用于研究基因敲除小鼠心脏修复与重构的心肌梗死实验模型

摘要

本文介绍了一种心肌梗死的实验模型、用于研究心脏重构和功能的超声心动图检测方法，以及对苦味酸天狼星红染色和罗丹明染色切片中纤维化和心肌肥厚进行定量分析的操作步骤，同时还包括对Masson三色染色切片中梗死面积和扩张指数的定量方法。

摘要

心血管疾病是西方国家最主要的死亡原因，其中急性心肌梗死（MI）是最常见的类型。本文介绍了一种在MI实验动物模型中研究半乳糖凝集素3（Gal-3）在心脏愈合和重塑时间演变过程中作用的实验方案。

所述操作包括建立雄性C57BL/6J（对照组）和Gal-3基因敲除（KO）小鼠的永久性冠状动脉结扎心肌梗死（MI）实验模型，采用超声心动图在活体（in vivo）条件下评估心脏重构和收缩功能，通过苦味酸天狼星红染色和罗丹明标记的凝集素染色切片进行组织学分析，以测定心肌细胞横截面积（MCSA）评估心肌细胞肥大，以及利用Masson三色染色和氯化三苯基四氮唑染色切片进行平面测量，定量分析梗死面积及心脏重构指标（包括瘢痕变薄、室间隔厚度和扩张指数）。MI模型的Gal-3基因敲除小鼠表现出心脏重构紊乱，并伴有瘢痕变薄率和扩张指数升高。在MI发生初期，心肌功能和心脏重构即受到严重影响。MI术后4周，Gal-3基因敲除小鼠梗死区域纤维化的自然演变过程也受到干扰。

综上所述，心肌梗死（MI）的实验模型是研究伴半乳糖凝集素-3（Gal-3）基因敲除及其他动物模型小鼠心脏修复与重塑时相演变的合适模型。Gal-3 的缺失会影响心脏修复的动力学过程，并干扰心肌梗死后心脏重塑及其功能的演变。

引言

心肌梗死（MI）是最常见的心血管疾病类型。MI 发生后，心肌会经历一系列形态和功能上的变化，包括 MI 梗死区域的愈合、心室重构（VR）以及心肌功能障碍¹。MI 的愈合是一个动态且高度协调的过程，伴随着显著的炎症细胞浸润，最终形成纤维化瘢痕^2,3。目前，小鼠 MI 实验模型被广泛用于研究病理条件下的心脏重构^4,5, 而掌握精确的手术操作流程对于建立可重复且有效的永久性冠状动脉结扎方法至关重要。该方法对于研究 MI 愈合过程及其在左心室重构（LVR）和 MI 相关心功能障碍的时间演变中的作用具有重要意义。

半乳糖凝集素是一类能够识别细胞内配体、膜受体以及细胞外糖蛋白中特定碳水化合物的凝集素。半乳糖凝集素3（Gal-3）是该家族的一个成员，通过识别并交联细胞表面糖缀合物上的N-和O-聚糖发挥作用，并在免疫系统中广泛表达⁶。既往研究已探讨了Gal-3在心血管疾病炎症和纤维化调控中的作用^{7,8,9,10,11,12}。由于在心肌梗死（MI）修复过程中，炎症调控因子是关键靶点，因为炎症可显著影响心室重构的进程，因此本研究旨在描述一种用于研究MI后心室重构时间演变过程的实验方案，并阐明Gal-3基因突变如何改变MI后修复过程的时间演变，以及其对小鼠心脏重构和功能的影响的步骤与方法。

方案

注意：本实验方案中描述的所有实验均经布宜诺斯艾利斯大学动物护理与研究委员会（CICUAL）批准，符合美国国家研究委员会（US）实验动物饲养与使用指南更新委员会的规定。¹³. 实验中使用雄性、年龄相匹配的 C57BL/6J 和 Gal-3 8–10 周龄、体重 30–35 g 的基因敲除小鼠，便于手术操作。允许动物自由获取水和食物 随意摄取。该 Gal-3 KO小鼠与对照C57BL/6J小鼠在同一生物资源中心的C57BL/6J遗传背景下培育。

1. 手术区域和器械

1. 手术开始前，确认呼吸机已连接电源并正常工作。检查麻醉药液是否充足，并根据当日拟使用的动物数量，在手术当天配制所需药液。
2. 确认所有手术器械均已灭菌，包括不锈钢剪刀、显微剪刀、大号与小号缝合针持针器、牵开器、超锐利弯头镊子、有齿镊子及组织镊子。使用70%乙醇清洁操作区域。
3. 准备充足的棉球、棉签和纱布，以便及时处理可能出现的出血情况。
4. 备好已预处理的10-0至7-0硅涂层编织丝线用于左冠状动脉前降支（LDA）结扎，尼龙缝线用于胸腔闭合，亚麻线用于皮肤缝合。

2. 麻醉与插管

1. 称量小鼠以确定麻醉剂剂量。
2. 将周围带有聚苯乙烯泡沫底座的加热垫预热至 40 °C。
3. 通过肌肉注射给予小鼠麻醉，剂量为每 10 g 体重 0.1 mL，注射液包含氯胺酮（65 mg/kg）、赛拉嗪（13 mg/kg）和乙酰丙嗪（1.5 mg/kg）。
4. 小鼠麻醉后、手术开始前，通过施加轻微疼痛刺激（如用手指按压足部）检查麻醉深度。若动物对刺激有反应，需调整麻醉深度。
5. 将小鼠置于仰卧位，将其四肢用胶带固定在加热垫上方的操作台面上，并置于双目立体显微镜下。用一根线牵拉上颌牙齿并固定于操作台，使颈部过度伸展。
6. 随后进行插管操作：通过颈部微小切口暴露气管环，并将连接于啮齿类动物呼吸机（潮气量：250 mL/次）的 20 G 静脉导管插入气管，呼吸频率设定为 34–38 次/分钟，具体操作如前所述¹⁴。
7. 将动物置于侧卧位，在第四或第五肋间行左侧肋间切开术。切开动物皮肤，观察其下方肌肉，小心分离肌肉与胸壁，以清晰暴露肋间间隙。此时应确保动物已正确连接呼吸机；然后使用超锐利镊子在肋间间隙处打孔进入。
   注意：左前降支（LDA）应可在上述肋间间隙沿左心室（LV）游离壁辨认。
8. 行心包切除术，通过对比冠状动脉与冠状静脉以及左耳下方的 LDA 分支来识别左前降支（LDA）。随后使用 8-0 蚕丝线在距耳缘约 2 mm 处结扎 LDA。最后逐层关闭胸腔，使用 6-0 蚕丝线缝合肋骨，确保胸腔内无气胸（可通过呼吸机促使肺扩张以仔细确认），然后对合或缝合肌肉层，最后缝合皮肤。
9. 皮肤缝合完毕后，将小鼠置于俯卧位，缓慢脱离呼吸机，并在其呼吸频率恢复后拔除气管插管。让动物在安静环境中恢复麻醉，最好保持室温稳定在 27 °C。
10. 等待动物从麻醉中恢复，四肢开始活动，且呼吸频率恢复正常。随后将其单独饲养至实验方案结束。
11. 对对照组或假手术组动物执行相同操作，但不进行 LDA 结扎。

3. 研究设计

1. 为研究心肌梗死（MI）后愈合过程及心室重构的时间演变，将小鼠随机分为以下组别：
   1. 为研究心肌梗死后1周时心室重构的早期阶段，将小鼠分配至以下组别：1）C57 假手术组（1周）；2）Gal-3 基因敲除假手术组（1周）；3）C57 心肌梗死组（1周）；4）Gal-3 基因敲除心肌梗死组（1周）。
   2. 为研究心肌梗死后4周时心室重构的晚期阶段，将小鼠分配至以下组别：5）C57 假手术组（4周）；6）Gal-3 基因敲除假手术组（4周）；7）C57 心肌梗死组（4周）；8）Gal-3 基因敲除心肌梗死组（4周）。

4. 超声心动图

注意：进行小鼠超声心动图检查时，必须使用频率超过 10 MHz 的线性换能器，以准确观察心壁直径和心腔大小。该操作可在腹腔注射（IP）阿佛丁（1.15 mL/kg）麻醉下进行，也可在清醒动物中实施。然而，由于操作引起的应激和焦虑，清醒状态下对心肌梗死（MI）小鼠可能导致结果混淆。

1. 为麻醉小鼠，将其拿起，使其背部朝向手掌，并翻转至腹部朝上。在此位置下，以45°角在动物与皮下注射针之间进行腹腔注射麻醉。
2. 小鼠麻醉后，剃除其胸部毛发，并将其置于预热的加热垫上，保持仰卧位。为获取胸骨旁长轴和短轴切面，将探头旋转90°。获得正确轴向图像后，将光标置于乳头肌水平，按下 2-D M-mode 键采集图像，并使用图像分析软件测量以下参数：
   1. 测量左心室（LV）尺寸，包括室壁厚度（LVWT）、收缩期（S）和舒张期（D）的左心室面积，以及至少三个心动周期的左心室舒张期面积（LVDA）和左心室收缩期面积（LVSA）。
   2. 此外，根据先前描述的方法¹⁵，通过射血分数（EF, %）、缩短分数（SF, %）和心肌质量（假设采用未校正的立方公式）分别使用公式（1）、公式（2）和公式（3）计算心室功能：
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100   (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100   (2)
      LV mass = 1.055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³)   (3)
      其中，LVEDD为左心室舒张末期内径，LVESD为左心室收缩末期内径，IVST为室间隔厚度，PWT为左心室后壁厚度。

5. 组织学评估

1. 尸检时，通过从侧面打开胸腔并切断所有周围结构，将动物的心脏取出。用滤纸轻轻按压心腔内部，清除其中的血凝块。
2. 将心脏取出后，使用实验室精密天平称重。将其浸入10%甲醛溶液中，在室温下固定至少72小时。使用刀片手动将心脏从心尖至心底切成厚度为1 mm的横断面切片，并将切片进行石蜡包埋处理。使用切片机对石蜡包埋组织进行连续切片，厚度为5 µm。
3. 将每张切片置于载玻片之间，采用苏木精-伊红（H&E）、Masson三色染色、罗丹明标记的凝集素染色切片或天狼星红染色进行染色^15,16。
   1. 使用合适的光学显微镜，以400倍放大倍数拍摄用于形态计量学、纤维化及心肌细胞横截面积（MCSA）定量分析的数字化图像。确认显微镜连接有数字相机，并与装有图像分析软件的计算机相连。每次形态计量分析时，确保所采集图像位于相同区域，每张切片（室间隔、梗死区和远端区）至少采集10个非重叠的高倍视野（400×）。
      1. 测量MCSA时，注意心肌细胞的位置，仅计数那些呈横断面切割且周围至少有三个邻近毛细血管的心肌细胞。
      2. 在天狼星红染色切片中，识别瘢痕区和室间隔区域，并对这两个区域的间质胶原进行成像。将图像上传至分析软件，打开阈值选项卡以高亮显示所有胶原阳性与阴性区域。为获取数据，点击测量选项卡并保存结果。计算各区域胶原百分比时，使用公式（4），将胶原阳性区域相加后除以总组织面积（包括胶原阳性区域），具体方法见其他文献^15,16。
         ​胶原（%）= 天狼星红染色面积 / 总组织面积   (4)
      3. 根据石蜡包埋样本中罗丹明标记凝集素染色切片所获得的数字化图像，对MCSA进行定量分析。为获得准确图像，使用图像分析软件沿心肌细胞膜周围的红色轮廓进行描记。选择面积选项卡，描记轮廓后点击测量功能键。最后，保存来自细胞面积的分析结果¹⁶。

6. 梗死面积的定量测定及平面测量法评估心脏重构

1. 使用光学显微镜（4倍）拍摄的Masson三色染色切片的组织学图像，结合相应的软件，通过平面测量法测定心肌梗死面积、心室壁厚度以及心内膜和心外膜周长的长度。
   1. 在定量分析梗死面积时，识别梗死区域（蓝色）和远端区域（红色）。分别描记并测量心内膜侧和心外膜侧梗死区与远端区的总长度，将心内膜和心外膜描记长度的平均值计算为左心室总周长的百分比¹⁷。
   2. 类似地，在心脏中段切面测量瘢痕厚度（取五个等间距点的平均值）和室间隔厚度（取三个等间距点的平均值），并利用这些测量值计算瘢痕厚度比（公式[5]）和扩张指数（公式[6]¹⁸）。
      注意：所有数值均可记录于电子表格中。
      瘢痕厚度比 = 瘢痕厚度 / 室间隔厚度   (5)
      扩张指数 = (左心室腔面积 / 左心室总面积) × (室间隔厚度 / 瘢痕厚度)   (6)
      注意：由于心室重构可能改变扩张程度，从而导致对梗死面积的低估或高估，因此可能需要先进行预实验，在术后24小时测量梗死面积后实施安乐死。在此情况下，使用与心肌梗死手术相同的腹腔注射麻醉液对动物进行麻醉。
2. 将动物置于仰卧位，并按照前述方法进行气管插管。待动物麻醉后，从剑突至腋窝处做一深斜切口，切透皮肤、肌肉及肋骨。
3. 分离主动脉弓，在升主动脉上打一小孔，插入导管以灌注伊文思蓝染料。随后手动取出染色后的心脏，用锋利刀片从心尖至心底方向进行切割。将心脏切片置于1%氯化三苯基四氮唑（TTC）的等渗磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，在37 °C下孵育30分钟⁴，以确认各动物间梗死面积具有可比性。

结果

心肌梗死后生存率与尸检
在为期4周的随访期间，C57小鼠的死亡率为17%（4/23），而Gal-3基因敲除（KO）小鼠的死亡率为40%（8/20）。对死亡小鼠进行了尸检；结果显示，死亡的Gal-3 KO小鼠心脏体积大于C57小鼠（图1），且38%的C57小鼠与32%的Gal-3 KO小鼠存在肉眼可见的胸腔血栓，这些血栓直接与心脏破裂相关。后者表明，死亡原因与心脏破裂无关。在实验方案结束并完成尸检后，可通过肉眼直接观察心脏的坏死区域来识别心脏重构情况。图1展示了两组实验小鼠心脏的代表性图像，其中可见心脏大小增加、梗死范围扩大以及瘢痕区域动脉瘤的形成，这些改变在Gal-3 KO小鼠心肌梗死后的 hearts 中尤为显著。

心脏重塑与功能 体内
评估心脏重塑与功能的首个方法...

讨论

通过永久性冠状动脉结扎建立心肌梗死（MI）的实验模型，被广泛用于研究心脏修复和重构的多种病理生理机制^5,14,17。本文总结了本实验室目前用于研究心脏修复的时间演变过程及其对心肌梗死后心室重构影响的多种方法^14,17。迄今为止，已有两种缺血性心肌病模型被广泛研究：一种是永久性冠状动脉结扎，可导致风险区域几乎完全坏死；另一种是短暂缺血后恢复血流（"缺血/再灌注"），该模型结合了缺血性坏死与再灌注损伤。尽管后者更接近接受再灌注治疗的临床患者，具有更高的转化价值，但该模型在将动物实验结果向患者转化方面尚未取得成功¹⁹。

该方法的另一个局限性在于，在人类中，心肌梗死（MI）常伴随代谢失调和动脉粥样硬化，这与啮齿类动物存在差异，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8-0 丝线缝合线	Ethicon
C57BL/6J 小鼠	阿根廷布宜诺斯艾利斯大学兽医学院生物资源系
镊子
Hardvard 386 呼吸机	Hardvard 公司
加热垫			手术期间维持动物体温
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		图像分析软件
氯胺酮	Holiday
马松三色染色液	BIOPUR
苦味酸天狼星红染色液	BIOPUR
牵开器
啮齿类动物呼吸机 Model 683	Harvard Apparatus		机械通气机
剪刀
立体放大镜	Arcano
Vivid 7 机器（通用电气医疗系统，挪威霍滕）	通用电气		本方案可使用任何追踪软件
麦芽凝集素（WGA no. RL-1022，Vector Laboratories，伯林盖姆）	Vector Laboratories
赛拉嗪	Pro-Ser