大鼠冠状动脉环的活性验证结果见图5。

6. 术后处理

1. 手术后，按照机构批准的方案对动物实施安乐死。
   注：本研究中，动物通过吸入过量异氟烷实施安乐死。

结果

解剖位置上的大鼠冠状动脉分布于心肌组织深处且被其遮蔽，不易识别。通过比较人类（图1A）与大鼠（图1B）的冠状动脉，并依据 图2 所示取样流程，实现了对大鼠冠状动脉的快速而准确的分离。在体视显微镜下从前侧精确辨认右心耳、肺动脉和心尖后，沿 图2A 所示实心黑线切开心肌组织，约5 mm长的冠状动脉前室间支被清晰暴露。在精细分离包绕室间隔动脉的黏连心肌后，使用一根2 cm长的金属丝沿血管走行方向穿过约2 mm长的一段冠状动脉，形成环状。随即，游离出的2 mm冠状动脉环被牢固固定于DMT浴槽中，如 图3 所示。在对动脉环施加初始3 mN张力（图4）后，通过平行给予60 mM K⁺ 溶液三次，其收缩张力均超过2 mN以上（图5

讨论

冠状动脉微循环障碍在冠心病（CAD）患者中广泛存在，已逐渐被认识并被视为心肌充分灌注的重要基础。鉴于冠心病和心血管疾病突发所导致的严重并发症，对冠心病患者进行及时的药物预防与治疗在临床上极为重要¹⁷冠状动脉解剖结构的隐蔽性及其生理结构的复杂性，不可避免地严重限制了对冠心病药物和治疗方法有效性的合理与科学评估。^{18,19,20,21,22,23,24,25}毫无疑问，准确地定位和分离活性冠状动脉是促进冠心病相关疾病病理机制研究以及预防与治疗措施评估的前提。导丝显微成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
芹黄素	上海桑谷生物医药科技有限公司，中国上海	150731
CaCl2	上海桑谷生物医药科技有限公司，中国上海	A501330
D-葡萄糖	上海桑谷生物医药科技有限公司，中国上海	A610219
HEPES	西雅试剂有限公司，中国山东	S3872
KCl	上海桑谷生物医药科技有限公司，中国上海	A100395
KH2PO4	上海桑谷生物医药科技有限公司，中国上海	A100781
LabChart 专业版 8.3	ADInstruments，澳大利亚	—
MgCl2·6H2O	上海桑谷生物医药科技有限公司，中国上海	A100288
多通道肌张力测量系统	丹麦Myo科技公司，丹麦奥胡斯	620M
NaCl	上海桑谷生物医药科技有限公司，中国上海	A100241
NaHCO3	上海桑谷生物医药科技有限公司，中国上海	A100865
钢丝	丹麦Myo科技公司，丹麦奥胡斯	400447
U46619	Sigma，美国	D8174