黑足蜱 Ixodes scapularis 基因编辑的胚胎注射技术

摘要

本方案描述了一种蜱胚胎显微注射的方法。胚胎注射是进行遗传操作以建立转基因品系的首选技术。

摘要

蜱虫可传播多种病毒、细菌和原生动物病原体，因此被视为具有重要医学和兽医意义的传播媒介。尽管蜱传疾病的负担日益加重，但由于蜱虫独特的生物学特性使得遗传转化工具在功能研究中的应用面临挑战，导致蜱虫相关研究落后于昆虫病媒。近年来，遗传干预手段在控制蚊媒疾病方面受到越来越多关注。然而，此类干预措施的开发需要通过胚胎显微注射实现稳定的种系转化。但包括蜱虫在内的螯肢动物至今缺乏相应的胚胎注射技术。蜱虫胚胎外部具有较厚的蜡质层、坚硬的卵壳以及较高的卵内压力等因素，是此前阻碍蜱虫胚胎注射方案建立的主要障碍 。本研究已克服上述难题，本文描述了一种针对黑腿蜱 Ixodes scapularis 的胚胎注射技术 。该技术可用于递送CRISPR/Cas9等成分，实现稳定的种系遗传转化。

引言

蜱是具有重要医学和兽医意义的传播媒介，能够传播多种病毒、细菌、原生动物病原体以及线虫^1,2。在美国东部，黑腿蜱（Ixodes scapularis）是莱姆病（LD）病原体——螺旋体Borrelia burgdorferi的重要传播媒介。美国每年报告超过40万例莱姆病病例，使其成为美国最主要的虫媒传染病¹。除B. burgdorferi外，I. scapularis还可传播另外六种微生物，包括四种细菌（Anaplasma phagocytophilum、B. mayonii、B. miyamotoi和Ehrlichia muris eauclarensis）、一种原生动物寄生虫（Babesia microti）以及一种病毒（Powassan病毒），因此该蜱种已成为重大的公共卫生问题³。尽管近年来蜱传疾病日益普遍，但由于蜱独特的生物学特性以及在应用遗传学和功能基因组学工具方面所面临的挑战，蜱类研究仍落后于其他节肢动物媒介（如蚊子） ^4,5。

基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9，现已使非模式生物的功能基因组学研究成为可能。为了在生物体中产生可遗传的突变，胚胎显微注射仍是递送构建体以改造生殖系的首选方法^6,7,8,9。然而，直到最近⁴，蜱虫卵一直被认为极难甚至无法在不杀死胚胎的情况下进行显微注射^10,11。卵壳表面厚厚的蜡质层、坚硬的卵壳以及高卵内压力是阻碍蜱虫胚胎注射的主要障碍。饱血的成年I. scapularis可在3至4周内产下单批多达2,000枚的卵（约每天100枚）¹²。卵为单粒产出，每枚卵均被母体腺体Gené器官的突起或"角状结构"分泌的蜡质所包裹^13,14,15 。该蜡质层可防止卵脱水，并含有抗菌化合物¹⁵。为了成功注射蜱虫卵，必须去除蜡质层、软化卵壳，并适度脱水以降低卵内压力，从而避免注射过程对卵造成不可逆损伤。鉴于胚胎注射在实现成功生殖系转化中的关键作用，目前已建立了一套适用于I. scapularis的操作方案，可用于递送CRISPR/Cas9构建体并产生稳定的生殖系突变⁴。除推动I. scapularis相关研究外，该方案还可进一步优化，用于其他蜱种的研究。

方案

Ixodes scapularis 成虫购自俄克拉荷马州立大学（Oklahoma State University, OSU）或在内华达大学雷诺分校（University of Nevada, Reno, UNR）（IACUC 方案编号 #21-001-1118）饲养。

1. 胚胎采集用雌性蜱虫的准备

注意：为了收集合适年龄的卵，必须同步产卵时间。尽管蜱虫产卵的诱导信号尚不明确，但在标准的昆虫饲养条件下（27 °C 温度和>90% 相对湿度（RH）），I. scapularis 雌虫通常在脱离宿主后约8天开始产卵。通过将吸饱血的雌虫储存在4 °C条件下，可延长该时间线。我们将吸血后的雌虫在4 °C下储存长达8周，对产卵未产生任何不利影响。这些条件可能需要根据每个昆虫饲养室的具体情况进行调整。

1. 将所有成熟的雌性个体在 4 °C 下保存 >在衬有湿润滤纸的6夸脱塑料盒中，于90%相对湿度条件下保存，直至用于显微注射。
2. 注射前一周，将雌虫从 4 °C 转移至 27 °C 培养箱，以启动产卵。
3. 当雌虫开始产卵（移至 27 °C 后 3–4 天），使用细头画笔清除所有卵，并准备对雌虫进行吉内氏器官（蜡腺）切除。
   注意：Gene 器官从盾板与头胸部之间（口器背基部）延伸而出，口器弯曲至腹面体表（与体表平行），且在卵产出后立即由伸展的 Gene 器官包裹卵图1在移除基因器官或排空蜡质之前所产的卵具有蜡质涂层，不适合用于注射，必须丢弃。
4. 为了移除或清空姬蛛的器官，使用黏土将吸饱血的雌性固定在载玻片上，并将其置于显微镜下，调整方向以便操作 口器在腹面和背面均可见（图1B，C).
   1. 使用实验室中按照先前发表的方案用钨丝制备的精细镊子和钨针，小心地刺入盾片与口器正中间的区域¹⁶ （针头也可从商业渠道购买，并连接至显微解剖探针，参见 材料表).
   2. 用钨针从内部操作，将蜡腺拉出（图1D，E）。移除腺体可能需要几分钟时间。使用实验室擦拭纸擦去任何液态蜡样分泌物。
      注意：腺体也可从口器下方腹侧移除；操作时可用针和镊子从后方伸向盾板。在口器周围涂抹硅胶也可阻止盖恩氏器官外翻，可作为移除或清空蜡质的替代方法（法国国家农业、食品与环境研究院Ladislav Simo博士个人交流）。饱血蜱虫无法粘附于双面胶带。可使用黏土固定 "襁褓包裹" 蜱虫有助于在操作过程中固定它们。使用镊子夹住蜱虫，并用钨针进行解剖。腹面更容易用针刺穿，是作者推荐的部位。
5. 为排空腺体，按步骤1.4所述固定饱血蜱虫。小心刺破口器后方背侧区域，并用镊子挤压腹侧以施加压力。
   注意：或者，可以 无需切除蜡腺；清空蜡腺内的蜡可维持数天。产卵雌虫口器周围具有白色区域，指示蜡腺的位置，可作为定位参考。
   1. 用无尘实验室擦拭纸的边缘擦去穿刺部位渗出的液态蜡。注意避免与透明的血淋巴分泌物混淆，血淋巴为透明液体，而蜡为淡黄色且呈黏稠状。可能需要5-10分钟才能基本去除大部分蜡质。
6. 操作后，将雌性个体置于27 °C的培养箱中（>90% RH）中，使其恢复1-2天。
   注意：处理后的雌性个体通常需要1-2天恢复，之后重新开始产卵。
7. 当雌虫开始再次产卵时，使用细毛刷收集新产的卵（产卵后0–18小时），并将其放入1.5 mL微量离心管中。
   ​注意：如果使用同一雌性个体在产卵4-5天后所产的卵，且此前未切除腺体，则必须重复此操作。

2. 胚胎显微注射处理

1. 在含有0-18小时龄卵的离心管中加入约200 µL（或足以覆盖卵的体积，具体取决于卵的数量）5%（质量/体积）苯扎氯铵/水溶液（参见材料表）。用画笔轻轻搅动卵5分钟，以防止卵沉入管底（详细步骤见Sharma等⁴）。使用微量移液器吸除上清液，将卵留在管中。
   注意：苯扎氯铵对皮肤和眼睛具有腐蚀性，操作时应佩戴手套和护目用具。
2. 向含有卵的离心管中加入约200 µL去离子水（DI水），用画笔轻轻搅动，然后用微量移液器从微量离心管中吸除水。再用去离子水重复洗涤一次。
3. 用去离子水洗涤后，在管中加入约200 µL 5%（w/v）氯化钠（NaCl）溶液，并用画笔轻轻搅动5分钟。5分钟后吸除溶液，并用去离子水将卵洗涤两次。
4. 在含有卵的微量离心管中加入约100 µL 1%（w/v）NaCl溶液。将卵保存在1%（w/v）NaCl溶液中，直至用于显微注射。
5. 约一小时后开始显微注射。此时间安排有助于卵充分脱水，防止其破裂。
   ​注：卵可在1%（w/v）NaCl溶液中保存7-8小时，而不会显著影响 存活率。若卵难以注射或发生破裂，则表明脱水不足，可进一步用5%（w/v）NaCl溶液处理5分钟。

3. 注射针的制备

1. 按照制造商的说明，将含钨丝的铝硅酸盐毛细玻璃管（参见材料表）插入拉针仪中。
2. 将拉针仪调整至以下参数：加热温度：575，拉力：20，速度：50，时间：200，气压：700。
3. 启动拉针仪的拉针功能，并对其他针重复此操作。
4. 将拉制好的针插入洁净培养皿中的模型黏土条内进行存放。
5. 使用微量上样吸头（参见材料表）将注射混合液加载至针中。
   ​注：用于蜱和蚊胚胎注射的针具比较见图2。

4. 显微注射载玻片的准备

1. 使用双面胶带将两张玻璃载玻片粘合在一起，留出约 0.5 cm 的间隙，以支撑胚胎的排列，并防止其在注射过程中滚动（图 3A）。
2. 在载玻片间隙的双面胶带上贴上一块透明薄膜敷料（见材料表），确保薄膜敷料与间隙完全对齐。

5. 胚胎显微注射

1. 使用单毛画笔，每次将 8-10 枚卵按上述载玻片装置排列。
   注意：将卵的长轴垂直于载玻片边缘排列（图 3B）比将其纵轴平行于边缘排列（图 3C）更易于注射。处于垂直方向的卵（图 3B）更能耐受注射操作，从而提高存活率。
2. 将排列好卵的载玻片置于复式显微镜载物台上。用无绒擦拭纸轻轻擦去保存卵所用的 1% NaCl 溶液。
3. 将装有试剂的注射针连接至与显微操作仪相连的微注射仪（参见材料表）。
4. 在微注射仪上设置较高压力（>5,000 hPa），轻轻摩擦针尖与卵表面，以打开针尖。
5. 针尖打开后，根据针尖开口大小调整微注射仪的压力至 1,000–2,500 hPa。
   注意：较小的开口需要相对较高的压力，而较大的开口则需要较低的压力，以控制注入构建体的体积。根据针尖开口大小，每次注射体积可在 1–5 pL 之间变化。
6. 尽快以 10°–15° 角度完成载玻片上所有卵的注射，并立即将载玻片转移至铺有湿润滤纸的培养皿中，保持高湿度环境。卵一旦被注射即开始脱水。
   ​注意：每次注射少量卵可提高注射成功率和存活概率。注射针可能因胚胎内容物回流而堵塞。若针尖仍锋利，可通过将针尖移入载玻片边缘处的一小滴 1% NaCl 溶液中来清除堵塞，毛细作用可帮助移除微小堵塞物。若针尖已变钝，则应更换新针。

6. 胚胎注射后的护理

1. 将含有已注射胚胎的载玻片放入一个铺有湿润滤纸的大培养皿中。
   注意：至少在5-6小时内不得扰动卵，以确保注射伤口能够充分闭合。若受到扰动，注射伤口可能重新打开，细胞质会开始渗出，导致卵死亡。
2. 5-6小时后，在附有已注射胚胎的透明敷料膜上滴加少量去离子水。使用画笔轻轻移动卵，将卵转移至一个小培养皿（10 cm）中，并完全浸没于去离子水中。
   注意：敷料膜可方便注射后卵的转移。一旦在膜上加入水滴，卵将随水流动而开始移动。
3. 保持卵完全浸没在水中，并将培养皿放入一个6夸脱的塑料盒内，置于27 °C、>90%相对湿度的培养箱中培养。
4. 定期检查卵，最初几天每日观察，之后每3-4天检查一次，直至幼虫开始孵化。
   注意：若显微注射过程中大量卵受损，可在一周后轻轻吸去去离子水，以防止死卵上滋生真菌。
5. 当幼虫从已注射的胚胎中开始孵化时（本实验条件下约为注射后21-25天），应每日检查，并将已孵化的幼虫转移至带筛网盖的玻璃小瓶中。幼虫可在水下孵化并存活约1-2周。
6. 若卵注射了可能导致可见表型的构建体，应对幼虫进行筛选⁴。

结果

本文介绍了一种成功的I. scapularis胚胎显微注射方案。产卵雌蜱被置于高湿度环境中，以防止部分蜡化的卵发生脱水。通过消融怀卵雌蜱的Gene器官（蜡腺），去除卵表面的蜡层，从而实现对蜱胚胎的显微注射（图1A-E）。我们使用了颈部较短的铝硅酸盐玻璃毛细针（图2），这种针型在注射蜱卵时优于用于昆虫卵注射的长颈（锥形）针，能更好地耐受注射压力。由于蜱卵呈球形，需在载玻片下方设置平台（图3A），以防止在插入针头时卵滚动滑落。目前尚不清楚I. scapularis的早期胚胎发育过程，因此其生殖细胞形成的时间和位置也未知。为此，我们选择在胚胎发育早期（12–18小时龄）进行注射，并发现将卵的长轴垂直于载玻片边缘摆放时，卵的存活率更高（图3B、C）。采用本方案，已对数千枚卵...

讨论

这是首个成功注射早期蜱类胚胎的实验方案。已实现约4%-8%的存活率，与其他成熟的昆虫模式生物的胚胎注射存活率相当⁵。

由于这是首个实验方案，预计该方案将针对不同蜱虫物种进一步优化和特化。特别是注射时机将因物种而异，取决于胚胎发育过程，尤其是细胞化发生的时间。初步数据显示，I. scapularis 虫卵在产卵后的最初24小时内不会经历快速的核分裂，细胞化发生在数天之后（未发表数据）。我们已利用本方案成功实现了质粒递送⁴、CRISPR介导的基因敲除⁴以及细菌（Wolbachia）的递送（表1）。预计该胚胎注射方案将为创建转基因蜱虫提供可能，并使任何实验室都能开展基因敲除和敲入研究。这将有助于加快对蜱虫生物学及蜱虫-病原体-宿主相互作用的研究进程。

实验方案中的关键步骤
必须在产卵后24小时内...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带细丝的硅酸铝毛细管	Sutter instruments	AF100-64-10	胚胎注射
水中50%苯扎氯铵，25 g	TCI-America	B0414	胚胎处理，25 g约等于25 mL
滤纸	Whatman	1001-090	注射后护理
镊子	Thomas Scientific	300-101	基因器官操作
实验室擦拭纸	Genesee Scientific	88-115
微量加样头	Eppendorf	930001007	用于装填拉制好的针头
显微操作仪	Sutter instruments	ROE-200	胚胎注射
载玻片-普通，磨边	Genesee Scientific	29-100	胚胎排列，推荐使用磨边载玻片，斜边可能遮挡卵的视野
氯化钠（NaCl）	Research Products International	S23020-500.0	胚胎处理
针头拉制仪	Sutter Instruments	P-1000
永久双面胶带	Scotch	34-8716-3417-5	胚胎排列
培养皿	Genesee Scientific	32-107G	注射后护理
Tegaderm/透明薄膜敷料	3M Healthcare	1628	胚胎排列
钨针	Fine Science Tools	10130-10	基因器官操作
钨丝	Amazon	B08DNT7ZK3	基因器官操作
XenoWorks 数字显微注射仪	Sutter instruments	MPC-200	胚胎注射