蜜蜂组织学基础及组织中细胞死亡检测

摘要

免疫组织化学方法可用于蜜蜂研究，以检测和评估成年蜜蜂中肠和咽下腺中细胞凋亡和坏死的程度。

摘要

蜜蜂（Apis mellifera L.）在蜂巢内（哺育蜂及其他巢内蜂）和蜂巢外（采集蜂）会暴露于气候变化和天气波动、多种杀虫剂、病原体以及营养不良等环境，这些因素主要通过口器进入，并主要影响成年蜜蜂的消化道。为了理解并预防这些内外部应激因素对蜜蜂的影响，一种有效的研究方法是免疫组织化学方法。本文描述了一种基本实验方案，用于制备成年蜜蜂的中肠（胃盲囊）和咽下腺（HPGs），以进行组织学分析。同时详细阐述了一种方法，用于评估细胞损伤程度，并区分作为组织自然再生过程的坏死与程序性细胞死亡（凋亡）。文中展示了成年蜜蜂经草酸及杀虫剂（杀虫剂和杀螨剂）处理后的实验结果，以及对胃盲囊和咽下腺中细胞死亡的判定。此外，还讨论了该方法的优缺点。

引言

蜜蜂（Apis mellifera L.）是众多野生传粉昆虫中对农作物授粉最为重要的传粉者。数千年来，不断变化的环境促使蜜蜂在形态、生理、行为以及对多种病原体和寄生虫的耐受性方面发生适应性演化。因此，全球范围内已形成高度多样化的蜜蜂物种和亚种¹。这些结果与先前的研究发现一致，表明蜜蜂消化道结构存在遗传变异，但也提示中肠的改变可能由环境因素所致^2,3。

蜜蜂的消化道分为三个主要部分：前肠、中肠（胃）和后肠⁴。胃是消化花粉以及花蜜/蜂蜜的重要器官；后肠则通过吸收水分和离子实现渗透调节²。蜜蜂工蜂的咽下腺位于头部，可合成并分泌蜂王浆成分，用于饲喂幼虫、蜂后及蜂群其他成员。咽下腺的大小随年龄和任务变化，并依赖于良好的营养（优质花粉）。6至18日龄的哺育蜂负责育幼工作，其咽下腺体积增大^5,6。在采集蜂中，咽下腺退化，仅分泌对蜂蜜中复杂糖类转化为简单糖类至关重要的酶类（如α-葡萄糖苷酶、亮氨酸芳基氨基肽酶、转化酶）⁷。

方案

1. 蜜蜂研究的基础组织学

1. 蜜蜂组织解剖
   注意：解剖工蜂时，使用带有LED光源的解剖显微镜。最适宜的放大倍数约为20倍。
   1. 操作与解剖
      1. 用镊子小心夹取一只工蜂，将其置于冰上（或-20 °C冰箱中）2分钟以固定其活动²²。将蜜蜂以对角线方向用大头针固定于培养皿中，针从胸部最上部区域左右两侧各穿刺一次，分别从左至右和从右至左穿过。
      2. 倒入昆虫生理盐水以浸没虫体。将培养皿置于显微镜下，调焦并调整视野。
      3. 准备所需器械（见材料表）。
   2. 中肠解剖
      1. 从腹部开始，在蜜蜂身体右侧中部将剪刀尖插入第五腹板（A5）下方（图1），剪至第二腹板（A2）。
      2. 保持剪刀内侧刀刃与虫体侧面平行，避免损伤内部器官。将剪刀向左转动并剪开一次，再向右转动剪开另一次。轻轻打开腹部左侧部分并用大头针固定。在另一侧重复此操作。
      3. 一手持镊子轻轻向上提起蜜蜂的胃部，另一手持剪刀在食道末端处剪断。将胃和中肠从腹部拉出，并在直肠处剪断。使用移液器吸取昆虫生理盐水冲洗，去除粪便或组织碎片。
   3. 咽侧体-脑复合体....

结果

中肠细胞死亡检测
从斯洛文尼亚卢布尔雅那农业研究所实验蜂场新羽化的工蜂（Apis mellifera carnica）个体接受3% 草酸（OA）处理²³。草酸在养蜂业中常用于防治Varroa destructor。处理后，将工蜂（每组三只）置于冰上固定，解剖中肠并用10%福尔马林固定。组织随后经系列酒精溶液脱水，最终包埋于石蜡中。使用切片机切成7 µm厚的切片后，制备组织样本用于分析。在光学显微镜下，计算受影响细胞的百分比（每三个中肠样本中各计数70–100个细胞）。Assay B的结果表明，OA处理显著影响了中肠细胞（图3）。Assay A显示处理组与对照组蜜蜂之间无差异；细胞死亡率低于10%。仅饲喂糖浆的对照组蜜蜂，其中肠形态未受影响且保存良好。

讨论

在生物体内，细胞死亡分为凋亡或坏死²⁵ ，并可能伴随自噬现象²⁶。凋亡细胞与坏死细胞的区别在于，凋亡是一种程序性细胞死亡形式，出现在正常细胞中；而坏死则是由致死性条件（如意外、疾病）引起的^27,28。凋亡可通过基于TUNEL技术的检测试剂盒进行检测（通过标记凋亡过程中产生的双链DNA断裂处的3′-羟基末端来检测DNA片段化）。不同试剂盒在检测细胞清除方面具有不同的灵敏度水平。

其中一种检测方法（检测C）具有高灵敏度，可同时检测凋亡和坏死²⁹；另一种检测方法（检测B）在检测凋亡性细胞死亡方面表现出更高的灵敏度³⁰。检测C的原理是检测凋亡早期阶段的DNA断裂。在固定并通透凋亡细胞后，将组织与TUNEL反应混合液共同孵育。在此过程中，末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的作用是催.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-丙醇
ApopTag 过氧化物酶试剂盒（ApopTag 过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒）	Sigma-Aldrich	S7100	检测方法 B，https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE；S7101 包含阳性对照
盖玻片
DeadEnd 比色法 TUNEL 系统	Promega	G7360	检测方法 A，https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360
解剖显微镜 （用于蜜蜂解剖）	Zeiss
蒸馏水
包埋盒
EnVision 系统碱性磷酸酶试剂盒	Dako
伊红 Y 溶液	Sigma-Aldrich		醇溶性
乙醇			95%（或纯度较低）、90%、80%
Faramount 水性封片介质	Dako		封片介质
展片台	Leica	HI1220
镊子 （用于蜜蜂解剖）	Fine science tools	11294-00	标准 #4
10% 甲醛			甲醛
苏木精	Sigma-Aldrich
HistoChoice 透明剂	Sigma-Aldrich		透明剂
3% 过氧化氢
培养箱	BioRad
昆虫针 （用于蜜蜂解剖）	Entosphinx	44594	不锈钢昆虫针 – 白色，2 号
ISCDDK, AP（原位细胞死亡检测试剂盒，碱性磷酸酶）	Roche	11684809910	检测方法 C，https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf
KH2PO4
实验室时钟
光学显微镜	Leica
显微镜载玻片			载玻片盒必须用塑料膜包裹保存，以防灰尘污染
切片机	Leica
模块化组织包埋站	Leica
Na2HPO4
NaCl
4% 多聚甲醛
Paraplast 包埋剂	Leica
巴斯德移液管			1.5 mL；3 mL
PBS
培养皿 （用于蜜蜂解剖）			填充冷凝硅胶 （Xantoprene L 蓝色和 Universal liquid plus 激活剂）
蛋白酶 K	Merck	21627
Ringer 氏溶液 （用于蜜蜂解剖）			7.5 g NaCl，2.38 g Na2HPO4，2.72 g KH2PO4，1 L 蒸馏水
剪刀 （用于蜜蜂解剖）	Fine science tools	1406-09, 14061-09	直头和弯头，9 cm
Universal liquid plus 激活剂 （用于蜜蜂解剖）	Kulzer
钟表镊’s 镊子（用于蜜蜂解剖）	Fine science tools	91100-12
水浴锅	Leica
水彩画笔			2 支
Xantoprene L 蓝色 （用于蜜蜂解剖）	Kulzer