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方法文章

蜜蜂组织学基础及组织中细胞死亡检测

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DOI：

10.3791/64141

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2022年7月7日

1Agricultural Institute of Slovenia

本文内容

摘要

免疫组织化学方法可用于蜜蜂研究，以检测和评估成年蜜蜂中肠和咽下腺中细胞凋亡和坏死的程度。

摘要

蜜蜂（Apis mellifera L.）在蜂巢内（哺育蜂及其他巢内蜂）和蜂巢外（采集蜂）会暴露于气候变化和天气波动、多种杀虫剂、病原体以及营养不良等环境，这些因素主要通过口器进入，并主要影响成年蜜蜂的消化道。为了理解并预防这些内外部应激因素对蜜蜂的影响，一种有效的研究方法是免疫组织化学方法。本文描述了一种基本实验方案，用于制备成年蜜蜂的中肠（胃盲囊）和咽下腺（HPGs），以进行组织学分析。同时详细阐述了一种方法，用于评估细胞损伤程度，并区分作为组织自然再生过程的坏死与程序性细胞死亡（凋亡）。文中展示了成年蜜蜂经草酸及杀虫剂（杀虫剂和杀螨剂）处理后的实验结果，以及对胃盲囊和咽下腺中细胞死亡的判定。此外，还讨论了该方法的优缺点。

引言

蜜蜂（Apis mellifera L.）是众多野生传粉昆虫中对农作物授粉最为重要的传粉者。数千年来，不断变化的环境促使蜜蜂在形态、生理、行为以及对多种病原体和寄生虫的耐受性方面发生适应性演化。因此，全球范围内已形成高度多样化的蜜蜂物种和亚种1。这些结果与先前的研究发现一致，表明蜜蜂消化道结构存在遗传变异，但也提示中肠的改变可能由环境因素所致2,3。

蜜蜂的消化道分为三个主要部分：前肠、中肠（胃）和后肠4。胃是消化花粉以及花蜜/蜂蜜的重要器官；后肠则通过吸收水分和离子实现渗透调节2。蜜蜂工蜂的咽下腺位于头部，可合成并分泌蜂王浆成分，用于饲喂幼虫、蜂后及蜂群其他成员。咽下腺的大小随年龄和任务变化，并依赖于良好的营养（优质花粉）。6至18日龄的哺育蜂负责育幼工作，其咽下腺体积增大5,6。在采集蜂中，咽下腺退化，仅分泌对蜂蜜中复杂糖类转化为简单糖类至关重要的酶类（如α-葡萄糖苷酶、亮氨酸芳基氨基肽酶、转化酶）7。

蜜蜂会受到多种生物性和非生物性胁迫因素的影响8，其消化道可能受到多种有害刺激物的影响。保护机体免受病原体侵袭的第一道屏障是中肠的围食膜，该结构由肠道黏膜组成，可抵御病原体入侵4。咽下腺（HPGs）的发育和功能受饮食、年龄和蜂群状态的影响9，同时也受到杀虫剂、杀螨剂10以及病原体11,12,13的干扰。由于防治瓦螨所使用的杀螨剂在蜂巢中残留，以及来自环境中的农药，都会影响采集蜂和哺育蜂14,15。目前对蜜蜂蜂群最大的威胁是瓦螨（Varroa destructor），它不仅作为传播病毒的媒介导致蜂群衰亡16 ，还通过取食寄主的脂肪体（蜜蜂体内重要的生命器官）而影响个体生理及蜂群整体功能17。

然而，集约化农田生境可为蜜蜂提供短期的食物来源。因此，农业环境管理措施应提高农业景观中蜜源植物的可获得性18。为了评估不同亚种6,19,20,21 ，或这些因素在细胞或组织水平（尤其是中肠和咽侧体）的亚致死效应，组织学和免疫组织化学方法在蜜蜂组织学研究中具有实用性和足够的准确性。

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方案

1. 蜜蜂研究的基础组织学

  1. 蜜蜂组织解剖
    注意：解剖工蜂时，使用带有LED光源的解剖显微镜。最适宜的放大倍数约为20倍。
    1. 操作与解剖
      1. 用镊子小心夹取一只工蜂，将其置于冰上（或-20 °C冰箱中）2分钟以固定其活动22。将蜜蜂以对角线方向用大头针固定于培养皿中，针从胸部最上部区域左右两侧各穿刺一次，分别从左至右和从右至左穿过。
      2. 倒入昆虫生理盐水以浸没虫体。将培养皿置于显微镜下，调焦并调整视野。
      3. 准备所需器械（见材料表）。
    2. 中肠解剖
      1. 从腹部开始，在蜜蜂身体右侧中部将剪刀尖插入第五腹板（A5）下方（图1），剪至第二腹板（A2）。
      2. 保持剪刀内侧刀刃与虫体侧面平行，避免损伤内部器官。将剪刀向左转动并剪开一次，再向右转动剪开另一次。轻轻打开腹部左侧部分并用大头针固定。在另一侧重复此操作。
      3. 一手持镊子轻轻向上提起蜜蜂的胃部，另一手持剪刀在食道末端处剪断。将胃和中肠从腹部拉出，并在直肠处剪断。使用移液器吸取昆虫生理盐水冲洗，去除粪便或组织碎片。
    3. 咽侧体-脑复合体（HPGs）解剖
      1. 如步骤1.1.1所述，将工蜂置于冰上固定。剪下头部，将其放置在较小的培养皿中，使触角朝上。用两枚大头针分别穿过左、右复眼，将头部固定。
      2. 在两枚大头针内侧，从第一只复眼内侧横向剪开，延伸至唇基，然后在另一侧同样横穿第二只复眼剪开（图2）。
      3. 剪除触角。掀起头壳面具并在残留连接处剪断。用镊子小心取出腺体，连同脑组织及部分复眼一并移出。
  2. 固定、脱水与石蜡包埋
    注意：佩戴防护手套。
    1. 将组织放入青霉素瓶中，加入占瓶体积3/4的10%福尔马林溶液。置于4 °C冰箱中保存。
    2. 24小时后，依次用系列酒精进行脱水处理：70%、80%、90%、100%酒精各1小时，随后100% 2-丙醇1小时，再换为100% 2-丙醇浸泡12小时，最后再用100% 2-丙醇1小时。
    3. 将组织放入组织包埋盒中，标记后置于玻璃容器内，加入2-丙醇与石蜡（1:1）混合液，在60 °C恒温箱中孵育24小时。
    4. 将组织包埋盒转移至另一含纯石蜡（I）的容器中继续孵育24小时。更换新鲜石蜡重复该步骤两次（II和III），每次均为24小时。
    5. 最后，准备包埋台并开始将组织包埋入石蜡中。
      1. 打开每个组织包埋盒，取下盖子。在模具中注满石蜡，用预热的镊子小心将组织置于模具中央。
      2. 将组织包埋盒盖在模具上，并稍加覆盖一层石蜡。立即将模具置于包埋台的冷面上数秒钟，然后移至冷板上数分钟，直至石蜡完全凝固，模具与包埋盒可整体分离。
    6. 将制备完成的样品存放于密闭盒中，避免灰尘和高温。
    7. 使用切片机切取4 µm厚的切片：先连续切两片相连的切片，再单独切一片。用镊子转移切片，使其漂浮于蒸馏水（42 °C）表面，然后收集到洁净载玻片上——将前两片并列置于载玻片左侧，第三片单独置于右侧，保持彼此明显分离。将标记好的载玻片置于加热装置上过夜，最后存放于专用于组织学样本的储存盒中。
  3. 脱蜡与再水化
    注意：佩戴防护手套。
    1. 准备九个科卜林瓶，将切片依次浸入三种透明剂（I、II、III）中，每种5分钟。
    2. 依次浸入2-丙醇、96%乙醇（I、II）、90%酒精、80%酒精和蒸馏水中，每种试剂处理3分钟。
  4. 苏木精-伊红染色（H&E染色）
    注意：佩戴防护手套。
    1. 准备六个科卜林瓶。
    2. 进行苏木精-伊红（H&E）染色时，将已脱蜡并再水化的切片浸入苏木精染液中5分钟，随后小心置于流动自来水下冲洗2分钟。接着依次浸入蒸馏水中1分钟，再放入伊红染液中4分钟（伊红染色无需使用科卜林瓶）。
    3. 将载玻片依次浸入96%乙醇1分钟、2-丙醇2分钟，最后浸入透明剂中2分钟。
    4. 滴加封片剂，加盖盖玻片，静置干燥。在光学显微镜下观察。

显示体节 A1-A7 标注的昆虫解剖结构图，用于昆虫学研究的详细结构。
图 1：蜜蜂身体的背侧视图。 A1-A7 为背板。有关蜜蜂解剖的详细说明，参见 Carreck 等人24。 请点击此处查看此图的放大版本。

显微镜下的真菌组织，真菌学实验；细胞结构，500 μm 尺度。
图 2：咽侧体（HPGs）的背侧观，复眼部分与脑部相连（不可见）。 一只5至6日龄的年轻工蜂具有饱满且呈乳白色的咽侧体（HPGs）。腺泡位于脑部，并以分支结构延伸至头部区域，直至脑后部。在采集蜂中，这些腺体显著萎缩，仅留下细线状的残余组织。因此，建议将腺体与脑部一同取出，以便在后续操作中避免组织丢失。比例尺 = 500 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

2. 组织切片中细胞死亡的检测

  1. 细胞凋亡检测试剂盒（检测方法 A）
    注意：请遵循制造商的说明书（参见材料表）。
    1. 准备考普林瓶（Coplin jars）。
    2. 脱蜡和复水后（参见步骤 1.3），将切片浸入 0.85% NaCl 溶液，然后浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中（5 分钟）。
    3. 将切片置于 4% 多聚甲醛中，2 次，每次 15 分钟。
    4. 将切片平放在容器中，加入 100 µL 蛋白酶 K（20 µg/mL）溶液，静置 10–30 分钟。
    5. 将切片放入 PBS 中（5 分钟）。
    6. 将切片置于含 4% 多聚甲醛的 PBS 中（5 分钟）。
    7. 将切片浸入 PBS 中（2 次，每次 5 分钟）。
    8. 将切片平放在容器中，加入 100 µL 平衡缓冲液，静置 5–10 分钟。
    9. 加入 100 µL TdT 反应混合液。在容器内切片周围放入纸巾，用水润湿纸巾，然后用塑料膜覆盖。37 °C 孵育 60 分钟。
    10. 将切片放回染色架中，浸入 2× 柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液中 15 分钟。
    11. 将切片在 PBS 中浸洗 3 次，每次 5 分钟，然后在 0.3% 过氧化氢中处理 3–5 分钟，再在 PBS 中浸洗 3 次，每次 5 分钟。
    12. 再次将切片平放在容器中，加入 100 µL 链霉亲和素-HRP（辣根过氧化物酶），静置 30 分钟（用塑料膜覆盖）。
    13. 将切片在 PBS 中浸洗 3 次，每次 5 分钟。
    14. 将切片平放在容器中，加入 100 µL 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液。观察是否出现浅棕色背景。
    15. 将切片放回染色架，用双蒸水多次冲洗。
    16. 用封片介质将切片加盖盖玻片封片，并平放晾干。
    17. 在光学显微镜下观察。
  2. 细胞凋亡检测试剂盒（检测方法 B）
    注意：请遵循制造商的说明书（参见材料表）。
    1. 准备考普林瓶（Coplin jars）。
    2. 配制蛋白酶 K 溶液（20 µg/mL，用 PBS 稀释）。
    3. 切片脱蜡和复水后（步骤 1.3），将切片置于 PBS 中 5 分钟。
    4. 将切片平放在容器中，加入蛋白酶 K（20 µg/mL，每 5 cm² 样本加 60 µL）。
    5. 用蒸馏水清洗切片 2 次，每次 2 分钟。
    6. 在室温下用内源性过氧化物酶淬灭液（3% 过氧化氢）处理。
    7. 用 PBS 或水冲洗切片 2 次，每次 5 分钟。
    8. 将切片平放在容器中，加入平衡缓冲液（75 µL/5 cm2），室温下处理 10 秒。
    9. 小心擦去组织周围的液体。
    10. 向每个切片加入 TdT 酶（末端脱氧核苷酸转移酶），在湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。在托盘内切片周围放入纸巾，用水润湿纸巾，然后用塑料膜覆盖。
    11. 孵育后，将样本放回染色架中，在终止/洗涤缓冲液中静置 10 分钟。
    12. 将抗地高辛抗体-过氧化物酶偶联物恢复至室温。
    13. 在 PBS 中清洗切片 3 次，每次 1 分钟。
    14. 小心擦去组织周围的液体。
    15. 向切片加入两滴抗地高辛-过氧化物酶偶联物（65 µL/5 cm²），在湿盒中孵育 30 分钟。
    16. 在 PBS 中清洗 4 次，每次 2 分钟，然后配制工作浓度的过氧化物酶底物溶液，轻轻拍去多余液体，并吸除切片周围的液体。
    17. 用过氧化物酶底物（75 µL/5 cm²）覆盖切片，染色 5 分钟。取一张切片在显微镜下观察，确定最佳染色时间。
    18. 在染色架中用蒸馏水清洗切片（3 次，每次 1 分钟）。
    19. 将切片在蒸馏水中孵育 5 分钟。
    20. 用苏木精复染 2 分钟。
    21. 将切片置于流动自来水下冲洗 3 分钟。
    22. 用蒸馏水清洗切片。
    23. 用封片介质将切片加盖盖玻片封片，并平放晾干。
    24. 在光学显微镜下观察。
  3. 细胞凋亡检测试剂盒（检测方法 C）
    注意：请遵循制造商的说明书（参见材料表）。
    1. 准备考普林瓶（Coplin jars）。
    2. 对组织切片进行脱蜡和复水（参见步骤 1.3）。
    3. 用蛋白酶 K 处理组织（37 °C 孵育 15–30 分钟）。
    4. 将切片放回染色架，用 PBS 冲洗 2 次。
    5. 加入 50 µL “TUNEL 反应混合液”。在容器内放入湿润的纸巾，用塑料膜覆盖，37 °C 孵育 60 分钟。
    6. 用 PBS 冲洗 3 次。
    7. 将切片放入容器中，擦干组织样本周围的区域。
    8. 向样本加入 50 µL Converter-AP 溶液，在湿盒中 37 °C 孵育 30 分钟。
    9. 用 PBS 冲洗 3 次。
    10. 加入 50–100 µL 底物溶液，避光静置 10 分钟。
      注意：在光学显微镜下观察染色情况。
    11. 用 PBS 冲洗切片 3 次。
    12. 将切片转移至苏木精中复染 2 分钟，然后在流动自来水下小心冲洗 5 分钟。
    13. 用含水封片介质将切片加盖盖玻片封片，并平放晾干。
    14. 在光学显微镜下观察。在中肠或 HPGs 样本中，通过光学显微镜计数每个样本中 70 至 100 个细胞，评估受影响（阳性）细胞的比例。

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结果

中肠细胞死亡检测
从斯洛文尼亚卢布尔雅那农业研究所实验蜂场新羽化的工蜂（Apis mellifera carnica）个体接受3% 草酸（OA）处理23。草酸在养蜂业中常用于防治Varroa destructor。处理后，将工蜂（每组三只）置于冰上固定，解剖中肠并用10%福尔马林固定。组织随后经系列酒精溶液脱水，最终包埋于石蜡中。使用切片机切成7 µm厚的切片后，制备组织样本用于分析。在光学显微镜下，计算受影响细胞的百分比（每三个中肠样本中各计数70–100个细胞）。Assay B的结果表明，OA处理显著影响了中肠细胞（图3）。Assay A显示处理组与对照组蜜蜂之间无差异；细胞死亡率低于10%。仅饲喂糖浆的对照组蜜蜂，其中肠形态未受影响且保存良好。

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讨论

在生物体内，细胞死亡分为凋亡或坏死25 ，并可能伴随自噬现象26。凋亡细胞与坏死细胞的区别在于，凋亡是一种程序性细胞死亡形式，出现在正常细胞中；而坏死则是由致死性条件（如意外、疾病）引起的27,28。凋亡可通过基于TUNEL技术的检测试剂盒进行检测（通过标记凋亡过程中产生的双链DNA断裂处的3′-羟基末端来检测DNA片段化）。不同试剂盒在检测细胞清除方面具有不同的灵敏度水平。

其中一种检测方法（检测C）具有高灵敏度，可同时检测凋亡和坏死29；另一种检测方法（检测B）在检测凋亡性细胞死亡方面表现出更高的灵敏度30。检测C的原理是检测凋亡早期阶段的DNA断裂。在固定并通透凋亡细胞后，将组织与TUNEL反应混合液共同孵育。在此过程中，末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的作用是催...

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致谢

我衷心感谢斯洛文尼亚研究署提供的支持，资助编号 P4-133。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-丙醇
ApopTag 过氧化物酶试剂盒（ApopTag 过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒）Sigma-AldrichS7100检测方法 B，https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA
jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE
j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx
H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA
vD_BwE；S7101 包含阳性对照
盖玻片
DeadEnd 比色法 TUNEL 系统PromegaG7360检测方法 A，https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
解剖显微镜 （用于蜜蜂解剖）Zeiss
蒸馏水
包埋盒
EnVision 系统碱性磷酸酶试剂盒Dako
伊红 Y 溶液Sigma-Aldrich醇溶性
乙醇95%（或纯度较低）、90%、80%
Faramount 水性封片介质Dako封片介质
展片台LeicaHI1220
镊子 （用于蜜蜂解剖）Fine science tools11294-00标准 #4
10% 甲醛甲醛
苏木精Sigma-Aldrich
HistoChoice 透明剂Sigma-Aldrich透明剂
3% 过氧化氢
培养箱BioRad
昆虫针 （用于蜜蜂解剖）Entosphinx44594不锈钢昆虫针 – 白色，2 号
ISCDDK, AP（原位细胞死亡检测试剂盒，碱性磷酸酶）Roche11684809910检测方法 C，https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b
ul.pdf
KH2PO4
实验室时钟
光学显微镜Leica
显微镜载玻片载玻片盒必须用塑料膜包裹保存，以防灰尘污染
切片机Leica
模块化组织包埋站Leica
Na2HPO4
NaCl
4% 多聚甲醛
Paraplast 包埋剂Leica
巴斯德移液管1.5 mL；3 mL
PBS
培养皿 （用于蜜蜂解剖）填充冷凝硅胶 （Xantoprene L 蓝色和 Universal liquid plus 激活剂）
蛋白酶 KMerck21627
Ringer 氏溶液 （用于蜜蜂解剖）7.5 g NaCl，2.38 g Na2HPO4，2.72 g KH2PO4，1 L 蒸馏水
剪刀 （用于蜜蜂解剖）Fine science tools1406-09, 14061-09直头和弯头，9 cm
Universal liquid plus 激活剂 （用于蜜蜂解剖）Kulzer
钟表镊’s 镊子（用于蜜蜂解剖）Fine science tools91100-12
水浴锅Leica
水彩画笔2 支
Xantoprene L 蓝色 （用于蜜蜂解剖）Kulzer

参考文献

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