本文描述了一种神经元溶酶体邻近标记蛋白质组学方案，用于表征人诱导多能干细胞来源神经元中动态的溶酶体微环境。该方法可在活体人神经元中以优异的细胞内空间分辨率，准确量化溶酶体膜蛋白以及与溶酶体稳定或 transiently 相互作用的蛋白质。
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方法文章
利用邻近标记蛋白质组学表征神经元溶酶体相互作用组
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
溶酶体经常与多种生物分子相互作用，以实现降解及其他多样的细胞功能。溶酶体对人类大脑功能至关重要，因为神经元是终末分化细胞，高度依赖自噬-溶酶体途径来维持细胞稳态。尽管在理解溶酶体多种功能方面已取得进展，但在技术上仍难以捕捉溶酶体与其他细胞组分之间高度动态的相互作用，尤其是在高通量条件下。本文提供了近期发表的一种内源性（基因敲入）溶酶体邻近标记蛋白质组学方法的详细实验方案，适用于人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元。
在活体人神经元中，可高置信度地鉴定并准确定量溶酶体膜蛋白以及溶酶体周围10-20 nm半径范围内的蛋白。本方案的每一步均进行了详细描述，包括hiPSC神经元培养、邻近标记、神经元收获、荧光显微镜观察、生物素化蛋白富集、蛋白质消化、液相色谱-质谱（LC-MS）分析及数据分析。总之，这种独特的内源性溶酶体邻近标记蛋白质组学方法为研究活体人神经元中高度动态的溶酶体活动提供了一种高通量且稳健的分析工具。
引言
溶酶体是通过溶酶体-自噬途径降解大分子的分解代谢细胞器1。除了降解功能外，溶酶体还参与多种细胞功能，如信号转导、营养感应和分泌过程2,3,4。溶酶体功能紊乱已被证实与溶酶体贮积症、癌症、衰老和神经退行性疾病相关3,5,6,7。对于终末分化且高度极化的神经元而言，溶酶体在维持神经元细胞稳态、神经递质释放以及轴突长距离运输中发挥着关键作用8,9,10,11。然而，在人类神经元中研究溶酶体一直是一项具有挑战性的任务。近年来，诱导性多能干细胞（iPSC）来源的神经元技术取得了进展，使得原本难以获取的活体人类神经元得以培养，从而弥合了动物模型与人类患者之间在脑科学研究上的差距
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方案
所有实验程序均经乔治·华盛顿大学生物安全与伦理委员会批准。表1中列出了本实验方案所用培养基和缓冲液的组成成分。本实验所用商品化产品的信息见材料表。
1. 人iPSC来源的神经元培养
- 人iPSC培养及LAMP1-APEX探针整合（7天）
- 将Matrigel储存液在4 °C条件下置于冰桶中过夜解冻，分装500 µL至预冷的无菌离心管中，并于−80°C保存。通过将500 µL Matrigel储存液加入49.5 mL预冷的DMEM/F12培养基中，制备50 mL包被溶液。
注意：保持Matrigel低温，使用预冷的锥形管和移液器吸头，以防止聚合。包被溶液可在4 °C保存2周。 - 在37 °C培养箱中，用4 mL包被溶液对10 cm细胞培养皿包被1小时。
注意：Vitronectin可作为替代包被溶液，浓度为5 µg/mL，包被时间为2小时，适用于iPSC培养。Vitronectin（单一蛋白组分）比Matrigel更昂贵，但批次间差异更小，背景信号更干净；而Matrigel是从鼠肿瘤中提取的，含有多种细胞外基质蛋白。Vitronectin包被需使用未经处理的组织培养板。Matrigel包被则适用于经处理和未经处理的组织培养板。 - 将1-3百万个hiPSC解冻后接种....
- 将Matrigel储存液在4 °C条件下置于冰桶中过夜解冻，分装500 µL至预冷的无菌离心管中，并于−80°C保存。通过将500 µL Matrigel储存液加入49.5 mL预冷的DMEM/F12培养基中，制备50 mL包被溶液。
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结果
本项溶酶体邻近标记蛋白质组学研究在人诱导多能干细胞来源的神经元中进行，旨在捕获动态的溶酶体微环境 原位 在活神经元中。不同时间点的hiPSCs及hiPSC来源神经元的细胞形态如图所示。 图 2A人iPSCs在E8培养基中以克隆形式生长。通过将iPSCs接种至含多西环素的神经元诱导培养基中启动分化。在3天分化期间，每日均可观察到 neurite 突起逐渐增多。转接至PLO包被的培养板并在神经元培养基中继续培养后，神经元之间逐渐形成神经突网络，随着神经元在两周内趋于成熟，轴突延伸更加明显。在i3神经元中，通过快速激活 APEX 后进行荧光显微镜检测，验证 APEX 探针的定位。生物素标记的蛋白质使用链霉亲和素（SA）抗体染色，溶酶体使用抗 LAMP1 抗体染色。合并图像验证了 LAMP1-APEX 正确定位于诱饵蛋白图2B).
珠滴定实验对于确定最佳珠子与蛋白质比例至关重要，以确保链霉亲和素珠子的量足以富集所有生物素化蛋白质，同.......
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讨论
利用这种LAMP1-APEX探针，溶酶体膜上及附近的蛋白质会被生物素标记并富集。鉴于溶酶体典型的直径为100–1,200 nm，该方法具有优异的细胞内分辨率，标记半径为10–20 nm。LAMP1是一种丰富的溶酶体膜蛋白，也是溶酶体的经典标志物，因此作为内源表达水平下溶酶体APEX标记的优良诱饵蛋白。然而，使用LAMP1靶向溶酶体也存在局限性，因为LAMP1同样存在于晚期内体和非降解性溶酶体中35。大多数溶酶体标志物也在晚期内体中表达，而晚期内体会最终成熟为溶酶体。可用于靶向溶酶体的其他诱饵蛋白包括LAMPTOR、LAMP2和TMEM19235,36,37。需要注意的是，反应性生物素自由基无法穿透膜结构，因此在该LAMP1-APEX蛋白质组学方法中，大多数仅存在于溶酶体腔内的蛋白质不会被捕获。溶酶体腔内蛋白可通过传统的密度梯度离心法或溶酶体免疫纯化方法获得4.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01NS121608）。A.M.F. 感谢 ARCS 大华府分会奖学金及 Bourbon F. Scribner 基金会奖学金的支持。我们感谢美国国立神经疾病与卒中研究所（NINDS）Michael Ward 实验室在分子生物学方面的支持以及对 i3Neuron 技术开发的贡献。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% (w/v) 皂苷溶液 | Acros Organics | 419231000 | 荧光显微镜 |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | 细胞解离溶液，细胞培养 |
| B27 添加剂 | Fisher Scientific | 17504044 | 细胞培养，皮层神经元培养基 |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | 细胞培养，皮层神经元培养基 |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B6768 | 细胞培养，硼酸盐缓冲液 |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | A8806 | 用于配制标准溶液以测定总蛋白浓度 |
| Brainphys 神经元培养基 | STEMCELL Technologies | 5790 | 细胞培养，皮层神经元培养基 |
| CD45R (B220) 抗体 Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | 荧光显微镜 |
| Chroman1 ROCK 抑制剂 | Tocris | 716310 | 细胞培养 |
| cOmplete mini 蛋白酶抑制剂 | Roche | 4693123001 | 裂解缓冲液中的混合蛋白酶抑制剂 |
| DC 蛋白定量检测试剂盒 II | Bio-Rad | 5000112 | 用于测定细胞裂解液中的总蛋白浓度 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | 邻近标记反应 |
| DMEM/F12 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | 细胞培养，培养皿包被 |
| 含 HEPES 的 DMEM/F12 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | 细胞培养，诱导培养基 |
| 驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 | 荧光显微镜 |
| 盐酸多西环素，≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | 细胞培养，诱导培养基 |
| Essential 8 培养基 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | 细胞培养 |
| Essential 8 添加剂 (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | 细胞培养 |
| 提取板真空 manifold 套件 | Waters | WAT097944 | 用于肽段脱盐 |
| 甲酸 (FA) | Fisher Scientific | A11750 | 用于 LC-MS 分析 |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | 细胞培养，皮层神经元培养基 |
| Hoechst 染料 | Thermo Fisher Scientific | 62239 | 荧光显微镜 |
| HPLC 级甲醇 | Fisher Scientific | A452 | 用于肽段脱盐 |
| HPLC 级水 | Fisher Scientific | W5 | 用于肽段脱盐 |
| 人诱导性多能干细胞 | Corriell Institute | GM25256 | 细胞培养 |
| 过氧化氢，ACS 级，29-32% w/w 水溶液，稳定型 | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | 邻近标记反应 |
| 碘乙酰胺 (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | 用于蛋白质消化 |
| 层粘连蛋白 | Fisher Scientific | 23017015 | 细胞培养，皮层神经元培养基 |
| LC-MS 级乙腈 | Fisher Scientific | A955 | 用于 LC-MS 分析 |
| LC-MS 级水 | Fisher Scientific | W64 | 用于 LC-MS 分析 |
| L-谷氨酰胺 | Fisher Scientific | 25-030-081 | 细胞培养，诱导培养基 |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | 基底膜基质，细胞培养，培养皿包被 |
| 小鼠抗人 LAMP1 单克隆抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | 荧光显微镜 |
| N-2 添加剂 (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | 细胞培养，诱导培养基 |
| 硝酸纤维素膜，预切，0.45 µm，7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | 用于磁珠滴定的点印迹实验 |
| 非必需氨基酸 (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | 细胞培养，诱导培养基 |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | 细胞培养，皮层神经元培养基 |
| Oasis HLB 96 孔固相萃取板 | Waters | 186000309 | 用于肽段脱盐 |
| Odyssey 封闭缓冲液 (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | 用于磁珠滴定的点印迹实验 |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 荧光显微镜 |
| 苯酚生物素 (1,000x 储存液) | Adipogen | 41994-02-9 | 邻近标记反应 |
| 不含钙镁的磷酸盐缓冲液 (PBS) | Gibco | 10010049 | 细胞培养，邻近标记反应，荧光显微镜 |
| Pierce 定量比色肽段检测试剂盒 | Thermo Fisher | 23275 | 肽段浓度测定 |
| 多聚-L-鸟氨酸 (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | 细胞培养，培养皿包被 |
| 抗坏血酸钠 | Sigma-Aldrich | A4034 | 邻近标记淬灭缓冲液，裂解缓冲液 |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S8032 | 邻近标记淬灭缓冲液，裂解缓冲液，荧光显微镜 |
| 氯化钠 | Thermo Fisher Scientific | S271500 | 细胞培养，硼酸盐缓冲液 |
| 十二烷基硫酸钠 (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | 裂解缓冲液，点印迹实验缓冲液，磁珠洗涤缓冲液 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 415413 | 细胞培养，硼酸盐缓冲液 |
| 四硼酸钠 | Sigma-Aldrich | 221732 | 细胞培养，硼酸盐缓冲液 |
| SpeedVac 浓缩仪 | 真空浓缩仪 | ||
| 链霉亲和素磁性 Sepharose 磁珠 | Cytiva (原 GE) | 28-9857-99 | 富集生物素化蛋白 |
| 链霉亲和素，Alexa Fluor 680 标记物 | Thermo Fisher Scientific | S32358 | 用于磁珠滴定的点印迹实验 |
| Thermomixer | 温控混匀仪 | ||
| 三氟乙酸 (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | 用于肽段脱盐 |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | 用于蛋白质消化 |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | 裂解缓冲液，点印迹实验缓冲液，磁珠洗涤缓冲液 |
| 吐温-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | 磁珠洗涤缓冲液 |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | 邻近标记淬灭缓冲液，裂解缓冲液 |
| 胰蛋白酶/赖氨酰内肽酶混合物，质谱级 | Promega | V5073 | 用于蛋白质消化 |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | 点印迹实验缓冲液 |
| 尿素 | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | 磁珠洗涤及原位消化缓冲液 |
| 纤连蛋白 | STEMCELL Technologies | 7180 | 细胞培养，培养皿包被 |
| Y-27632 ROCK 抑制剂 | Selleck | S1049 | 细胞培养 |
参考文献
- De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (....
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