用荧光线粒体分离条件永生化的小鼠肾小球内皮细胞

Summary

本文描述了从表达热不稳定猿病毒40和光激活线粒体^PhAM切除的转基因小鼠的肾脏中分离条件永生化肾小球内皮细胞的方法。我们描述了使用磁珠、消化步骤、播种和培养 GEC-CD31 阳性从整个肾脏中分离肾小球的程序。

Abstract

肾小球内皮细胞（GEC）功能障碍可引发并导致肾小球滤过屏障破坏。线粒体氧化应激增加被认为是导致某些肾小球疾病发病机制中GEC功能障碍的机制。从历史上看，由于难以从肾小球中分离纯培养物，因此从 体内 模型中分离GECs一直具有挑战性。GEC在 体外 具有复杂的生长要求，并且寿命非常有限。在这里，我们描述了用荧光线粒体分离和培养有条件永生化GEC的程序，从而能够跟踪线粒体裂变和融合事件。GECs从表达不稳定性的SV40 TAg（来自Immortomouse）的双转基因小鼠的肾脏中分离，有条件地促进增殖和抑制细胞分化，以及所有线粒体中的光转换荧光蛋白（Dendra2）（来自光激活线粒体[^PhAM切除]小鼠）。产生的稳定细胞系允许在永生化SV40 TAg基因失活和线粒体亚群的光活化后进行细胞分化，从而导致荧光从绿色切换到红色。使用mitoDendra2-GEC可以对荧光线粒体的分布，融合和裂变事件进行实时成像，而不会对细胞进行染色。

Introduction

肾小球通过限制大分子通过肾小球滤过屏障而对血液滤过至关重要^1，2。肾小球包含四种细胞类型:壁上皮细胞、足细胞（内脏上皮细胞）、肾小球内皮细胞 （GEC） 和系膜细胞³。肾小球内皮的特征在于独特的血管结构，根据大^{过滤量所需的}Fenestrae的存在4。肾小球内皮的顶端表面覆盖着带负电荷的糖萼层和称为内皮表层的涂层，该涂层在内皮和血液之间形成空间。这种结构提供了高电荷选择性，限制了带负电荷的分子（如白蛋白）的通过，并防止了白细胞和血小板粘附⁵。

GEC对代谢变化非常敏感，例如与糖尿病环境相关的高血糖症。事实上，糖尿病会导致有害物质循环增加，葡萄糖代谢途径饱和，并扰乱细胞氧化还原平衡^3，6。此外，活性氧的增加诱发线粒体功能障碍，从而影响内皮功能⁷。

当前方案的总体目标是分离具有荧光线粒体特征的永生化肾小球内皮细胞。事实上，原代GEC的细胞培养具有有限的增殖周期和早期衰老⁸。此外，荧光线粒体的存在有助于检查高血糖或任何其他治疗的裂变和融合事件。作为一种替代方法，其他实验室使用h-TERT在体外使细胞永生化⁹。

这里描述的方法允许从4-6周龄的动物中分离有条件永生化的mitoDendra2肾小球内皮细胞（图1）。该详细协议描述了使用携带猿病毒40大肿瘤抗原（SV40 TAg）基因^10，11的转基因小鼠（H-2K b-tsA58）来产生热不稳定的条件永生化细胞。tsA58 TAg基因产物在小鼠H-2K^b基因的诱导5'侧翼启动子的控制下在33°C的允许温度下起作用，该启动子在暴露于干扰素γ（IFNγ）时升高到基础水平以上，因此维持条件增殖表型¹²。在没有IFNγ的情况下，H-2K^b在37°C的非允许温度下迅速降解，消除了细胞中tsA58Tag的永生化功能，并允许细胞发展出更分化的表型¹³，^14，15。H-2Kb-tsA58转基因小鼠与PhAM小鼠的选择性杂交，PhAM小鼠表达线粒体特异性（细胞色素c氧化酶亚基VIII）Dendra2-green，允许活检测荧光线粒体¹⁶。Dendra2 绿色荧光在暴露于 405 nm 激光¹⁶ 后切换到红色荧光。当线粒体在光开关后融合时，它们形成细长的形状，由于绿色和黄色物质的交换而呈现黄色，或者在发生裂变时呈现红色7^，17。mitoDendra2-GEC是研究GEC线粒体对不同刺激的细胞反应的好工具。

Protocol

这里描述的所有动物程序都得到了西奈山伊坎医学院的IACUC的批准。我们使用从杰克逊实验室购买的三只雄性小鼠（H-2Kb-tsA58转基因小鼠，具有光激活线粒体[PhAM]），并保持正常的食物饮食。

1. 工作条件和准备

1. 使用 70% 乙醇和 UV-C 光清洁层流罩内的工作空间。
2. 准备珠子的洗涤缓冲液。使用 pH 7.4-8.0 的 0.1 M 磷酸钠制备缓冲液-1，使用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 制备缓冲液-2，不含钙和镁，并补充有 0.1% 牛血清抗原 （BSA）、3 mM EDTA、pH 7.4 和缓冲液-3，使用 0.2 M Tris 和 0.1% BSA，pH 8.5。

2. 磁粉浓缩器

1. 磁珠的制备
   1. 在 1.5 mL 微量离心管中，将 200 μL 磁珠（4 x 10⁸ 颗磁珠）与 200 μL 缓冲液-1 轻轻混合。
      注意:在组织收获前1天，每只小鼠准备200μL磁珠。珠子将用于收获肾小球。
   2. 将管放入磁粉浓缩器中1分钟，然后小心地吸出上清液。从磁体上取下试管，将洗涤过的珠子重悬于200 μL缓冲液-1中。
   3. 将含有磁珠的管放入磁粉浓缩器中1分钟，轻轻吸出上清液。
   4. 通过将试管放入磁粉浓缩器中并丢弃缓冲液，使用 200 μL 缓冲液-2 洗涤磁珠 2 次，每次 5 分钟，灭活游离甲苯磺酰基团。
   5. 将磁珠在 200 μL 缓冲液-3 中在 4 °C 下孵育 24 小时，或在 37 °C 下孵育 4 小时，以灭活剩余的游离甲苯磺酰基。将管放入磁性浓缩器中1分钟，轻轻吸出上清液，然后丢弃。
   6. 用200μL缓冲液-2在4°C下洗涤磁珠1x5分钟。 将管放回磁性浓缩器中1分钟，轻轻吸出上清液。从磁集中器中取出试管，将磁珠重悬于 200 μL 缓冲液-2 中，以获得 4 x 10⁸ 磁珠/mL。
      注意:在此阶段，可以将珠子在4°C下放置长达15天。

3.小鼠肾小球细胞的分离

1. 准备灌注材料:30 mL注射器，25 G蝶针。准备隔离材料:无菌10厘米培养皿，手术刀，磁粉浓缩器，40μm细胞过滤器，100μm细胞过滤器。
2. 准备 100 mL 补充有 1% 抗生素的 1x Hank 平衡盐溶液 （HBSS），并将 pH 值调节至 7.35。用0.2μm过滤器过滤溶液并将其保持在引擎盖下以避免污染。
3. 将步骤 2.1.6 中的 200 μL 磁珠与 20 mL 1x HBSS 混合。
   注意:对于每只小鼠，将需要 200 μL 在 20 mL HBSS 1x 中稀释的磁珠。
4. 在 pH 7.35 的 1x HBSS 溶液中以 1 mg/mL 的比例制备 1 mL 等分试样的 II 型胶原酶 （125 CDU/mg）。在37°C的水浴中用10%FCS培养基预热RPMI。 在37°C下预热内皮细胞培养基（详见 材料表 ）。
   注意:RPMI将用于中和胶原酶。
5. 在室温下用 2 mL 的 10 μg/mL 胶原蛋白 IV（1 mL/孔）预涂 6 孔板的两个孔 45 分钟。用1x PBS清洗板3次，以除去用于稀释胶原蛋白的乙酸。立即使用涂层板或在2-8°C下储存长达4周。
   注意:最好用透明薄膜密封板以防止干燥。胶原蛋白涂层有助于细胞附着在板上。
6. 使用70%乙醇清洁并消毒 图2 中的所有手术器械，随后高压灭菌30分钟。用70%乙醇清洁手术工作区。
7. 用腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪（10mg / mL氯胺酮和1mg / mL甲苯噻嗪）麻醉小鼠。要确认动物是否完全麻醉，请检查脚趾捏反射。
8. 用 19 G 针固定鼠标的爪子，将其固定在解剖平台上。用70%乙醇清洁胸部和腹部，并用剪刀a沿胸部打开腹部（图2）。
9. 将蝶针插入左心室（图3A）并注入约100μL珠溶液（来自步骤1.2）以扩大血液循环。
10. 小心地用19G针头打破肾脏下方的下腔静脉（图3A）。继续在步骤3.9中启动的灌注。
    注意:或者，可以使用迷你泵，速度:18.0+，时间:5分钟。良好的灌注对于收获大量含肾小球的磁珠很重要。这是一个非生存/终末期手术。
11. 用镊子轻轻去除脂肪组织，并用细手术剪刀c（图2）切除两个肾脏，并将它们放入冰上装有1mL 1x HBSS的平板中。用剪刀b（图2）切碎肾脏，然后用无菌手术刀切成1毫米的小块，如图 3B所示。
12. 接下来，将切碎的肾脏与步骤3.4中的1mLII型胶原酶在37°C下孵育35分钟，并使用水平振荡器轻轻倾斜。在此步骤之后，组织应完全消化，如图 3C所示。
13. 加入 4 mL 含有 10% FBS（来自步骤 3.4）的 RPMI 以中和胶原酶。通过无菌的100μm细胞过滤器将消化的组织过滤到50 mL管中。使用无菌 1.5 mL 微量离心管的底部将消化的组织搅拌到过滤器上，以使肾小球通过。
14. 用 15 mL 的 1x HBSS 冲洗细胞过滤器，然后在室温下以 200 x g 离心流出物 5 分钟。此时，颗粒包含三层;在管的中间层可以看到带有肾小球的珠子，上层由较小的结构（例如小管）组成，下层是碎片（图3D）。
15. 小心地吸出上清液和顶部白色层。剩余的颗粒包含带有肾小球和碎片的珠子（图3D）。用 1.5 mL 的 1x HBSS 重悬沉淀，并转移到 2 mL 管中。
16. 将管放入磁性浓缩器（图3E），吸出上清液，然后用1mL的1x HBSS洗涤珠子2次;在此阶段，将 20 μL 细胞悬液放在载玻片上以在显微镜下验证肾小球的存在（图 3F;悬液中有一个肾小球 [黑色箭头]，一些珠子 [黄色箭头]）。
17. 小心吸出上清液，将沉淀重悬于内皮细胞生长培养基中（材料表），并将其转移到干净的2 mL管中。向管中加入 2 μL IFNγ （100 U/mL），并将细胞接种到 6 孔板的一个孔中。将细胞在33°C孵育。
18. 培养 3 天后，通过移出 1 mL 培养基并用 1 mL 新鲜培养基替换来小心更换培养基。在这个阶段，细胞是异质的，肾小球细胞的混合物（图4G）。
    注意:在生长的培养物中，将有肾小球细胞和一些磁珠的混合物（图4G）。请注意，所有细胞都应显示绿色荧光线粒体。
19. 培养 7 天后，完全吸出培养基，并用补充有 IFNγ （100 U/mL） 的新鲜 2 mL 内皮细胞生长培养基替换。在这个阶段，细胞开始增殖，但仍然是异质的（图4A）。
20. 培养10天后，当细胞达到~80%汇合时，如步骤5.1中所述使用胰蛋白酶传代细胞，然后将它们转移到涂有胶原蛋白IV的T25烧瓶中。
21. 1周后（总共~21天的培养），将细胞传代到涂有胶原蛋白IV的T75烧瓶中。

4. 内皮细胞分离用磁珠的制备

1. 首先用大鼠抗鼠CD31抗体³，^18，19涂覆绵羊抗鼠珠。每个 T75 烧瓶使用 10 μL 珠子。
2. 用补充有 0.1% BSA、2 mM EDTA、1% 青霉素/链霉素的 200 μL 1x PBS 洗涤 3 次 10 μL 珠子。将试管放入浓缩器磁铁中，每次移液洗涤缓冲液。
3. 将磁珠重悬于 200 μL PBS、1% BSA、2 mM EDTA、1% 青霉素/链霉素中。加入4.8μL大鼠抗小鼠CD31抗体⁷，^18，19，^将管放在水平振荡器上并在室温下轻轻混合1小时^，然后将管在4°C下保持过夜。

5.用CD31包被的珠子分离肾小球内皮细胞

1. 向T75烧瓶中加入3mL 0.25%胰蛋白酶，并将细胞在37°C孵育5分钟。用3mL内皮生长培养基中和胰蛋白酶，将细胞转移到15mL管中，然后以200× g 离心5分钟。
2. 吸出上清液并在含有 1% BSA、2 mM EDTA、1% 青霉素/链霉素的 1 mL PBS 中洗涤细胞。以200 x g 离心5分钟。
3. 将沉淀重悬于步骤 4 中制备的 200 μL 包被珠中，并加入含有 1% BSA、2 mM EDTA、1% 青霉素/链霉素的 800 μL PBS。将细胞在37°C，5%CO₂下连续振荡孵育45分钟。
4. 将试管放入磁浓缩器中，用含有1%BSA，2mM EDTA，1%青霉素/链霉素的1x PBS洗涤细胞4倍。将细胞重悬于补充有 100 U/mL IFNγ 的 3 mL 内皮生长培养基中。
5. 在 6 孔板上的胶原蛋白 IV 包被孔中板 1.5 mL 细胞/孔中。在33°C的允许条件下培养细胞。
   注意:分离的细胞表达猿病毒40（SV40）大T抗原tsA58，能够在33°C（允许条件）下激活连续增殖。
6. 培养 4 天后，取出 750 μL 培养基，并用补充有 100 U/mL IFNγ 的相同体积的新鲜培养基代替。
7. 培养 10 天至 14 天后，使用带有 488 nm 滤光片的落射荧光显微镜检查表达荧光线粒体的生长 CD31 阳性 GEC 集落（图 4C）。
8. 培养21天后，细胞可能达到80%-90%汇合;将它们转移到T25烧瓶中。达到汇合后，可以用RPMI生长培养基和10%FCS维持细胞。
   注意:在达到汇合之前，细胞可能看起来是异质的（图4B）。然而，一旦它们汇合，它们就会获得鹅卵石形态。
9. 在这个阶段，细胞可以被冷冻保存。达到80%汇合度后，向细胞中加入3mL的0.25%胰蛋白酶，并在37°C下孵育5分钟。用补充有10%FBS的等体积生长培养基中和胰蛋白酶。
10. 以200 x g 离心5分钟。弃去上清液并将细胞重悬于3mL冷冻培养基（RPMI，20%FBS，10%DMSO）中。将细胞分装在冷冻管中，并将其储存在液氮蒸气温度下。

6. 培养有丝分裂树2-GEC

1. 从步骤5.10开始，在37°C的水浴中解冻来自冷冻等分试样的细胞，并将它们转移到带有10mL预热内皮生长培养基的15mL管中。
2. 在室温下以200× g 离心悬浮液5分钟。除去培养基，并将沉淀转移到胶原蛋白IV包被的T25cm² 细胞培养瓶中，该培养瓶中装有补充有100U / mL IFNγ的预热内皮细胞生长培养基，并在33°C下孵育。
3. 第二天更换培养基。当细胞达到70%-80%汇合时，通常在5天后，将它们转移到T75cm² 细胞培养瓶中。
4. 为了将细胞分化为内皮表型，将细胞转移到37°C的无IFNγ生长培养基中的非允许条件。

7. 丝裂树2-GEC的传代

1. 取出培养基，用PBS洗涤细胞，并加入3mL温热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（T75cm² 烧瓶），在37°C孵育5分钟。
2. 细胞分离后，加入 5 mL 生长培养基并上下移液。在室温下以200× g 离心悬浮液5分钟，并将细胞转移到新的胶原蛋白IV包被烧瓶或平板中。
   注意:传代应每周进行一次，比例为1:4。

8. 丝分裂树2-GEC的表征

1. 对分化的细胞⁷，^18，19，20进行CD31的免疫荧光染色（图4D）。使用其他标志物，如vWF和异凝集素-B4以及²⁰。
2. 为了确认Dendra2的线粒体特异性，通过将细胞在含有100nM线粒体追踪器的生长培养基中在37°C，5%CO₂下孵育30分钟，用线粒体特异性标记标记细胞。
3. 取出培养基，用不含酚红的预热培养基轻轻洗涤细胞以进行实时成像。
   注意:或者，可以使用甲醛固定剂（4%）固定细胞30分钟，然后在PBS中洗涤几次。固定电池可以在4°C下储存在1x PBS中直至使用。流式细胞术也可以进行确认:用抗CD31，抗PECAM，抗CD45标记细胞。GEC 的足细胞标志物（突触足素、Nphs1、Podxl）、系膜细胞标志物（PDGFRβ、血管紧张素原）和肾小管细胞标志物（水通道蛋白、氨基肽酶-N）应呈阴性。这些标记物用作阴性对照。由于这些细胞的线粒体特异性Dendra2表达，请避免使用FITC通道。

9. 响应氧化应激或高葡萄糖的线粒体结构变化的活细胞成像

1. 使用内皮细胞生长培养基在涂有胶原蛋白IV的35毫米玻璃底培养皿上板1 x 10⁵ GEC（材料表）。24小时后，换成不含酚红的培养基。细胞具有绿色荧光线粒体。
2. 在实验开始前1小时将环境室置于37°C，5%湿度和5%CO₂ 小时。
3. 在共聚焦显微镜下，使用40x/1.2 W物镜调整焦点并选择感兴趣区域。将细胞与 2mL 的 5 mM 或 25 mM 葡萄糖孵育 60 分钟。
4. 将细胞暴露在405nm激光（4%激光功率）下，将线粒体亚群从绿色光转换为红色（图5A-B，D-E）。
5. 使用 561 nm 激光在未转换状态下激发 Dendra2，以可视化红色荧光。详见前面描述的光切换协议¹⁶。由于绿色基质和红色基质融合，融合事件在几分钟后显示为黄色荧光（图4C，F）。

Results

在本文中，描述了用于分离具有稳定荧光线粒体（mitoDendra2-GEC）的条件永生化肾小球内皮细胞的详细方案（图1）。使用年轻的6-10周龄小鼠对于获得大量健康细胞至关重要。培养3天后，细胞开始从分离的肾小球缓慢生长，如图3G所示。7天后，细胞呈异质性，显示其他肾小球细胞类型，如足细胞，壁上皮细胞和系膜细胞（图4A）。达到70%至80%汇合后，使用具有磁性CD31标记磁珠的内皮细胞的阳性选择去除其他肾小球细胞（图4B-C）。mitoDendra2-GEC表达CD31（图4D），足细胞标志物呈阴性，如突触足素阴性染色所示（图4E-F）。

Discussion

线粒体对细胞代谢、稳态和应激反应至关重要，其功能障碍与许多疾病有关，包括肾脏疾病。线粒体在过量活性氧（ROS）的病理生成，细胞内钙水平，细胞死亡途径和细胞骨架动力学的调节中起作用²¹，^22，23。

小鼠GEC的分离具有挑战性，因为它们的数量，大小，基质因子很少，并且与其他肾小球细胞的相互依赖性，而这些细胞对其生存至关重要。本文介绍了小鼠GEC分离的详细方案。具体来说，我们使用转基因小鼠作为工具获得具有高增殖潜力的条件永生化细胞系。表达猿病毒40（SV40）大T抗原tsA58的转基因小鼠能够在33°C的允许条件下激活连续增殖，并在这里与表达线粒体特异性荧光的 PHAM^切除 小鼠杂交。双转基因小鼠为研究线粒体结构提供了极好的工具。事实上， PHAM^切除的 小鼠携带线粒体特异性（细胞色素c氧化酶的亚基VIII）Dendra2...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 和微;m 细胞过滤器	Fisher	22-363-549
1ml 胰岛素注射器	BD	329424
25G 蝴蝶	BD	367298
3 毫米尖端剪刀	FST	15000-00
30ml 注射器	BD Biooscience	309650
40 µM 细胞过滤器	Fisher	22-363-547
40 µm 尼龙网波
恩剪刀	FST	14184-09
牛血清白蛋白	Fisher	BP1600-100
CD31	abcam	ab7388
I型胶原酶	康宁	354236
II型胶原酶	SIGMA	C6885	125CDU/mg
IV 型胶原	SIGMA	C5533-5M
Dnase-I	Qiagen	79254
Dynabeads 450	Thermofisher Scientific	14013
内皮细胞生长培养基	Lonza	cc-3156
超细镊子	FST	11150-10
FBS	Gemini	100-106	热灭活
纤连蛋白	Thermofisher	33016015
细镊子	FST Dumont	E6511
HBSS	GIBCO	14065-056
IFNg	细胞科学	CRI001B
Immortomouse	Jackson 实验室	32619	Tg（H2-K1-tsA58）6Kio/LicrmJ
L-谷氨酰胺 100x	Thermofisher Scientific	25030081
磁珠浓缩器	Thermofisher Scientific	12320D
mitotracker	Thermofisher Scientific	M7512
PBS 1X	Corning	46-013-CM
青霉素链霉素 100x	Thermofisher Scientific	10378016
PhaM 小鼠	Jackson 实验室	18397	B6;129S-GT（ROSA）26Sortm1.1（CAG-COX8A/Dendra2）Dcc/J
蛋白酶 （10 mg/ml）	SIGMA	P6911
RPMI	GIBCO	3945
丙酮酸钠 100mM	Thermofisher Scientific	11360070
标准图案镊子	FST	11000-12
手术剪刀 - 锐利-钝	FST	14008-14
突触足素	Santa Cruz	sc-515842
胰蛋白酶 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054