用于研究基因敲除小鼠心脏修复与重构的心肌梗死实验模型

摘要

本文介绍了一种心肌梗死的实验模型、用于研究心脏重构和功能的超声心动图检测方法，以及对苦味酸天狼星红染色和罗丹明染色切片中纤维化和心肌肥厚进行定量分析的操作步骤，同时还包括对Masson三色染色切片中梗死面积和扩张指数的定量方法。

摘要

心血管疾病是西方国家最主要的死亡原因，其中急性心肌梗死（MI）是最常见的类型。本文介绍了一种在MI实验动物模型中研究半乳糖凝集素3（Gal-3）在心脏愈合和重塑时间演变过程中作用的实验方案。

所述操作包括建立雄性C57BL/6J（对照组）和Gal-3基因敲除（KO）小鼠的永久性冠状动脉结扎心肌梗死（MI）实验模型，采用超声心动图在活体（in vivo）条件下评估心脏重构和收缩功能，通过苦味酸天狼星红染色和罗丹明标记的凝集素染色切片进行组织学分析，以测定心肌细胞横截面积（MCSA）评估心肌细胞肥大，以及利用Masson三色染色和氯化三苯基四氮唑染色切片进行平面测量，定量分析梗死面积及心脏重构指标（包括瘢痕变薄、室间隔厚度和扩张指数）。MI模型的Gal-3基因敲除小鼠表现出心脏重构紊乱，并伴有瘢痕变薄率和扩张指数升高。在MI发生初期，心肌功能和心脏重构即受到严重影响。MI术后4周，Gal-3基因敲除小鼠梗死区域纤维化的自然演变过程也受到干扰。

综上所述，心肌梗死（MI）的实验模型是研究伴半乳糖凝集素-3（Gal-3）基因敲除及其他动物模型小鼠心脏修复与重塑时相演变的合适模型。Gal-3 的缺失会影响心脏修复的动力学过程，并干扰心肌梗死后心脏重塑及其功能的演变。

引言

心肌梗死（MI）是最常见的心血管疾病类型。MI 发生后，心肌会经历一系列形态和功能上的变化，包括 MI 梗死区域的愈合、心室重构（VR）以及心肌功能障碍¹。MI 的愈合是一个动态且高度协调的过程，伴随着显著的炎症细胞浸润，最终形成纤维化瘢痕^2,3。目前，小鼠 MI 实验模型被广泛用于研究病理条件下的心脏重构^4,5, 而掌握精确的手术操作流程对于建立可重复且有效的永久性冠状动脉结扎方法至关重要。该方法对于研究 MI 愈合过程及其在左心室重构（LVR）和 MI 相关心功能障碍的时间演变中的作用具有重要意义。

半乳糖凝集素是一类能够识别细胞内配体、膜受体以及细胞外糖蛋白中特定碳水化合物的凝集素。半乳糖凝集素3（Gal-3）是该家族的一个成员，通过识别并交联细胞表面糖缀合物上的N-和O-聚糖发挥作用，并在免疫系统中广泛表达⁶。既往研究已探讨了Gal-3在心血管疾病炎症和纤维化调控中的作用^7,8,

方案

注意：本实验方案中描述的所有实验均经布宜诺斯艾利斯大学动物护理与研究委员会（CICUAL）批准，符合美国国家研究委员会（US）实验动物饲养与使用指南更新委员会的规定。¹³. 实验中使用雄性、年龄相匹配的 C57BL/6J 和 Gal-3 8–10 周龄、体重 30–35 g 的基因敲除小鼠，便于手术操作。允许动物自由获取水和食物 随意摄取。该 Gal-3 KO小鼠与对照C57BL/6J小鼠在同一生物资源中心的C57BL/6J遗传背景下培育。

1. 手术区域和器械

1. 手术开始前，确认呼吸机已连接电源并正常工作。检查麻醉药液是否充足，并根据当日拟使用的动物数量，在手术当天配制所需药液。
2. 确认所有手术器械均已灭菌，包括不锈钢剪刀、显微剪刀、大号与小号缝合针持针器、牵开器、超锐利弯头镊子、有齿镊子及组织镊子。使用70%乙醇清洁操作区域。
3. 准备充足的棉球、棉签和纱布，以便及时处理可能出现的出血情况。
4. 备好已预处理的10-0至7-0硅涂层编织丝线用于左冠状动脉前降支（LDA）结扎，尼龙缝线用于胸腔闭合，亚麻线用于皮肤缝合。

2. 麻醉与插管

1. 称量小....

结果

心肌梗死后生存率与尸检
在为期4周的随访期间，C57小鼠的死亡率为17%（4/23），而Gal-3基因敲除（KO）小鼠的死亡率为40%（8/20）。对死亡小鼠进行了尸检；结果显示，死亡的Gal-3 KO小鼠心脏体积大于C57小鼠（图1），且38%的C57小鼠与32%的Gal-3 KO小鼠存在肉眼可见的胸腔血栓，这些血栓直接与心脏破裂相关。后者表明，死亡原因与心脏破裂无关。在实验方案结束并完成尸检后，可通过肉眼直接观察心脏的坏死区域来识别心脏重构情况。图1展示了两组实验小鼠心脏的代表性图像，其中可见心脏大小增加、梗死范围扩大以及瘢痕区域动脉瘤的形成，这些改变在Gal-3 KO小鼠心肌梗死后的 hearts 中尤为显著。

心脏重塑与功能 体内
评估心脏重塑与功能的首个方法.......

讨论

通过永久性冠状动脉结扎建立心肌梗死（MI）的实验模型，被广泛用于研究心脏修复和重构的多种病理生理机制^5,14,17。本文总结了本实验室目前用于研究心脏修复的时间演变过程及其对心肌梗死后心室重构影响的多种方法^14,17。迄今为止，已有两种缺血性心肌病模型被广泛研究：一种是永久性冠状动脉结扎，可导致风险区域几乎完全坏死；另一种是短暂缺血后恢复血流（"缺血/再灌注"），该模型结合了缺血性坏死与再灌注损伤。尽管后者更接近接受再灌注治疗的临床患者，具有更高的转化价值，但该模型在将动物实验结果向患者转化方面尚未取得成功¹⁹。

该方法的另一个局限性在于，在人类中，心肌梗死（MI）常伴随代谢失调和动脉粥样硬化，这与啮齿类动物存在差异，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8-0 丝线缝合线	Ethicon
C57BL/6J 小鼠	阿根廷布宜诺斯艾利斯大学兽医学院生物资源系
镊子
Hardvard 386 呼吸机	Hardvard 公司
加热垫			手术期间维持动物体温
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		图像分析软件
氯胺酮	Holiday
马松三色染色液	BIOPUR
苦味酸天狼星红染色液	BIOPUR
牵开器
啮齿类动物呼吸机 Model 683	Harvard Apparatus		机械通气机
剪刀
立体放大镜	Arcano
Vivid 7 机器（通用电气医疗系统，挪威霍滕）	通用电气		本方案可使用任何追踪软件
麦芽凝集素（WGA no. RL-1022，Vector Laboratories，伯林盖姆）	Vector Laboratories
赛拉嗪	Pro-Ser