优化经食管心房起搏评估小鼠心房颤动易感性

摘要

本实验方案描述了在使用经食管心房起搏评估小鼠心房颤动易感性时，优化实验参数的方法。

摘要

房颤（AF）的遗传性和获得性危险因素小鼠模型在研究AF的分子决定因素方面已被证明具有重要价值。可通过经食管心房起搏进行程序性电刺激，作为一种可存活的操作，从而实现对同一只动物进行系列检测。然而，目前存在多种起搏方案，这给实验的可重复性带来了困难。本方案旨在提供一种标准化策略，以建立针对特定模型的实验参数，从而提高不同研究之间的可重复性。需先开展初步研究，以优化所考察特定模型的实验方法，包括研究时动物的年龄、性别以及起搏方案的参数（如起搏模式和房颤易感性的定义）。尤为重要的是，应避免使用过高的刺激能量，因为这可能导致神经节丛受到刺激，意外激活副交感神经系统，表现为起搏期间出现明显的房室（AV）阻滞，并常伴随人为假象的房颤诱发。出现此类并发症的动物必须从分析中剔除。

引言

心房颤动（AF）是多种获得性和遗传性危险因素共同作用的最终通路。在研究AF基质的病理生理机制时，小鼠模型具有优势，因为小鼠易于进行遗传操作，且通常能够重现人类不同临床表型下观察到的AF易感性^1,2,3。然而，小鼠极少发生自发性心房颤动⁴，因此需要采用激发性心房起搏研究。

程序性电刺激（PES）可用于评估小鼠心房电生理特性及心房颤动（AF）易感性，可通过心内电极⁵或经食管电极⁶起搏实现。尽管经食管方法作为可存活手术具有显著优势，但其应用因大量已发表的实验方案^7,8以及可能影响可重复性的多种变异来源而变得复杂⁹。此外，现有文献中对不同方案的比较报道有限，使得选择合适的起搏方案具有挑战性。

本方案旨在采用系统性策略，建立针对特定模型的小鼠房颤易感性评估经食管程序性电刺激（PES）方法，以提高实验的可重复性。重要的是，需首先开展初步的预实验，通过考虑年龄、性别及起搏模式的差异来优化起搏方案，所设计的起搏程序应尽量减少意外的副交感神经刺激，以免干扰实验结果⁹。

方案

该实验程序已获得范德堡大学机构动物护理和使用委员会的批准，并符合《实验动物护理和使用指南》的要求。本方案采用遗传性⁹和获得性¹⁰（如高血压）两种房颤易感小鼠模型进行开发。操作人员对所研究小鼠的表型保持盲态。

1. 动物选择

1. 对于遗传模型，按照以下所述方法（见步骤6）对小鼠进行双周一次（即每隔一周）的心房起搏，以确定房颤易感性的最佳时期。
   1. 从8周龄开始进行双周起搏。使用同窝野生型小鼠作为对照组以减少变异性。应同时研究雄性和雌性小鼠，因为其中一种性别可能不会表现出房颤表型⁹。
2. 对于获得性模型，在小鼠达到生理成熟后（约12周龄）¹⁰进行起搏。如上所述，应同时研究雄性和雌性小鼠。
3. 在这些初步研究中，应同时进行短阵快速起搏⁸（使用固定的起搏周长[CL]）和递减性起搏⁷（起搏周长逐步缩短），以确定最佳起搏模式。每次操作之间至少间隔24小时。
   注意：随着研究的小鼠数量逐渐增加，应定期回顾累积数据，以确定最适宜的年龄、性别和起搏模式，这些条件应能在房颤易感小鼠中诱导房颤，但在对照组中不诱导。
   1. 采用多种房颤易感性定义来分析数据（例如房颤发作次数⁸、总房颤持续时间⁹、房颤发生率⁴以及持续性房颤发生率，通常定义为持续10秒¹¹或15秒¹²，甚至长达5分钟^13,14），因为某些模型可能仅在部分定义下表现出房颤表型，而在其他定义下则不表现⁹。
      注意：不同已发表研究中对房颤发作和房颤易感性的定义存在差异^4,7。房颤发作⁸通常定义为持续至少1秒的快速心房电活动，并伴有不规则的不规则 心室反应（图1）。除房颤外，心房起搏还可能诱发心房扑动，其心室反应可为规则或不规则。
4. 在后续对更多小鼠的研究中，使用已优化的模型特异性参数及房颤易感性定义。

2. 动物准备

1. 使用1 L/min的100%氧气携带3%异氟烷（见材料表）在诱导室中对小鼠进行麻醉。
   注意：异氟烷有害，可能刺激皮肤或眼睛，并可引起头晕、疲劳和头痛等中枢神经系统毒性。应在通风良好的区域使用，并配备适当的废气清除装置（例如活性炭罐）。
2. 待小鼠脚掌反射消失后，将其仰卧置于可维持体温约37 °C的加热垫上，并用胶带将后肢固定于垫面。
3. 在小鼠眼部涂抹润滑眼膏，以防角膜干燥。
4. 将 麻醉面罩牢固地覆盖在小鼠鼻部，使用1 L/min的100%氧气携带1%异氟烷维持麻醉。确保鼻孔无阻塞，因为小鼠为 obligate nose breathers（必须经鼻呼吸）。
5. 将27 G心电图针状电极（见材料表）皮下插入前肢，并连接至生物放大器和数据采集硬件，以获取体表心电图（ECG，I导联）。将另一针状电极插入左后肢作为接地电极以完成信号接地。

3. 导管置入

1. 短暂移除小鼠的异氟烷面罩。
2. 将连接至刺激器和刺激隔离器（参见材料表）的2-F八极电极导管（电极宽度和间距 = 0.5 mm）插入食管（图2）。
   1. 插入深度应大致等于从口腔（颈部伸展状态下）至剑突稍上方的距离。
3. 重新将异氟烷面罩置于小鼠鼻孔处。
4. 使用分析软件（参见材料表）开始数据采集，持续记录I导联心电图。
5. 将刺激隔离器模式调整为双极模式。刺激时使用最远端的一对电极。
6. 在食管内正确放置导管以实现有效捕获。具体操作：施加1.5 mA、脉宽2 ms的刺激，刺激周长（CL）略短于窦性周长（例如，若窦性周长为120 ms，则使用100 ms的周长）。仔细调整导管位置，直至获得稳定的心房捕获。

4. 阈值的确定

1. 为确定心房舒张期起搏阈值（TH），在用于心房起搏的周长（CL）下，以1.5 mA的电流强度和2 ms的脉宽开始起搏。以0.05 mA为递减步长逐步降低刺激幅度，直至心房起搏消失，随后再逐步增加刺激幅度直至恢复起搏。
   注意：能够稳定获得心房起搏的最低刺激幅度即为心房TH。由于高刺激幅度可能引起副交感神经兴奋，表现为起搏过程中出现明显房室传导阻滞并诱发伪性心房颤动⁹，因此可接受的最大TH为0.75 mA。如有必要，可重新调整导管位置，以确保TH ≤0.75 mA。
2. 将刺激幅度调整为TH的两倍。

5. 电生理特性的测定

1. 在快速心房起搏诱发房颤之前，测量电生理参数，包括窦房结恢复时间（SNRT）、文氏周期长度（WCL）和房室有效不应期（AVERP）¹⁵。

6. 心房心律失常易感性

1. 根据初步研究结果（步骤 1.1.–1.4.）确定采用不同周长（CL）的短阵快速刺激或递减刺激，以两倍阈值强度（TH）和 2 ms 脉宽进行起搏。
2. 对于短阵快速刺激，初始周长为 50 ms，持续起搏 15 秒，随后依次以 40 ms、30 ms、25 ms、20 ms 和 15 ms 的周长进行起搏^8,10。每次起搏序列后暂停 30 秒，以允许组织恢复后再继续。若某次起搏序列后发生心房颤动（AF），需在心律转复后等待 30 秒再进行下一次起搏。
3. 对于递减刺激，以 40 ms 周长开始起搏，每 2 秒减少 2 ms，直至周长达到 20 ms 时终止⁷。每种起搏序列重复进行三遍¹⁶或五遍¹⁷，每次序列后暂停 30 秒以供恢复。同上，若出现心房颤动，需在心律终止后等待 30 秒再继续后续起搏。
   注意：在初步实验中优化方案参数时（即步骤 1.1.–1.5.），应使用五次起搏序列。随后进行事后分析，以确定三遍或五遍重复是否具有更高的敏感性。
4. 在最后一次起搏序列结束后，若出现持续 30 秒的窦性心律，或发生持续 10 分钟的心房颤动，则终止实验，以先发生者为准。

7. 术后处理

1. 停止数据采集。
2. 轻柔地移除导管和心电图电极。
3. 停止麻醉。
4. 将麻醉状态的小鼠放入笼中，观察10分钟，确保其恢复。
5. 保存数据文件。若需进行连续测试，需至少等待24小时后方可重复起搏操作。

结果

经食管心房起搏研究通过测定窦房结恢复时间（SNRT）和房室结有效不应期（AVERP）以及心房颤动（AF）易感性，来评估窦房结和房室结的电生理特性⁶（图1）。心电图（ECG）记录可用于测量P波持续时间、PR间期、QRS持续时间和QT/QTc间期。在快速心房起搏期间持续记录心电图，可提供以下心房颤动易损性的指标：研究期间诱发的心房颤动发作次数、发作的累积持续时间和平均持续时间，以及持续性心房颤动的发作次数。起搏过程中出现明显房室传导阻滞的发作，可反映起搏诱导的副交感神经兴奋状态（图3），提示相关的心房颤动为此现象的人工假象，而非模型本身的病理生理机制所致⁹。

讨论

经食管心房起搏不仅能够在同一动物体内进行系列研究，而且其持续时间通常比心内电生理研究更短（约20分钟），从而减少了麻醉药物的使用及其对电生理参数的影响。

对于每种小鼠模型，最初都必须优化方法。在正常小鼠中，衰老会增加心房颤动（AF）的可诱导性^18,19，而不同的遗传模型可能仅在有限的时间段内表现出AF的可诱导性。每隔一周进行预实验，可以确定一个年龄窗口，在此期间AF表型小鼠可被诱导，而对照组小鼠则不能。性别可能是一个决定性因素，因为一种或两种性别的小鼠都可能表现出可诱导的AF⁹。此外，特定小鼠可能仅对一种起搏模式表现出AF易感性，而其他小鼠则对另一种模式或多种模式表现出AF易感性⁹。

快速心房起搏期间，小鼠可能出现过度的房室传导阻滞，这种情况常与心房颤动（AF）的诱发同时发生。该现象是由于意外刺激了位于左心房后壁的神...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
27 G 心电图电极	ADInstruments	MLA1204
2-F 八极电极导管	NuMED	CIBercath
活性炭罐	VetEquip	931401
分析软件	ADInstruments	LabChart v8.1.13
生物放大器	ADInstruments	FE231
数据采集硬件	ADInstruments	PowerLab 26T
眼药膏	MWI Veterinary	NC1886507
加热垫	Braintree Scientific	DPIP
异氟烷	Piramal	66794-017-25
刺激器	Bloom Associates	DTU-210
刺激隔离器	World Precision Instruments	Model A365