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方法文章

利用邻近标记蛋白质组学表征神经元溶酶体相互作用组

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DOI：

10.3791/64132

⸱

2022年6月23日

 ,  , 
1Department of Chemistry, The George Washington University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种神经元溶酶体邻近标记蛋白质组学方案，用于表征人诱导多能干细胞来源神经元中动态的溶酶体微环境。该方法可在活体人神经元中以优异的细胞内空间分辨率，准确量化溶酶体膜蛋白以及与溶酶体稳定或 transiently 相互作用的蛋白质。

摘要

溶酶体经常与多种生物分子相互作用，以实现降解及其他多样的细胞功能。溶酶体对人类大脑功能至关重要，因为神经元是终末分化细胞，高度依赖自噬-溶酶体途径来维持细胞稳态。尽管在理解溶酶体多种功能方面已取得进展，但在技术上仍难以捕捉溶酶体与其他细胞组分之间高度动态的相互作用，尤其是在高通量条件下。本文提供了近期发表的一种内源性（基因敲入）溶酶体邻近标记蛋白质组学方法的详细实验方案，适用于人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元。

在活体人神经元中，可高置信度地鉴定并准确定量溶酶体膜蛋白以及溶酶体周围10-20 nm半径范围内的蛋白。本方案的每一步均进行了详细描述，包括hiPSC神经元培养、邻近标记、神经元收获、荧光显微镜观察、生物素化蛋白富集、蛋白质消化、液相色谱-质谱（LC-MS）分析及数据分析。总之，这种独特的内源性溶酶体邻近标记蛋白质组学方法为研究活体人神经元中高度动态的溶酶体活动提供了一种高通量且稳健的分析工具。

引言

溶酶体是通过溶酶体-自噬途径降解大分子的分解代谢细胞器1。除了降解功能外，溶酶体还参与多种细胞功能，如信号转导、营养感应和分泌过程2,3,4。溶酶体功能紊乱已被证实与溶酶体贮积症、癌症、衰老和神经退行性疾病相关3,5,6,7。对于终末分化且高度极化的神经元而言，溶酶体在维持神经元细胞稳态、神经递质释放以及轴突长距离运输中发挥着关键作用8,9,10,11。然而，在人类神经元中研究溶酶体一直是一项具有挑战性的任务。近年来，诱导性多能干细胞（iPSC）来源的神经元技术取得了进展，使得原本难以获取的活体人类神经元得以培养，从而弥合了动物模型与人类患者之间在脑科学研究上的差距12,13。特别是先进的i3Neuron技术，可将神经源性因子-2（neurogenin-2）转录因子在强力霉素诱导型启动子的控制下稳定整合到iPSC基因组中，从而在两周内驱动iPSC分化为纯化的皮层神经元14,15。

由于溶酶体活性高度动态，捕捉其与其他细胞组分之间的相互作用在技术上具有挑战性，尤其是在高通量条件下。邻近标记技术因其能够以极高的空间特异性捕获稳定以及瞬时或微弱的蛋白质相互作用，非常适合用于研究这类动态过程16,17。可通过基因工程将过氧化物酶或生物素连接酶与诱饵蛋白融合表达。激活后，该酶产生高活性的生物素自由基，共价标记邻近的蛋白质；随后利用链霉亲和素包被的磁珠富集这些标记蛋白，并通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）平台进行下游的自下而上式蛋白质组学分析17,18,19,20,21。

最近开发了一种内源性溶酶体邻近标记蛋白质组学方法，用于捕获i3神经元中动态的溶酶体微环境22。在诱导多能干细胞（iPSCs）中，将工程化的抗坏血酸过氧化物酶（APEX2）敲入溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）的C末端，随后可将这些细胞分化为皮层神经元。LAMP1是一种丰富的溶酶体膜蛋白，也是经典的溶酶体标志物23。LAMP1也在晚期内体中表达，而晚期内体会成熟为溶酶体；在本方案中，这些晚期内体-溶酶体以及非降解性溶酶体均统称为溶酶体。这种以内源性生理水平表达的LAMP1-APEX探针，可减少LAMP1的错误定位及过表达带来的实验假象。该方法可在活的人类神经元中以优异的空间分辨率识别并定量数百种溶酶体膜蛋白及溶酶体相互作用蛋白。

本文详细描述了一种在人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元中进行溶酶体邻近标记蛋白质组学的实验方案，并在近期发表的方法22基础上进行了进一步优化。整体实验流程如图1所示。该方案包括hiPSC来源神经元的培养、神经元中邻近标记的激活、通过荧光显微镜验证APEX酶活性、确定链霉亲和素磁珠与上样蛋白之间的最佳比例、生物素化蛋白的富集、磁珠上蛋白的消化、肽段脱盐与定量、液相色谱-质谱（LC-MS）分析以及蛋白质组学数据分析。此外，还讨论了故障排除指南和实验优化策略，以提高邻近标记的质量控制和实验性能。

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方案

所有实验程序均经乔治·华盛顿大学生物安全与伦理委员会批准。表1中列出了本实验方案所用培养基和缓冲液的组成成分。本实验所用商品化产品的信息见材料表。

1. 人iPSC来源的神经元培养

  1. 人iPSC培养及LAMP1-APEX探针整合（7天）
    1. 将Matrigel储存液在4 °C条件下置于冰桶中过夜解冻，分装500 µL至预冷的无菌离心管中，并于−80°C保存。通过将500 µL Matrigel储存液加入49.5 mL预冷的DMEM/F12培养基中，制备50 mL包被溶液。
      注意：保持Matrigel低温，使用预冷的锥形管和移液器吸头，以防止聚合。包被溶液可在4 °C保存2周。
    2. 在37 °C培养箱中，用4 mL包被溶液对10 cm细胞培养皿包被1小时。
      注意：Vitronectin可作为替代包被溶液，浓度为5 µg/mL，包被时间为2小时，适用于iPSC培养。Vitronectin（单一蛋白组分）比Matrigel更昂贵，但批次间差异更小，背景信号更干净；而Matrigel是从鼠肿瘤中提取的，含有多种细胞外基质蛋白。Vitronectin包被需使用未经处理的组织培养板。Matrigel包被则适用于经处理和未经处理的组织培养板。
    3. 将1-3百万个hiPSC解冻后接种至每个已包被且预加了8 mL含ROCK抑制剂的Essential E8完全培养基的10 cm培养皿中（终浓度为10 µM Y-27632或50 nM Chroman1）。
      注意：在干细胞培养基中添加ROCK抑制剂（Y-27632或Chroman1）可最大程度减少传代和冷冻保存后因解离引起的细胞凋亡。最近研究表明，Chroman1在抑制ROCK1和ROCK2方面比Y-27632更具效力24。
    4. 当iPSC形成克隆后（通常在1-2天后），更换为10 mL不含ROCK抑制剂的E8完全培养基。维持iPSC在E8完全培养基中培养，并每隔一天更换新鲜培养基。
    5. 通过CRISPR基因组编辑技术，将邻近标记酶——工程化抗坏血酸过氧化物酶（APEX2）——整合至内源性LAMP1基因的C末端。有关构建稳定细胞系的详细步骤，请参考已发表的方法（Frankenfield等）22。
  2. 人iPSC神经元分化（3天）
    1. 在分化前，于37 °C培养箱中用4 mL Matrigel包被溶液对10 cm细胞培养皿包被过夜。
    2. 维持hiPSC培养至约70%汇合度。用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞两次以去除死细胞。吸除PBS后，向10 cm培养皿中加入3 mL Accutase。轻轻摇晃培养皿使液体均匀分布，在37 °C培养箱中孵育8分钟。
    3. 加入2 mL PBS洗涤并悬浮细胞，将全部细胞悬液收集至15 mL锥形管中。以300 × g离心5分钟收集细胞沉淀。将2-4 × 106个hiPSC接种至已预加8 mL温热神经元诱导培养基的Matrigel包被培养皿中（表1）。均匀分布细胞后，置于37 °C培养箱中。
      注意：神经元分化由多西环素诱导的转录因子neurogenin-2（NGN2）驱动，该因子在此稳定hiPSC细胞系中过表达15。
    4. 在分化第1天，用PBS轻柔洗涤hiPSC以去除死亡细胞碎片。更换为10 mL不含ROCK抑制剂的温热诱导培养基。
    5. 每天更换一次不含ROCK抑制剂的温热诱导培养基，直至分化第3天。
      注意：神经元已准备好重接种至神经元培养基中。
  3. 神经元接种与神经元培养维持（10天）
    1. 用硼酸盐缓冲液配制0.1 mg/mL的Poly-L-Ornithine（PLO）包被溶液（表1）。
    2. 在接种第3天神经元前，于37 °C培养箱中用PLO包被溶液对细胞培养皿包被至少1小时或过夜。用4 mL无菌水洗涤培养皿三次，并在生物安全柜内完全晾干。
    3. 用3 mL Accutase将第3天的神经元从每个10 cm培养皿中解离，并将800万至1000万个细胞接种至每个已预加温热皮层神经元培养基的PLO包被10 cm培养皿中（表1）。
    4. 每隔2-3天进行半量换液，使用温热神经元培养基，直至i3神经元在分化后2周达到成熟。

2. 原位 邻近标记与神经元裂解（2 小时）

  1. 在二甲基亚砜（DMSO）中配制500 mM生物素-苯酚（BP）储备液，并于−20 °C保存。在邻近标记实验当天，用预热的神经元培养基稀释BP储备液，使神经元在37 °C培养箱中以500 µM的终浓度处理30分钟。
    注意：神经元培养基中需加入多西环素，以激活APEX酶的表达。多西环素需至少在邻近标记实验前24小时加入。
  2. 通过向神经元培养物中加入过氧化氢（H2O2）至终浓度1 mM来启动标记反应，并准确孵育1分钟。立即吸除培养基，并用淬灭缓冲液（表1）清洗3次。
    注意：H2O2溶液应在标记反应前新鲜配制。H2O2激活时间必须精确为1分钟，以减少实验变异并最大限度降低长时间H2O2处理引起的氧化应激。
  3. 倾斜培养板以吸除所有残留缓冲液。直接将预冷的细胞裂解缓冲液（表1）加入神经元培养板中。每100万神经元使用100 µL细胞裂解缓冲液。轻轻摇晃培养板以充分裂解细胞，随后置于冰上。
  4. 将细胞裂解物刮入预冷的1.5 mL离心管中。在冰水浴中使用水浴超声仪（>100 W）进行超声处理，总时长15分钟，采用40秒开启、20秒关闭的循环模式。
    注意：充分裂解后的蛋白溶液应澄清，无沉淀或过多气泡。充分的超声处理对剪切核酸、降低细胞裂解物黏性至关重要，可减少后续步骤中的非特异性结合。也可使用探头式超声仪以实现更强、更快的细胞裂解，但需在样品间彻底清洗探头，以最大限度减少交叉污染和样品损失。
  5. 向样品中加入4倍体积的预冷丙酮（−20 °C）。短暂涡旋混匀后，在−20 °C孵育3小时。
  6. 在2 °C条件下以16,500 × g离心10分钟。小心吸除上清液，避免扰动蛋白沉淀。用1 mL −20 °C丙酮洗涤沉淀两次，每次离心后去除上清液。
  7. 使用真空浓缩仪干燥蛋白沉淀1分钟。加入细胞裂解缓冲液以完全溶解沉淀。如需要可短暂超声处理。将样品储存于−80 °C。
    ​注意：丙酮沉淀可去除样品中残留的生物素-苯酚，避免其干扰后续生物素化蛋白的富集。

3. 使用荧光显微镜验证 APEX 的定位与活性（1.5 天）

  1. 将表达内源性 LAMP1-APEX 的 i3Neurons 与 500 µM BP 在 37 °C 下孵育 30 分钟。用 1 mM H2O2 处理仅 1 秒以激活标记，从而限制生物素扩散范围。
  2. 立即使用含 4% 多聚甲醛的淬灭缓冲液固定细胞，并用 PBS 轻柔洗涤 3 次。
    注意：对于 10 cm 培养皿，每次洗涤需使用 4–6 mL 以确保充分洗涤。
  3. 在室温下用含 3% 驴血清和 0.1% 皂苷的 PBS 溶液对细胞进行封闭和通透处理，持续 30 分钟。
  4. 在 4 °C 下用一抗 LAMP1 抗体（小鼠单克隆抗体 H3A4，1:1,000 稀释）孵育细胞过夜。
  5. 用 PBS 轻柔洗涤神经元 3 次，在室温下用二抗抗小鼠 AF561（1:1,000 稀释）和链霉亲和素-680（1:1,000 稀释）孵育 1 小时。
  6. 用 PBS 洗涤 2 次，在室温下用 Hoechst 或 4',4-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染色剂孵育 10 分钟。再用 PBS 冲洗细胞 2 次。
  7. 在荧光显微镜下观察固定后的神经元。观察细胞核外被链霉亲和素染色的生物素化蛋白是否与 LAMP1 染色信号共定位，以验证 APEX 活性的正确亚细胞定位。

4. 确定链霉亲和素磁珠与输入蛋白的比例（1.5 天）

  1. 使用去垢剂兼容性蛋白测定法（DCA）测定细胞裂解液中的总蛋白浓度
    1. 将牛血清白蛋白（BSA）蛋白标准品溶解于细胞裂解缓冲液中，配制成浓度为 4 mg/mL 的溶液。使用细胞裂解缓冲液制备一系列 BSA 蛋白标准品溶液（0.2–2 mg/mL，共 5 个稀释梯度）。
    2. 将每种蛋白样品、BSA 蛋白标准品溶液以及空白细胞裂解缓冲液各取 5 µL，每组设三个重复，分别加入 96 孔板的各个孔中。
    3. 每 1 mL 试剂 A 中加入 2 µL 试剂 S，配制成试剂 A'。向每个孔中加入 25 µL 试剂 A'，再向每个孔中加入 200 µL 试剂 B。混匀后如有气泡应予以戳破。
    4. 将 96 孔板在室温下孵育 15 分钟，使用酶标仪在 750 nm 波长下读取吸光度，并根据 BSA 标准曲线定量蛋白样品的浓度。
  2. 磁珠滴定点印迹实验（1.5 天）
    1. 将一系列链霉亲和素磁珠悬液（20 µL、15 µL、12 µL、10 µL、8 µL、4 µL、1 µL、0 µL）分别转移至 PCR 条形管中。将 PCR 条形管置于磁力架上，用 100 µL 2% SDS 缓冲液洗涤磁珠 3 次，每次均在磁力架上完全去除洗涤液。
    2. 向每管中加入 50 µg 蛋白样品。再添加裂解缓冲液至总体积为 80 µL。盖紧管盖，在 4 °C 下旋转孵育过夜。
    3. 将 PCR 条形管在台式微量离心机上短暂离心。将条形管置于磁力架上静置 1 分钟。从每管中吸取 2 µL 上清液点加到干燥的硝酸纤维素膜上，并让膜完全干燥。
      注：若信号强度较低，可增加点样体积至超过 2 µL。可通过每次点样后待膜自然风干，再在同一位置重复点样多次来增加上样量。也可使用 Bio-Dot 装置进行点样。
    4. 将膜在封闭缓冲液（TBS）中孵育 1 小时，随后在 Streptavidin Alexa Fluor 680 偶联物（以封闭缓冲液按 1:1,000 稀释）中孵育 1 小时，之后用 TBS-T（表 1）洗涤 5 次。
      注：可选用链霉亲和素抗体进行 Western 印迹作为点印迹实验的替代方法。
    5. 在 680 nm 激发波长下检测膜上每个点的荧光信号，绘制荧光信号强度与磁珠体积的关系散点图，并根据曲线指数衰减结束的位置，确定 50 µg 输入蛋白样品所需的最优磁珠体积。
      ​注：荧光强度反映上清液中生物素化蛋白的丰度，应随磁珠用量的增加而降低。

5. 富集生物素化蛋白及磁珠上消化（3 天）

  1. 将蛋白裂解液样品从 −80 °C 取出，放入 1.5 mL 离心管中，在水浴超声仪中处理 30 秒以快速解冻溶液。涡旋混匀后将样品管置于冰上。
  2. 向每个 1.5 mL 离心管中加入 250 µL 链霉亲和素（SA）磁珠悬液。将离心管置于磁力架上，用 1 mL 洗涤缓冲液 A（2% SDS）洗涤磁珠 3 次，并去除残留缓冲液。
  3. 根据点印迹杂交实验和 DC 蛋白定量实验的结果，计算 250 µL 链霉亲和素磁珠悬液所需的蛋白样品量（µg）。
    注意：在本实验使用的内源性表达 LAMP1-APEX 探针中，每 50 µg 输入蛋白需使用 5 µL 磁珠。因此，250 µL 磁珠中加入 2.5 mg 总蛋白。若输入样品量有限，可使用少于 250 µL 的 SA 磁珠。
  4. 向含有磁珠-裂解液混合物的离心管中加入细胞裂解缓冲液，使总体积达到 1 mL，并在 4 °C 下旋转孵育过夜。
    注意：不同组别或重复样品应调整至相同的蛋白浓度、体积和磁珠用量，以减少实验误差。
  5. 将所有离心管在台式微量离心机中短暂离心，随后置于磁力架上 1 分钟。在磁力架上小心吸除上清液。
    注意：每次将样品管置于磁力架后，必须等待 1 分钟。这一步至关重要，可最大限度减少因溶液中仍有少量磁珠缓慢向磁铁移动而导致的磁珠损失。
  6. 在室温下用 1 mL 洗涤缓冲液 A 洗涤磁珠 2 次（每次旋转 5 分钟）。随后依次在 4 °C 下用每种洗涤缓冲液（缓冲液 B、缓冲液 C 和缓冲液 D；表 1）各洗涤 2 次。
    注意：高浓度 SDS 溶液在低温下可能发生沉淀。第一次洗涤必须在室温下进行。
  7. 将离心管置于磁力架上，用缓冲液 D 洗涤磁珠 2 次，以彻底去除残留的去垢剂。将磁珠重悬于 100 µL 50 mM Tris 缓冲液中，加入 TCEP 至终浓度为 5 mM，在温控混匀仪中于 37 °C 孵育 30 分钟，转速为 1,200 rpm。
  8. 向每管中加入碘乙酰胺（IAA）至终浓度为 15 mM，在温控混匀仪中于 37 °C 黑暗条件下孵育 30 分钟，转速为 1,200 rpm（关闭混匀仪盖）。
    注意：IAA 对光敏感，应在进行此步骤前 5 分钟新鲜配制。
  9. 加入 TCEP 至终浓度为 5 mM，以淬灭过量的 IAA。在温控混匀仪中于 37 °C 孵育 10 分钟，转速为 1,200 rpm（打开混匀仪盖）。
  10. 将样品管短暂离心后置于磁力架上 1 分钟，去除上清液。加入 200 µL 含 5 mM TCEP 的 50 mM Tris 缓冲液重悬磁珠。向样品中加入 1 µg 胰蛋白酶/赖氨酰内切酶（Trypsin/Lys-C）混合酶，于 37 °C 温控混匀仪中孵育 14 小时，转速为 1,200 rpm。
  11. 额外加入 0.2 µg 胰蛋白酶/赖氨酰内切酶混合酶，继续消化 3 小时。
  12. 将样品管短暂离心后置于磁力架上 1 分钟。在磁力架上将肽段上清液转移至洁净离心管中。用 50 µL 50 mM Tris 缓冲液洗涤磁珠（振荡 5 分钟），并将洗涤液与之前的肽段上清液合并。
  13. 向含有肽段上清液的离心管中加入 30 µL 10% 三氟乙酸（TFA），调节 pH 至 <3。

6. 肽段脱盐与分级（2 小时）

  1. 在真空 manifold 上，用 200 µL HPLC 级甲醇（MeOH）润洗反相固相萃取板（仅使用所需的孔），重复 3 次。再用 200 µL 含 1% TFA 的 HPLC 级水溶液平衡萃取板，重复 3 次。
  2. 将肽样品加入萃取板中，缓慢开启真空，控制流速低于 3 滴/秒，以尽量减少样品损失。
  3. 用 200 µL 含 1% TFA 的水溶液洗涤萃取板 3 次，再用 200 µL 含 2% MeOH（v/v）的 1% TFA 溶液洗涤一次。保持流速低于 3 滴/秒。
  4. 更换为 96 孔收集板。若无需分段收集，使用 100 µL 含 80% MeOH 的 1% TFA 溶液洗脱肽样品，重复 3 次，并将洗脱液合并至新的样品管中。在无加热条件下，使用真空浓缩仪干燥肽样品。
    ​注意：若需进行分段收集，可使用另一块收集板，依次用 200 µL 含 15%、35%、50% 和 90% MeOH 的 1% TFA 溶液将肽样品洗脱至 4 个不同组分中。

7. 比色法肽定量检测（可选）（1 小时）

  1. 用 50 µL 液相色谱-质谱级水重悬肽样品，并取 20 µL 等分试样进行肽定量分析。
    注意：此步骤消耗大量肽样品，但可在液相色谱-质谱分析前提供准确的肽浓度定量结果。通常每种样品类型仅在大规模样品制备前进行一次测试。
  2. 用液相色谱-质谱级水对显色法检测试剂盒中提供的肽标准溶液进行系列稀释。通过混合 50% 试剂 A、48% 试剂 B 和 2% 试剂 C 配制工作液。
  3. 将每种肽标准溶液（三个重复）和未知肽样品各 20 µL 转移至 96 孔微孔板中。向每个孔中加入 180 µL 工作液，充分混匀后，在室温下孵育 30 分钟。
  4. 使用微孔板读数仪在 480 nm 处测定吸光度，并根据肽标准曲线定量肽样品的浓度。

8. 液相色谱-质谱分析

  1. 用液相色谱缓冲液A（2%乙腈和0.1%甲酸，液相色谱-质谱级）重悬肽样品。在4 °C下以16,500 × g 离心10分钟，以去除任何可能的不溶性颗粒。
  2. 将上清液转移至液相色谱-质谱小瓶中。使用纳米液相色谱-质谱仪分析样品。
    注意：详细的液相色谱-质谱/质谱参数取决于仪器型号，此前已有描述22,25,26。
  3. 建立自定义的液相色谱-质谱排除列表，针对高丰度污染物肽峰（如链霉亲和素和胰蛋白酶）设定保留时间范围，并保持5 ppm的质量精度22（例如，常见的链霉亲和素肽峰为 m/z 402.5435 [电荷3]、m/z 603.3117 [电荷2]、m/z 654.9733 [电荷3]、m/z 678.6812 [电荷3]、m/z 1017.5182 [电荷2]等；常见的胰蛋白酶肽峰为 m/z 421.7584 [电荷2]、m/z 523.2855 [电荷2] 和 m/z 737.7062 [电荷3]）。

9. 蛋白质组学数据分析

  1. 使用蛋白质组学数据分析软件（如 Proteome Discoverer、MaxQuant27 或 MS-Fragger28）分析 LC-MS 原始数据。数据分析需包含两个 FASTA 文库：1）Swissprot Homo sapiens 参考数据库；2）新构建的通用污染物 FASTA 文库（https://github.com/HaoGroup-ProtContLib），该文库已被证明可提高蛋白质组鉴定的准确性并减少假阳性发现29。
  2. 设置蛋白质组学数据分析参数，蛋白质和肽段谱图匹配（PSM）鉴定的假发现率（FDR）阈值为 1%。选择胰蛋白酶消化，最多允许三个漏切位点；固定修饰为半胱氨酸的羧氨甲基化，可变修饰为甲硫氨酸氧化和蛋白质 N 端乙酰化。采用肽段 MS1 峰强度进行无标记定量。如先前所述22，将肽段强度归一化至内源性生物素化的羧化酶——丙酰辅酶 A 羧化酶（PCCA），以减少邻近标记实验中的变异。
    注意：在 Proteome Discoverer 软件中，可通过添加 PCCA 蛋白序列的 FASTA 文件来选择 PCCA 归一化；或者，也可在后续数据分析中进行 PCCA 归一化。
  3. 从蛋白质组学软件中导出蛋白水平的结果。在进行统计分析前，去除污染物蛋白29，并剔除仅有 1 个 PSM 或无定量结果的蛋白。使用 Enrichr30 进行蛋白基因本体（GO）术语分析，使用 STRING31 进行蛋白互作网络分析。

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结果

本项溶酶体邻近标记蛋白质组学研究在人诱导多能干细胞来源的神经元中进行，旨在捕获动态的溶酶体微环境 原位 在活神经元中。不同时间点的hiPSCs及hiPSC来源神经元的细胞形态如图所示。 图 2A人iPSCs在E8培养基中以克隆形式生长。通过将iPSCs接种至含多西环素的神经元诱导培养基中启动分化。在3天分化期间，每日均可观察到 neurite 突起逐渐增多。转接至PLO包被的培养板并在神经元培养基中继续培养后，神经元之间逐渐形成神经突网络，随着神经元在两周内趋于成熟，轴突延伸更加明显。在i3神经元中，通过快速激活 APEX 后进行荧光显微镜检测，验证 APEX 探针的定位。生物素标记的蛋白质使用链霉亲和素（SA）抗体染色，溶酶体使用抗 LAMP1 抗体染色。合并图像验证了 LAMP1-APEX 正确定位于诱饵蛋白图2B).

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讨论

利用这种LAMP1-APEX探针，溶酶体膜上及附近的蛋白质会被生物素标记并富集。鉴于溶酶体典型的直径为100–1,200 nm，该方法具有优异的细胞内分辨率，标记半径为10–20 nm。LAMP1是一种丰富的溶酶体膜蛋白，也是溶酶体的经典标志物，因此作为内源表达水平下溶酶体APEX标记的优良诱饵蛋白。然而，使用LAMP1靶向溶酶体也存在局限性，因为LAMP1同样存在于晚期内体和非降解性溶酶体中35。大多数溶酶体标志物也在晚期内体中表达，而晚期内体会最终成熟为溶酶体。可用于靶向溶酶体的其他诱饵蛋白包括LAMPTOR、LAMP2和TMEM19235,36,37。需要注意的是，反应性生物素自由基无法穿透膜结构，因此在该LAMP1-APEX蛋白质组学方法中，大多数仅存在于溶酶体腔内的蛋白质不会被捕获。溶酶体腔内蛋白可通过传统的密度梯度离心法或溶酶体免疫纯化方法获得4...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01NS121608）。A.M.F. 感谢 ARCS 大华府分会奖学金及 Bourbon F. Scribner 基金会奖学金的支持。我们感谢美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS）Michael Ward 实验室在分子生物学方面的支持以及对 i3Neuron 技术开发的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% (w/v) 皂苷溶液Acros Organics419231000荧光显微镜
AccutaseLife TechnologiesA1110501细胞解离溶液，细胞培养
B27 添加剂Fisher Scientific17504044细胞培养，皮层神经元培养基
BDNFPeproTech450-02细胞培养，皮层神经元培养基
硼酸Sigma-AldrichB6768细胞培养，硼酸盐缓冲液
牛血清白蛋白Millipore SigmaA8806用于配制标准溶液以测定总蛋白浓度
Brainphys 神经元培养基STEMCELL Technologies5790细胞培养，皮层神经元培养基
CD45R (B220) 抗体 Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82荧光显微镜
Chroman1 ROCK 抑制剂Tocris716310细胞培养
cOmplete mini 蛋白酶抑制剂Roche4693123001裂解缓冲液中的混合蛋白酶抑制剂
DC 蛋白定量检测试剂盒 IIBio-Rad5000112用于测定细胞裂解液中的总蛋白浓度
二甲基亚砜 (DMSO)Sigma-AldrichD8418邻近标记反应
DMEM/F12 培养基Thermo Fisher Scientific11320082细胞培养，培养皿包被
含 HEPES 的 DMEM/F12 培养基Thermo Fisher Scientific11330057细胞培养，诱导培养基
驴血清Sigma-AldrichD9663荧光显微镜
盐酸多西环素，≥98% (HPLC)Sigma-AldrichD9891-1G细胞培养，诱导培养基
Essential 8 培养基Thermo Fisher ScientificA1517001细胞培养
Essential 8 添加剂 (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101细胞培养
提取板真空 manifold 套件WatersWAT097944用于肽段脱盐
甲酸 (FA)Fisher ScientificA11750用于 LC-MS 分析
GDNFPeproTech450-10细胞培养，皮层神经元培养基
Hoechst 染料Thermo Fisher Scientific62239荧光显微镜
HPLC 级甲醇Fisher ScientificA452用于肽段脱盐
HPLC 级水Fisher ScientificW5用于肽段脱盐
人诱导性多能干细胞Corriell InstituteGM25256细胞培养
过氧化氢，ACS 级，29-32% w/w 水溶液，稳定型Thermo Fisher ScientificAA33323AD邻近标记反应
碘乙酰胺 (IAA)Millipore SigmaI6125用于蛋白质消化
层粘连蛋白Fisher Scientific23017015细胞培养，皮层神经元培养基
LC-MS 级乙腈Fisher ScientificA955用于 LC-MS 分析
LC-MS 级水Fisher ScientificW64用于 LC-MS 分析
L-谷氨酰胺Fisher Scientific25-030-081细胞培养，诱导培养基
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552基底膜基质，细胞培养，培养皿包被
小鼠抗人 LAMP1 单克隆抗体Developmental Studies Hybridoma Bankh4a3荧光显微镜
N-2 添加剂 (100x)Fisher Scientific17-502-048细胞培养，诱导培养基
硝酸纤维素膜，预切，0.45 µm，7 x 8.5 cmBio-Rad1620145用于磁珠滴定的点印迹实验
非必需氨基酸 (NEAA)Fisher Scientific11-140-050细胞培养，诱导培养基
NT-3PeproTech450-03细胞培养，皮层神经元培养基
Oasis HLB 96 孔固相萃取板Waters186000309用于肽段脱盐
Odyssey 封闭缓冲液 (TBS)LI-COR Biosciences927-50000用于磁珠滴定的点印迹实验
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710荧光显微镜
苯酚生物素 (1,000x 储存液)Adipogen41994-02-9邻近标记反应
不含钙镁的磷酸盐缓冲液 (PBS)Gibco10010049细胞培养，邻近标记反应，荧光显微镜
Pierce 定量比色肽段检测试剂盒Thermo Fisher23275肽段浓度测定
多聚-L-鸟氨酸 (PLO)Millipore SigmaP3655细胞培养，培养皿包被
抗坏血酸钠Sigma-AldrichA4034邻近标记淬灭缓冲液，裂解缓冲液
叠氮化钠Sigma-AldrichS8032邻近标记淬灭缓冲液，裂解缓冲液，荧光显微镜
氯化钠Thermo Fisher ScientificS271500细胞培养，硼酸盐缓冲液
十二烷基硫酸钠 (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220裂解缓冲液，点印迹实验缓冲液，磁珠洗涤缓冲液
氢氧化钠Sigma-Aldrich415413细胞培养，硼酸盐缓冲液
四硼酸钠Sigma-Aldrich221732细胞培养，硼酸盐缓冲液
SpeedVac 浓缩仪真空浓缩仪
链霉亲和素磁性 Sepharose 磁珠Cytiva (原 GE)28-9857-99富集生物素化蛋白
链霉亲和素，Alexa Fluor 680 标记物Thermo Fisher ScientificS32358用于磁珠滴定的点印迹实验
Thermomixer温控混匀仪
三氟乙酸 (TFA)Millipore Sigma302031用于肽段脱盐
三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (TCEP)Millipore SigmaC4706用于蛋白质消化
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500裂解缓冲液，点印迹实验缓冲液，磁珠洗涤缓冲液
吐温-XThermo Fisher ScientificBP151500磁珠洗涤缓冲液
TROLOXSigma-Aldrich648471邻近标记淬灭缓冲液，裂解缓冲液
胰蛋白酶/赖氨酰内肽酶混合物，质谱级PromegaV5073用于蛋白质消化
TWEEN 20Millipore SigmaP1379点印迹实验缓冲液
尿素Thermo Fisher ScientificBP169500磁珠洗涤及原位消化缓冲液
纤连蛋白STEMCELL Technologies7180细胞培养，培养皿包被
Y-27632 ROCK 抑制剂SelleckS1049细胞培养

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