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方法文章

分离带有荧光线粒体的条件性永生小鼠肾小球内皮细胞

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DOI：

10.3791/64147

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2022年9月13日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Nephrology, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

本文内容

摘要

本文描述了从表达热敏型猿猴病毒40和光激活线粒体PhAMexcised的转基因小鼠肾脏中分离条件性永生化肾小球内皮细胞的方法。我们介绍了使用微珠从完整肾脏中分离肾小球、消化步骤，以及CD31阳性肾小球内皮细胞（GECs）的接种和培养过程。

摘要

肾小球内皮细胞（GEC）功能障碍可启动并促进肾小球滤过屏障的破坏。已有研究提示，线粒体氧化应激增加是某些肾小球疾病发病过程中导致GEC功能障碍的机制之一。传统上，从体内模型中分离GEC一直极具挑战性，主要由于难以从肾小球中获得纯化的细胞培养物。GEC在体外具有复杂的生长需求，且寿命极短。本文描述了一种分离和培养条件性永生化、线粒体带荧光标记的GEC的方法，从而实现对线粒体分裂与融合事件的动态追踪。这些GEC来源于双转基因小鼠的肾脏，该小鼠同时表达热敏感型SV40 TAg（来自Immortomouse），可在特定条件下促进细胞增殖并抑制分化；同时在所有线粒体中表达一种光转换荧光蛋白（Dendra2）（来自光激活线粒体[PhAMexcised]小鼠）。所获得的稳定细胞系可在SV40 TAg基因失活后实现细胞分化，并通过对部分线粒体进行光激活，使其荧光由绿色转变为红色。利用mitoDendra2-GEC可实现对活细胞中荧光标记线粒体的分布、融合及分裂事件进行实时成像，无需对细胞进行染色。

引言

肾小球通过肾小球滤过屏障限制大分子的通过，在血液滤过中起关键作用1,2。肾小球包含四种细胞类型：壁层上皮细胞、足细胞（脏层上皮细胞）、肾小球内皮细胞（GEC）和系膜细胞3。肾小球内皮具有独特的血管结构，其特征是存在窗孔结构，以适应大量滤过的需求4。肾小球内皮的顶面覆盖着一层带负电荷的糖萼以及称为内皮表面层的包被结构，从而在内皮与血液之间形成一个间隙。该结构具有高度的电荷选择性，可限制带负电荷的分子（如白蛋白）通过，并防止白细胞和血小板黏附5。

GEC 对代谢变化非常敏感，例如糖尿病环境相关的高血糖。事实上，糖尿病会导致有害物质在体内循环增加、葡萄糖代谢通路饱和以及细胞氧化还原平衡紊乱3,6。此外，活性氧物质的增加会诱发线粒体功能障碍，进而影响内皮功能7。

本方案的总体目标是分离具有荧光标记线粒体特征的永生化肾小球内皮细胞。事实上，原代肾小球内皮细胞（GECs）的体外培养具有增殖周期短和早期衰老的局限性。8此外，荧光标记的线粒体有助于观察高血糖或其他任何处理条件下发生的分裂与融合事件。作为另一种方法，其他实验室采用h-TERT来实现细胞永生化。 体外9.

本文所述方法可用于从4至6周龄动物中分离条件性永生化的mitoDendra2肾小球内皮细胞（图1）。该详细方案描述了使用携带SV40大肿瘤抗原（SV40 TAg）基因的转基因小鼠（H-2Kb-tsA58）来生成具有热敏感特性的条件性永生化细胞10,11。H-2Kb基因的可诱导5'侧翼启动子在干扰素γ（IFNγ）作用下活性增强，从而在允许温度33 °C下使tsA58 TAg基因产物发挥功能，维持细胞的条件性增殖表型12。在非允许温度37 °C且无IFNγ存在时，H-2Kb产物迅速降解，导致tsA58Tag的永生化功能丧失，从而使细胞向更分化的表型发育13,14,15。将H-2Kb-tsA58转基因小鼠与PhAM小鼠（表达线粒体特异性Dendra2绿色荧光蛋白，靶向细胞色素c氧化酶亚基VIII）进行可选杂交，可实现活细胞中荧光标记线粒体的实时检测16。Dendra2绿色荧光在405 nm激光照射后可转换为红色荧光16。光转换后若线粒体发生融合，则因绿色与红色物质交换而呈现黄色的长条状结构；若发生分裂，则呈现红色碎片7,17。mitoDendra2-GECs是研究肾小球内皮细胞线粒体对不同刺激产生细胞反应的有力工具。

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方案

本文所述所有动物实验程序均经西奈山伊坎医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。实验使用三只雄性小鼠（H-2Kb-tsA58 转基因小鼠，携带光激活型线粒体 [PhAM]），购自杰克逊实验室，并以普通饲料饲养。

1. 工作条件与准备工作

  1. 使用70%乙醇和UV-C灯清洁超净工作台内的工作区域。
  2. 准备磁珠洗涤缓冲液。使用pH为7.4–8.0的0.1 M磷酸钠溶液配制缓冲液-1，使用不含钙和镁、添加0.1%牛血清白蛋白（BSA）和3 mM EDTA、pH为7.4的1×磷酸盐缓冲液（PBS）配制缓冲液-2，使用含0.1% BSA、pH为8.5的0.2 M Tris溶液配制缓冲液-3。

2. 磁性颗粒浓缩器

  1. 磁性珠的制备
    1. 在1.5 mL微量离心管中，轻轻混合200 µL磁性珠（4 × 108 个珠）与200 µL缓冲液-1。
      注意：每只小鼠在组织收获前1天需准备200 µL磁性珠。这些磁性珠将用于肾小球的收获。
    2. 将离心管置于磁性粒子浓缩器中1分钟，然后小心吸除上清液。将离心管从磁铁上取下，并将洗涤后的磁性珠重悬于200 µL缓冲液-1中。
    3. 将含有磁性珠的离心管再次置于磁性粒子浓缩器中1分钟，然后轻轻吸除上清液。
    4. 使用200 µL缓冲液-2洗涤磁性珠两次，每次5分钟，通过将离心管置于磁性粒子浓缩器中并弃去缓冲液，以灭活游离的甲苯磺酰基团。
    5. 将磁性珠在200 µL缓冲液-3中于4 °C孵育24小时，或于37 °C孵育4小时，以灭活剩余的游离甲苯磺酰基团。将离心管置于磁性浓缩器中1分钟，轻轻吸除上清液并弃去。
    6. 用200 µL缓冲液-2在4 °C洗涤磁性珠一次，持续5分钟。将离心管重新放入磁性浓缩器中1分钟，轻轻吸除上清液。将离心管从磁性浓缩器中取出，并将磁性珠重悬于200 µL缓冲液-2中，得到浓度为4 × 108 个珠/mL的悬液。
      ​注意：此步骤后，磁性珠可在4 °C保存最多15天。

3. 小鼠肾脏肾小球细胞的分离

  1. 准备灌注材料：30 mL 注射器、25 G 蝶形针。准备分离材料：无菌 10 cm 培养皿、手术刀、磁性粒子浓缩器、40 µm 细胞筛、100 µm 细胞筛。
  2. 配制 100 mL 含 1% 抗生素的 1× Hank's 平衡盐溶液（HBSS），调节 pH 至 7.35。使用 0.2 µm 滤器过滤溶液，并置于超净台中以避免污染。
  3. 将步骤 2.1.6 中的 200 µL 磁珠与 20 mL 1× HBSS 混合。
    注意：每只小鼠需要 200 µL 磁珠稀释于 20 mL 1× HBSS 中。
  4. 在 1× HBSS 溶液（pH 7.35）中配制 1 mg/mL 的 II 型胶原酶（125 CDU/mg）1 mL 分装液。将含 10% 胎牛血清（FCS）的 RPMI 培养基在 37 °C 水浴中预热。将内皮细胞培养基也在 37 °C 预热（详见材料表）。
    注意：RPMI 将用于中和胶原酶。
  5. 在 6 孔板中预包被两孔，每孔加入 1 mL 10 µg/mL IV 型胶原蛋白（共 2 mL），室温孵育 45 分钟。用 1× PBS 洗涤 3 次，以去除稀释胶原蛋白时使用的乙酸。立即使用包被好的培养板，或在 2–8 °C 保存最多 4 周。
    注意：建议用透明封膜密封培养板，以防干燥。胶原蛋白包被有助于细胞贴附于培养板表面。
  6. 使用 70% 乙醇清洁并消毒图 2中所有手术器械，随后进行 30 分钟高压灭菌处理。用 70% 乙醇清洁手术操作区域。
  7. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮 10 mg/mL，赛拉嗪 1 mg/mL）对小鼠实施麻醉。通过脚趾夹捏反射检测确认动物是否完全麻醉。
  8. 用 19 G 针头固定小鼠四肢，使其稳定于解剖平台。用 70% 乙醇清洁胸部和腹部，然后沿胸腹部剪开腹腔 a（图 2）。
  9. 将蝶形针插入左心室（图 3A），注入约 100 μL 步骤 1.2 中的磁珠溶液，以扩张血液循环系统。
  10. 用 19 G 针头小心刺破肾下方的下腔静脉（图 3A）。继续执行步骤 3.9 开始的灌注。
    注意：也可使用微型泵，设置流速为 18.0+，时间为 5 分钟。良好的灌注对于收获大量携带磁珠的肾小球至关重要。此为非存活性/终末性操作。 
  11. 用镊子轻轻去除脂肪组织，使用细手术剪 c（图 2）切除双侧肾脏，并将其置于含 1 mL 1× HBSS 的冰上培养皿中。先用剪刀 b（图 2）将肾脏剪碎，再用无菌手术刀切成约 1 mm 大小的组织块（如图 3B所示）。
  12. 随后将剪碎的肾脏组织与步骤 3.4 中的 1 mL II 型胶原酶在 37 °C 下孵育 35 分钟，同时使用水平摇床轻柔倾斜振荡。此步骤后组织应完全消化，如图 3C所示。
  13. 加入 4 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI（来自步骤 3.4）以中和胶原酶。将消化后的组织通过无菌 100 µm 细胞筛过滤至 50 mL 离心管中。使用无菌 1.5 mL 微量离心管底部在筛网上搅动消化组织，促使肾小球通过筛孔。
  14. 用 15 mL 1× HBSS 冲洗细胞筛，然后将滤过液在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。此时沉淀物分为三层：磁珠与肾小球位于试管中间层，上层为小管等较小结构，底层为碎片（图 3D）。
  15. 小心吸除上清液及上层白色物质。剩余沉淀物包含携带肾小球的磁珠及碎片（图 3D）。用 1.5 mL 1× HBSS 重悬沉淀物，并转移至 2 mL 离心管中。
  16. 将离心管置于磁性粒子浓缩器中（图 3E），吸除上清液，然后用 1 mL 1× HBSS 洗涤磁珠两次；在此阶段，取 20 µL 细胞悬液滴于载玻片上，显微镜下观察肾小球的存在情况（图 3F；悬液中可见肾小球［黑色箭头］和部分磁珠［黄色箭头］）。
  17. 小心吸除上清液，将沉淀物重悬于内皮细胞生长培养基中（材料表），转移至洁净的 2 mL 离心管。向管中加入 2 µL IFNγ（100 U/mL），并将细胞接种至 6 孔板的一个孔中。将细胞在 33 °C 下孵育。
  18. 培养 3 天后，小心用移液器吸出 1 mL 培养基，更换为 1 mL 新鲜培养基。此时细胞呈异质性，包含多种肾小球细胞（图 4G）。
    注意：在细胞生长过程中，会同时出现肾小球细胞和少量磁珠（图 4G）。注意所有细胞均应显示绿色荧光线粒体。
  19. 培养 7 天后，完全吸除培养基，更换为 2 mL 新鲜内皮细胞生长培养基，并补充 IFNγ（100 U/mL）。此时细胞开始增殖，但仍呈异质性（图 4A）。
  20. 培养 10 天后，当细胞融合度达到约 80% 时，使用胰酶按步骤 5.1 所述方法传代，并转移至经 IV 型胶原蛋白包被的 T25 培养瓶中。
  21. 再培养 1 周（总计约 21 天），将细胞传代至经 IV 型胶原蛋白包被的 T75 培养瓶中。

4. 内皮细胞分离用珠的制备

  1. 首先用大鼠抗小鼠 CD31 抗体包被羊抗大鼠磁珠3,18,19。每个 T75 培养瓶使用 10 µL 磁珠。
  2. 用含 0.1% BSA、2 mM EDTA 和 1% 青霉素/链霉素的 1× PBS 溶液将 10 µL 磁珠洗涤 3 次，每次 200 µL。每次洗涤时将离心管置于磁力架中，以便吸除洗涤液。
  3. 将磁珠重悬于 200 µL PBS、1% BSA、2 mM EDTA 和 1% 青霉素/链霉素溶液中，加入 4.8 µL 大鼠抗小鼠 CD31 抗体7,18,19，将离心管置于水平摇床上，在室温下轻柔混匀 1 小时，随后于 4 °C 过夜孵育。

5. 使用 CD31 包被的磁珠分离肾小球内皮细胞

  1. 向T75培养瓶中加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。用3 mL内皮细胞生长培养基中和胰蛋白酶，将细胞转移至15 mL离心管中，然后以200 × g离心5分钟。
  2. 吸除上清液，用含1% BSA、2 mM EDTA和1%青霉素/链霉素的1 mL PBS重悬细胞，再以200 × g离心5分钟。
  3. 将细胞沉淀重悬于步骤4中制备的200 µL包被磁珠中，加入含1% BSA、2 mM EDTA和1%青霉素/链霉素的800 µL PBS。在37 °C、5% CO2条件下持续振荡孵育细胞45分钟。
  4. 将离心管置于磁力浓缩器中，用含1% BSA、2 mM EDTA和1%青霉素/链霉素的1× PBS洗涤细胞4次。将细胞重悬于3 mL添加了100 U/mL IFNγ的内皮细胞生长培养基中。
  5. 将1.5 mL细胞接种至6孔板中预先包被胶原IV的孔内。在允许性条件下（33 °C）培养细胞。
    注：分离得到的细胞表达猿猴病毒40（SV40）大T抗原tsA58，可在33 °C（允许性条件）下激活持续增殖。
  6. 培养4天后，移除750 µL培养基，并替换为等体积添加100 U/mL IFNγ的新鲜培养基。
  7. 培养10至14天后，使用配备488 nm滤光片的落射荧光显微镜观察表达荧光标记线粒体的CD31阳性肾小球内皮细胞（GECs）克隆（图4C）。
  8. 培养21天后，细胞可能达到80%–90%融合度；此时可转移至T25培养瓶中。细胞达到完全融合后，可用RPMI生长培养基加10%胎牛血清（FCS）进行维持培养。
    注：在达到融合前，细胞形态可能呈异质性（图4B）；但一旦融合，细胞将呈现铺路石样形态。
  9. 在此阶段，细胞可进行冷冻保存。当细胞融合度达到80%时，向培养瓶中加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。用等体积添加10%胎牛血清（FBS）的生长培养基中和胰蛋白酶。
  10. 以200 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于3 mL冻存液（RPMI、20% FBS、10% DMSO）中。分装至冻存管，储存在液氮气相温度中。

6. 培养 mitoDendra2-GECs

  1. 将步骤5.10中冻存的细胞在37 °C水浴中解冻，并转移至含有10 mL预热内皮细胞生长培养基的15 mL离心管中。
  2. 在室温下以200 × g 离心5分钟，弃去培养基，将细胞沉淀转移至预先包被胶原蛋白IV的T25 cm2细胞培养瓶中，加入含100 U/mL IFNγ的预热内皮细胞生长培养基，于33 °C培养。
  3. 次日更换培养基。当细胞融合度达到70%–80%时（通常在5天后），将细胞转移至T75 cm2细胞培养瓶中。
  4. 为诱导细胞向内皮表型分化，将细胞转移至37 °C非许可性条件下，在不含IFNγ的生长培养基中培养。

7. mitoDendra2-GECs 的传代

  1. 吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞，加入 3 mL 温热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液（T75 cm2 培养瓶），于 37 °C 培养 5 分钟。
  2. 待细胞脱落时，加入 5 mL 完全培养基，轻轻吹打混匀。将细胞悬液在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，然后将细胞转移至新的经 IV 型胶原蛋白包被的培养瓶或培养板。
    ​注意：应每周传代一次，传代比例为 1:4。

8. mitoDendra2-GECs 的表征

  1. 对已分化的细胞进行CD31的免疫荧光染色7,18,19,20（图4D）。同时可使用其他标记物，如vWF和Isolectin-B420。
  2. 为确认Dendra2的线粒体特异性，将细胞在含有100 nM线粒体示踪染料的生长培养基中于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟，以标记线粒体特异性标记物。
  3. 移除培养基，并用预热的无酚红培养基轻轻洗涤细胞，进行活细胞成像。
    注意：也可选择使用4%甲醛固定剂固定细胞30分钟，随后用PBS多次洗涤。固定后的细胞可保存在4 °C的1× PBS中直至使用。也可通过流式细胞术进行验证：使用抗CD31、抗PECAM、抗CD45抗体标记细胞。GECs应不表达足细胞标记物（synaptopodin、Nphs1、Podxl）、系膜细胞标记物（PDGFRβ、血管紧张素原）以及小管细胞标记物（水通道蛋白、氨基肽酶-N）。这些标记物作为阴性对照。由于这些细胞中Dendra2特异性表达于线粒体，应避免使用FITC通道。

9. 氧化应激或高糖条件下线粒体结构动态变化的活细胞成像

  1. 使用内皮细胞生长培养基（材料表），将1 × 105个GECs接种于经IV型胶原包被的35 mm玻璃底培养皿中。24小时后，更换为无酚红培养基。细胞中的线粒体呈绿色荧光。
  2. 在实验开始前1小时，将环境培养箱设置为37 °C、5%湿度和5% CO2。
  3. 在共聚焦显微镜下，使用40倍/1.2水镜调整焦距并选择感兴趣区域。将细胞与2 mL 5 mM或25 mM葡萄糖共同孵育60分钟。
  4. 使用405 nm激光（4%激光功率）照射，使部分线粒体由绿色光转化为红色（图5A-B, D-E）。
  5. 使用561 nm激光激发未转化状态的Dendra2，以观察红色荧光。详细的光转换操作步骤见先前报道16。由于绿色基质与红色基质融合，数分钟后融合事件表现为黄色荧光（图4C, F）。

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结果

本文描述了一种分离条件性永生化且具有稳定荧光线粒体（mitoDendra2-GECs）的肾小球内皮细胞的详细方案（图1）。使用6至10周龄的年轻小鼠对于获得大量健康细胞至关重要。培养3天后，细胞开始从分离的肾小球中缓慢生长，如图3G所示。培养7天后，细胞呈异质性，包含其他类型的肾小球细胞，如足细胞、壁层上皮细胞和系膜细胞（图4A）。当细胞生长至70%至80%融合度时，通过CD31标记的磁性微珠对内皮细胞进行阳性筛选，以去除其他肾小球细胞（图4B-C）。mitoDendra2-GECs表达CD31（图4D），且对足细胞标志物呈阴性，表现为突触足蛋白染色阴性（图4E-F）。

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讨论

线粒体对细胞代谢、稳态和应激反应至关重要，其功能障碍与多种疾病相关，包括肾脏疾病。线粒体在过量活性氧（ROS）的病理性生成、细胞内钙水平的调控、细胞死亡通路以及细胞骨架动态变化中发挥重要作用21,22,23。

由于肾小球足细胞（GECs）数量少、体积小、受基质因子影响，且与其他肾小球细胞存在相互依赖关系，这些因素共同影响其存活，因此从小鼠中分离GECs具有较大挑战性。本文提供了一种详细的小鼠GEC分离方案。具体而言，我们利用转基因小鼠作为工具，获得具有高增殖潜能的条件性永生化细胞系。这些转基因小鼠表达猴病毒40（SV40）大T抗原tsA58，在允许性条件（33 °C）下可激活持续增殖能力；本研究将此类小鼠与表达线粒体特异性荧光蛋白的PHAMexcised小鼠进行杂交。双转基因小鼠为研究线粒体结构提供了优良工具。事实上，PHAMex...

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披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

作者感谢Cijiang He教授和Fu Jia博士在小鼠内皮细胞分离方面的指导，感谢Mone Zaidi教授提供了PhAMexcised小鼠以及富有价值的讨论。作者还感谢西奈山伊坎医学院显微成像核心设施（Microscopy CORE）及其工作人员提供的技术指导。本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）R01DK097253项目基金以及美国国防部CDMRP项目基金E01 W81XWH2010836对I.S.D.的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 µm 细胞滤筛Fisher22-363-549
1ml 胰岛素注射器BD329424
25G 蝴蝶针BD367298
3 mm 刃口剪刀F.S.T15000-00
30ml 注射器BD Biooscience309650
40 µm 细胞滤筛Fisher22-363-547
40 µm 尼龙网
Bonn 剪刀F.S.T14184-09
牛血清白蛋白FisherBP1600-100
CD31abcamab7388
I 型胶原酶Corning354236
II 型胶原酶SIGMAC6885125CDU/mg
IV 型胶原酶SIGMAC5533-5M
Dnase-IQiagen79254
Dynabeads 450Thermofisher Scientific14013
内皮细胞生长培养基Lonzacc-3156
超细 Graefe 镊子F.S.T11150-10
FBSGemini100-106热灭活
纤连蛋白Thermofisher33016015
细镊子F.S.T DumontE6511
HBSSGIBCO14065-056
IFNgCell ScienceCRI001B
ImmortomouseJackson laboratory32619Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ
L-谷氨酰胺 100xThermofisher Scientific25030081
磁性粒子浓缩器Thermofisher Scientific12320D
mitotrackerThermofisher ScientificM7512
PBS 1XCorning46-013-CM
青霉素-链霉素 100xThermofisher Scientific10378016
PhaM 小鼠Jackson laboratory18397B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J
蛋白酶（10 mg/ml）SIGMAP6911
RPMIGIBCO3945
丙酮酸钠 100 mMThermofisher Scientific11360070
标准型镊子 F.S.T11000-12
外科剪刀 - 锐-钝型F.S.T14008-14
synaptopodinSanta Cruzsc-515842
0.05% 胰蛋白酶Thermofisher Scientific25300054

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