工业化的、人工智能引导的激光显微切割技术用于肿瘤微环境的微尺度蛋白质组学分析

摘要

本方案描述了一种高通量工作流程，利用人工智能对染色的薄组织切片图像中经病理学确认的兴趣区域进行分割，以通过激光显微切割富集组织学分辨的细胞群体。该策略包含一种新算法，可将标记感兴趣细胞群体的边界直接传输至激光显微镜。

摘要

肿瘤微环境（TME）是一个复杂的生态系统，包含数十种不同的细胞类型，包括肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞群体。为了在大规模条件下表征蛋白质组水平的变异性和肿瘤异质性，需要高通量方法以选择性地分离实体瘤恶性组织中的特定细胞群体。本实验方案描述了一种由人工智能（AI）驱动的高通量工作流程，该流程可将苏木精和伊红（H&E）染色的薄组织切片图像分割为经病理学确认的兴趣区域，进而通过激光显微切割（LMD）技术选择性获取组织学分辨率下的特定细胞群体。该策略包含一种新型算法，能够将使用数字图像软件标注的、代表目标细胞群体的区域直接转移至激光显微镜，从而实现更便捷的样本采集。该工作流程已成功实施，证明了该标准化方法在从TME中选择性获取肿瘤细胞群体用于高分辨率质谱进行定量、多重蛋白质组学分析方面的实用性。该策略可完全整合到常规组织病理学评估中，利用数字图像分析支持目标细胞群体的富集，且具有完全通用性，可实现从TME中标准化获取细胞群体用于多组学分析。

引言

肿瘤微环境（TME）是一个复杂的生态系统，包含多种多样的细胞类型，如肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞、内皮细胞、其他间充质细胞类型以及脂肪细胞，同时还包含复杂的细胞外基质¹。该细胞生态系统在不同疾病器官部位内部及之间均存在差异，导致肿瘤异质性复杂化^2,3。近期研究表明，具有高度异质性或肿瘤细胞含量较低（低纯度）的肿瘤通常与较差的疾病预后相关^2,3。

为了在大规模上理解肿瘤微环境（TME）中肿瘤细胞与非肿瘤细胞群体之间的分子相互作用，需要标准化且高通量的策略，以选择性地分离出特定的细胞群体，用于后续的多组学分析。定量蛋白质组学是一种快速发展的、日益重要的技术，有助于进一步揭示癌症生物学机制。迄今为止，大多数采用蛋白质组学的研究均基于从完整肿瘤组织样本（如冷冻粉碎组织）中提取的蛋白质，导致对TME中蛋白质组水平异质性的理解仍然十分有限^4,5,6。

开发能够无缝整合并利用临床病理工作流程信息的样本采集策略，将推动新一代组织学解析蛋白质组学的发展，这类蛋白质组学与作为金标准的诊断病理工作流程高度互补。激光显微切割（LMD）技术可通过显微镜对组织学染色的薄切片进行观察，直接且选择性地采集特定的细胞亚群或感兴趣区域（ROIs）⁷。近年来，数字病理学和人工智能辅助分析取得了重大进展，已证明能够以自动化方式识别肿瘤微环境（TME）中独特的组分特征和感兴趣区域，其中许多特征与分子改变及临床疾病特征（如治疗耐药性和疾病预后）相关⁸。

本方案所述的工作流程利用商业软件在数字组织病理学图像中选择性地标注肿瘤感兴趣区域（ROI），并采用自主研发的软件工具将这些肿瘤ROI转移至激光显微切割系统，以自动采集特定的细胞群体，且可无缝衔接下游的多组学分析流程。该整合策略显著减少了激光显微切割操作人员的工作时间，并最大限度缩短了组织在常温环境下的暴露时长。通过针对两种代表性上皮性卵巢癌组织学亚型——高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和卵巢透明细胞癌（OCCC）——的肿瘤微环境（TME）进行差异分析，验证了自动化特征筛选与激光显微切割采集联合高通量定量蛋白质组学技术的整合应用。

方案

所有研究方案均经西方机构审查委员会（IRB）批准，适用协议"子宫内膜癌与卵巢癌的整合分子分析以识别和验证具有临床指导意义的生物标志物"，根据美国联邦法规45 CFR 46.102(f)被认定为豁免审查。本研究中涉及人类数据的所有实验方案均遵循《赫尔辛基宣言》。已从所有参与研究的受试者处获得知情同意。

注意：本实验方案中使用的以下试剂为已知或疑似致癌物和/或含有有害物质：乙醇、DEPC 水、Mayer 苏木精溶液、伊红 Y 溶液、甲醇、乙腈和甲酸。必须按照相应的安全数据表（SDS）中的说明进行正确操作，并使用适当的个人防护装备（PPE）。

1. 生成包含校准标记的默认形状列表数据（.sld）文件

注意：本节所述的实验步骤仅适用于倒置激光显微镜及其配套软件（参见材料表）。每个激光显微镜仅需创建一次默认的 .sld 文件，生成的文件可用于后续所有 PEN 载玻片上的定位标记切割。预计耗时：5 分钟（仅需一次）。

1. 打开LMD软件，将聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片倒置放置于LMD载物台上，标签朝向用户。在程序窗口右侧取消勾选闭合线条（Close line(s))选项。
2. 在高倍放大（63x）下使用点对点（PtoP)功能绘制三个"V"形箭头作为校准标记。从V的一个外端点开始，画线至V的中点并单击；然后从V的中心点画第二条线至另一个外端点，双击以由两条线形成一个未闭合的V形单一图形。
   注意：这些校准标记应放置在载玻片的三个角落：前右、后右、后左。
3. 选择切割前自动对焦（AF before cut)选项。在位置1处切割载玻片，随后将其移至其余各载玻片位置，并精确沿已有的校准切口描迹。
4. 保存.sld文件，并在弹出的对话框中选择不带校准保存（Save without calibration)选项，以避免将校准标记切割入膜中。
   ​注意：标准校准标记的代表性.sld文件（包含四个载玻片位置）见补充文件1。

2. 激光显微切割切片的制备

注意：本节所述的实验方案步骤专用于倒置激光显微镜及其配套软件（参见材料表）。预计耗时：5 分钟。

1. 在切割参考校准标记之前，确保载玻片完全干燥。打开LMD软件，并在导入形状选项下打开默认的校准.sld文件。
2. 选择切割前自动对焦（AF）选项。将组织面朝下、标签端靠近操作者的载玻片装入LMD载物台的载片架中。
3. 使用激光显微镜和默认校准.sld文件，在PEN膜上切割校准标记。
   1. 可选：可在组织切片放置于载玻片之前或之后，在PEN膜上切割校准标记。如果在校准标记切割完成后再放置组织，则在第2.5步放置组织时，应确保组织和/或固定剂不与校准标记区域重叠。如果在组织放置后切割校准标记，则在完成第2.4步后停止，并进入第3节操作。
4. 逐一检查所有校准标记，确保每个切割完整且清晰可见。
   注意：使用移动与切割功能，手动引导激光重新切割未完全穿透PEN膜的校准标记。
5. 将冷冻或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织切片置于含有校准标记的载玻片上。

3. 组织染色

注意：预计时间：30 分钟。

1. 将冷冻的激光显微切割（LMD）组织切片置于含有磷酸酶抑制剂混合试剂的70%乙醇（EtOH）中固定5分钟。
2. 将切片在含有磷酸酶抑制剂混合试剂的焦碳酸二乙酯（DEPC）水中洗涤1分钟。
3. 将切片在DEPC水中洗涤1分钟。
4. 将切片置于Mayer苏木精溶液中孵育3分钟。
5. 将切片在DEPC水中漂洗3分钟。
6. 将切片在新鲜更换的DEPC水中再漂洗1分钟。
7. 将切片置于水溶性伊红Y（Eosin Y）溶液中孵育1秒。
8. 将切片在95%乙醇中漂洗2次，每次5秒。
9. 将切片在100%乙醇中漂洗3次，每次10秒。
10. 擦去切片背面多余的乙醇，并让切片自然晾干。
11. 若不立即进行激光显微切割（LMD），则将切片储存于-80 °C。

4. 载玻片成像

注意：本节所述的实验步骤专门针对扫描载玻片（参见材料表）并将其生成的图像保存为 .svs 文件的情况。可使用任何扫描仪及其配套软件，只要其生成的图像文件格式能够被图像分析软件（参见材料表）打开即可。支持的基于金字塔式 TIFF 结构的文件类型包括 JPG、TIF、MRXS、QPTIFF、分量 TIFF、SVS、AFI、SCN、LIF、DCM、OME.TIFF、ND2、VSI、NDPI、NDPIS、CZI、BIF、KFB 和 ISYNTAX。预计耗时：5 分钟。

1. 打开扫描仪并启动载玻片扫描软件。将组织面朝上的载玻片放入扫描仪的单片载物台上。确保载玻片完全干燥，然后轻轻在组织上覆盖盖玻片。切勿在盖玻片下使用乙醇或浸油。
2. 根据制造商的说明，使用经过校准的设置捕获显微图像，以调整 PEN 膜而非玻璃背景，并忽略背景膜染色。
3. 根据需要，通过拖动和调整内部绿色边框的大小来设定成像区域，以覆盖整个 PEN 膜区域。通过在快照概览图像上双击，在组织上添加四个对焦点，并在靠近校准标记的膜上添加三个对焦点（每个校准标记各设一个对焦点）。
   注意：四个对焦点可几乎放置在组织切片的任意位置，但若放置在染色过深、呈黑色的组织区域，可能导致扫描失败。
4. 在 查看 菜单下，选择 视频监视器。根据需要，使用微调和/或粗调焦滑块，手动调整 LMD 组织周围每个点的焦距。在高倍放大（20x）下进行图像扫描。确认保存的图像中所有校准标记均清晰可见。

5. 使用图像分析软件进行自动特征选择

1. 对于完整肿瘤组织的收集（所需时间约5分钟，视具体病例而定）：
   1. 打开图像分析软件（参见 材料表）。选择 开放图像 在弹出窗口中，选择由AT2扫描仪扫描载玻片生成的.svs图像文件。
      注意：一个代表性的 .svs 图像文件已提供于 补充文件 2.
   2. 导航至 注释 标签。选择 笔 使用注释工具栏中的工具，在组织周围绘制一个形状。
   3. 选择形状，然后在图像上单击右键。从 高级 下拉菜单，选择 分区（分块）. 设置 瓦片尺寸 和 空间 到 500 和 40分别选择 好的 生成瓦片后，选择并删除第5.1.2步中用于生成瓦片的外围形状。
   4. 选择 图层操作 下拉菜单 | 导出 将拼接的注释保存为 .annotation 文件。
      注意：随附一份用于完整肿瘤组织采集的代表性 .annotation 文件。 补充文件 3.
   5. 为该会话或项目创建一个文件夹，并将 .annotation 文件保存在以该切片唯一标识符命名的子文件夹内。
   6. 导航至 注释 选项卡。选择 图层操作 下拉菜单 删除所有图层 以移除图像中的所有注释。选择 笔 工具，并从每个校准标记的箭头内端画一条短线。按以下顺序从标记处画线：左上、右上、右下。
   7. 选择 图层操作 下拉菜单 | 导出 将行注释另存为 .annotation 文件。添加 _calib 将文件名添加到文件中，并将该文件放入包含拼接图形坐标的子文件夹中。
      注意：一个代表性的 _calib.annotation 文件可在 补充文件 4.
   8. 复制主项目或会话文件夹的地址。打开XML导入生成脚本， "锤子" （可获取） 通过 https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022)，使用 IDLE 集成开发环境，并将项目文件夹地址粘贴至脚本末尾的引号之间。
   9. 选择 运行 下拉菜单 | 运行模块 执行脚本。
      注意：.xml LMD 导入文件将生成在为图像/切片创建的子文件夹内。一个具有代表性的 .xml 文件已在其中提供 补充文件 5.
2. 仅适用于激光显微切割富集样本（约15分钟；视具体病例而定）：
   1. 打开图像分析软件（参见 材料表）。选择 开放图像 在弹出窗口中，选择扫描玻片后生成的 .svs 图像文件。
   2. 导航至 注释 标签。选择并使用该 矩形 使用标注工具在组织周围绘制一个方框。
   3. 选择框注释，然后在图像上单击右键。选择 高级 下拉菜单 分区（平铺） 选项。设置 瓦片尺寸 和 空间间隔 到 500 和 40分别，并选择 好的 生成瓦片后，选择并删除第5.2.2步中用于生成瓦片的周界框注释。
   4. 选择 图层操作 下拉菜单 | 导出 将拼接的注释保存为 .annotation 文件。
   5. 放置一份保存好的 Python 副本 "Dapọ"（可获得） 通过 https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022）算法，用于将人工智能分类的注释图层与瓦片化注释文件合并至同一文件夹中。
   6. 复制平铺注释文件的名称。使用 IDLE 集成开发环境打开 Python 程序，并将平铺注释文件的名称粘贴到程序末尾引号之间。
   7. 选择 运行 下拉菜单 | 运行模块等待生成一个新文件，该文件将所有分块标注合并到单一层中。
   8. 打开图像分析软件并导航至 注释 标签。选择 图层操作 下拉菜单 删除所有图层 移除图像中的所有注释。
   9. 选择 图层操作 下拉菜单 | 导入本地注释文件在弹出窗口中，选择由脚本生成的合并后的.annotation文件。确保所有导入的切片均位于同一注释层下。
   10. 导航至 分类器 选项卡，并按照制造商的说明生成感兴趣区域（ROI）的形状。在运行分类器之前，通过勾选一个或多个ROI框来选择所需的注释层（例如，肿瘤层或间质层）。 注释 标签，位于下方 高级分类器选项. 使用 标注层 选项从 分类器操作 运行分类器的菜单。
   11. 分类器分析完成后，转至 注释 标签，然后选择从分析生成的注释层。选择 图层操作 下拉菜单 | 仅保留当前图层，删除所有其他图层 移除图像中的所有其他注释图层。
   12. 选择 图层操作 下拉菜单 | 导出 将注释保存为 .annotation 文件。为会话或项目创建一个文件夹，并在以该切片唯一标识符命名的子文件夹内保存 .annotation 文件。
       注意：随附一份用于已分类的激光显微切割富集组织样本的代表性 .annotation 文件 补充文件 6.
   13. 导航至 注释 标签，选择 图层操作 下拉菜单 删除所有图层 移除图像上的所有注释。选择 笔 工具并从每个校准标记处画一条短线。按以下顺序从标记处画线：左上、右上、右下。
   14. 选择 图层操作 下拉菜单 | 导出 将行注释保存为 .annotation 文件。添加 _calib 将文件名添加到文件中，并将该文件放入包含平铺图形坐标的子文件夹中。
   15. 复制主项目或会话文件夹的地址。打开XML导入生成脚本， "锤子" （可获取） 通过 https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022)，使用 IDLE 集成开发环境，然后将项目文件夹地址粘贴到脚本末尾的引号之间。
   16. 选择 运行 下拉菜单 | 运行模块 执行脚本。
       ​注意：.xml LMD 导入文件将生成在为图像/幻灯片创建的子文件夹内。

6. 激光显微切割

注意：本节所述的实验方案步骤专用于倒置激光显微镜及其配套软件（参见材料表）。预计耗时：2 小时；视具体样本情况而定。

1. 将带有标记的膜片（含校准基准点）放入激光显微镜载物台的载片架中，组织面向下，标签侧靠近操作者。
2. 从文件下拉菜单中选择导入图形。选择为此玻片生成的.xml LMD 导入文件。在弹出窗口中选择否，以避免从文件加载参考点；在第二个弹出窗口中选择否，以避免使用任何先前存储的参考点进行校准。
3. 根据 LMD 应用程序的提示，将校准十字对准玻片上的三个校准基准点。在图像分析软件中，查找分别出现在玻片图像左上角、右上角和右下角的校准基准点，这些点对应于显微镜载物台上倒置的 LMD 玻片的前右角、后右角和后左角的参考点。使用 5x 物镜定位，切换至 63x 物镜对每个校准基准点进行精确对准。在弹出窗口中选择否，以避免将参考点保存到文件中；在第二个弹出窗口中选择确定，确认玻片已插入。
4. 将 5x 物镜移至工作位置，在弹出窗口中选择是，以使用实际放大倍数。导入的图形出现后，调节相机焦距，使组织清晰成像。
5. 在图形列表窗口中高亮并选中所有图形，利用视野内的一个或两个标注作为参考，将其拖动至正确位置，并将切割用的垂直 z 轴与激光对齐。
6. 检查导入的图形，并将其分配至相应的收集管位置。按下开始切割以启动激光。
   ​注意：.xml 文件中导入的图形将自动分配至图形列表窗口中的"无盖管"位置。为收集组织，必须将导入的图形重新分配至已装载收集管的位置。

7. 利用压力循环技术（PCT）进行蛋白质消化

注意：预计时间：4 小时（不计真空离心干燥时间为 3 小时）。

1. 将装有含LMD采集组织的带盖PCT微型管（内含20 μL 100 mM TEAB/10%乙腈）的0.5 mL离心管放入热循环仪中，99 °C加热30分钟，然后冷却至50 °C并保持10分钟。
2. 在4,000 × g条件下离心30秒，随后将微型管从0.5 mL离心管中取出。使用MicroCap工具取下并弃去PCT微型管上的MicroCaps。按每30 mm²组织加入1 μg的比例加入胰蛋白酶（见材料表），并使用MicroCap工具将MicroPestle插入微型管中。
3. 将微型管转移至巴氏循环仪（barocycler）卡盒中，并组装完整的卡盒。将卡盒放入巴氏循环仪的压力室中并固定盖子。在50 °C条件下，以45,000 psi压力循环50秒，常压循环10秒，共进行60个循环。
4. 巴氏循环完成后，将微型管转移至一个新的0.5 mL微量离心管中，在4,000 × g条件下离心2分钟。
5. 使用帽工具将微型管从0.5 mL微量离心管中取出。用帽工具小心取出研杵，并用20 μL液相色谱-质谱（LC-MS）级水冲洗研杵下半部分，将洗涤液收集至一个洁净的0.5 mL微量离心管中。
6. 轻轻敲击微型管管壁，使液体移至管底，然后将微型管中的全部溶液转移至0.5 mL微量离心管中。
7. 向微型管中加入20 μL LC-MS级水，轻轻敲击管壁。将洗涤液转移至0.5 mL离心管中，并重复此洗涤步骤一次。
8. 使用真空离心浓缩仪将样品干燥至约2 μL，然后加入100 μL 100 mM TEAB（pH 8.0）。
9. 根据制造商说明书，采用比色法测定肽浓度（双辛可宁酸（BCA）法；见材料表）。

8. 串联质谱标签（TMT）标记与 EasyPep 纯化

注意：预计时间：7 小时 20 分钟（若不计算真空离心干燥时间，则为 2 小时 20 分钟）。

1. 打开等压TMT标记试剂前，先将其恢复至室温。向每个TMT小瓶（5 mg）中加入500 μL 100%乙腈，偶尔涡旋混合，孵育10分钟。
2. 将5 μg肽样品溶解于100 μL 100 mM TEAB（pH 8.0）中，加入10 μL指定的TMT试剂。在每组TMT多重样品中构建并加入代表实验中各个独立样品的参考样本池，以促进跨多个TMT多重实验的样品定量⁹。室温下孵育反应1小时，期间偶尔振荡或轻敲。
3. 通过加入10 μL 5%羟胺终止TMT标记反应，室温下继续孵育30分钟，期间偶尔轻敲。终止反应后，将所有TMT标记的样品合并至同一管中，并浓缩至约200 μL。
4. 加入1,800 μL 0.1%甲酸。用pH试纸检测pH值：若pH约为3，再加入1 mL 0.1%甲酸；若pH >3，则加入10–20 μL 5%甲酸直至pH约为3。再加入0.1%甲酸，使最终体积达到3 mL。
5. 取下肽纯化柱底部的标签，打开盖子，并将其置于15 mL锥形管中。将TMT标记的样品转移至柱中，并按照生产商的操作说明进行纯化处理。
6. 使用真空离心浓缩仪将洗脱的肽浓缩至约20 µL，用25 mM碳酸氢铵转移至液相色谱小瓶，最终体积为80 µL，随后进行离线分级分离。

9. TMT 多重样品分馏与混合

注意：预计时间：3 小时 30 分钟（若不计算真空离心干燥时间则为 1 小时 30 分钟）。

1. 通过碱性反相色谱法将TMT标记的肽段多重样品分离为96个组分，采用流动相B（乙腈）在流动相A（10 mM NH₄HCO₃，pH 8.0）中以线性递增梯度（0.69% min^-1）进行洗脱。
2. 通过合并样品孔中的组分生成36个合并后的组分。使用真空离心浓缩仪将各组分干燥至约2 μL，然后重悬于25 mM碳酸氢铵中（最终浓度为1.5 μg/10 μL），在15,000 × g 条件下离心10–15分钟，随后转移至液相色谱小瓶中用于质谱分析。

10. 液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）

注意：所需时间约为：取决于仪器方法和实验设计。

1. 根据制造商的说明/方案校准质谱仪。
2. 配制新鲜的流动相和标准品，并进行适当的液相色谱预运行准备（包括但不限于对所用仪器[参见材料表]执行溶剂冲洗、排除空气和泄漏测试程序）。在开始分析前，对预柱和分析柱以及样品环进行平衡。
3. 在连续进行TMT多重分析之前及之间，使用经质量保证/质量控制（QA/QC）标记的TMT肽段消化物（例如MSPE[参见材料表]、HeLa）验证LC-MS系统是否达到先前设定的性能基准指标。
4. 将自动进样瓶放置在液相自动进样器的正确位置。使用适当的梯度/质谱方法分析各个组分。每天大约进行一次插入式的"清洗"运行，使用肽段标准品（例如肽段保留时间校准标准品[PRTC]），以评估色谱和质谱性能。在完成每组TMT多重样品组分系列分析后，运行QA/QC TMT基准标准品以评估系统性能。
5. 在QA/QC TMT基准标准品分析之后，运行质谱仪评估程序，以评估样品分析后的系统性能，然后按照步骤10.1对系统进行校准，以准备下一组样品的分析。

11. 生物信息学数据分析

注意：所需时间约为：取决于实验设计。

1. 将所有样本数据（例如 .raw 文件）转移至适当的网络存储或计算机驱动器中。
2. 使用合适的数据分析软件（例如 Proteome Discoverer、Mascot），结合适当的参数⁹，针对物种特异性的蛋白质参考数据库对所有组分进行联合搜索，以生成肽段谱图匹配结果（PSMs）并提取 TMT 报告离子信号强度。根据适当的质量控制指标对 PSMs 进行筛选，并将经过归一化、中位数 log₂ 转换后的 TMT 报告离子比率丰度整合为全局蛋白质水平丰度，具体方法如前所述^3,9。
3. 使用选定的差异分析软件比较感兴趣条件下蛋白质的变化情况。

结果

采用本整合的AI驱动组织ROI识别、分割、激光显微切割（LMD）及定量蛋白质组学分析工作流程，对两名高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和两名卵巢透明细胞癌（OCCC）患者的冰冻新鲜组织薄切片进行了分析（图1）。每例肿瘤的代表性苏木精-伊红（H&E）染色组织切片均由经认证的病理学家进行评估，肿瘤细胞含量范围为70%至99%。将组织切片薄切后转移至PEN膜载玻片上（补充文件2），并使用校准标记物进行预切割（补充文件1），从而实现图像分析软件（参见材料表）生成的注释中的位置方向数据与LMD软件中笛卡尔坐标方向的整合。H&E染色后，采集含有组织及校准标记物的PEN载玻片的高分辨率图像（20倍）。

使用图像分析软件（参见材料表）对显微图像中的肿瘤细胞和间质细胞群体进行分割，以便通过激光显微切割（LMD）进行选择性采集，同时采集代表整个组织薄切片的样本（例如，全肿瘤组织）（图1）。对于全肿瘤组织的非特异性注释，通过将整个组织切片划分为500 µm²的图块生成，图块之间保留40 µm的间隙，以维持PEN膜的完整性，并防止LMD过程中膜发生卷曲。在用于组织学解析LMD富集的切片上，图像分析软件（参见材料表）中的AI分类器被训练以区分肿瘤细胞、间质细胞以及空白玻片背景。代表性肿瘤区域、间质区域和空白玻片区域被手动高亮标注，并使用分类器工具在整个组织切片中对这些感兴趣区域（ROI）进行分割。代表全组织、肿瘤上皮和间质的分割图层被分别保存为独立的.annotation文件（补充文件3和补充文件6）。在另一份图像文件副本（不含分区ROI注释）中，从三个基准校准标记物各自最中心的端点处绘制短线，并以与各LMD注释图层文件相同的文件名保存为.annotation文件，文件名后附加后缀“_calib”（补充文件4）。这些短线用于将PEN膜上的校准标记物位置与图像分析软件中绘制的注释形状列表数据进行共定位配准。

本研究提供了两种基于 Python 的算法——“Malleator”和“Dapọ”，以支持该由人工智能驱动的激光显微切割（LMD）工作流程，相关代码可在 https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022 获取。Malleator 算法从成对的 .annotation 文件中提取所有独立标注（组织感兴趣区域及校准标记）的特定笛卡尔坐标，并将这些信息合并为一个可扩展标记语言（XML）导入文件（补充文件 5）。具体而言，Malleator 算法以父文件夹的目录名称作为输入，搜索其所有子文件夹，并为尚未生成 .xml 合并文件的子文件夹生成相应的 .xml 文件。该算法将图像分析软件（见材料表）中的所有标注图层合并为单一图层，并将人工智能生成的形状列表数据（以专有的 .annotation 文件格式保存）转换为与 LMD 软件兼容的 .xml 格式。在合并标注文件与校准标记文件后，由算法生成的 .xml 文件将被保存并导入 LMD 软件中。此时需进行轻微的手动调整，以校准标注的位置，此过程同时也用于确定载玻片在激光显微镜上垂直方向（z 平面）的位置。Dapọ 算法则专门用于 LMD 富集样本的处理。图像分析软件会自动将分割后的图像瓦片分配至不同的标注图层，而 Dapọ 算法在使用分类器（Classifier）工具前，将所有分割的瓦片合并为单一标注图层，从而缩短针对 LMD 富集样本的分类器分析运行时间。

将整个肿瘤组织和LMD富集的组织样本进行消化，用TMT试剂标记，多重混合后离线分级，并进行分析 通过 基于质谱的定量蛋白质组学，如先前所述⁹平均肽段产量为43-60 µg，回收率为0.46-0.59 µg/mm²采用此人工智能驱动工作流程采集的样本，其结果与先前报道相当。^9,10共在所有样本中共同定量了 5,971 种蛋白质（补充表 S1）。使用差异最大的100种蛋白质进行无监督层次聚类分析，结果将高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和卵巢透明细胞癌（OCCC）组织学亚型与激光显微切割富集样本及全肿瘤样本区分开来（图 2A），类似于先前所述的方法¹¹相比之下，来自HGSOC和OCCC的LMD富集的间质样本聚类在一起，并独立于LMD富集的肿瘤样本和全肿瘤样本。在定量的5,971种蛋白质中，215种蛋白质显著改变（LIMMA校正p值 < 0.05）。 < 0.05），即来自HGSOC和OCCC样本的全肿瘤集合之间差异无统计学意义（补充表 S2）。这些改变的蛋白质与Hughes等人鉴定出的用于区分HGSOC和OCCC肿瘤组织的蛋白质进行了比较。¹¹在Hughes等人定量的76种标志蛋白中，本数据集共同定量了其中57种，且两者之间高度相关（Spearman Rho = 0.644，p < 0.001）。 < 0.001) (图2B).

图1：用于下游定量蛋白质组学的激光显微切割自动化组织感兴趣区域选择集成工作流程概要。 在PEN膜载玻片上切割校准标记，以将图像分析软件HALO中由AI生成的组织感兴趣区域（ROI）的位置数据与激光显微切割（LMD）显微镜上的水平位置对齐。Malleator算法用于将一张载玻片所有注释层的标注分割数据与_calib参考文件合并，并将其转换为与LMD软件兼容的.xml文件。经LMD采集用于蛋白质组学分析的组织经消化后，采用高通量定量蛋白质组学方法进行分析，方法如前所述⁹。缩写：LMD = laser microdissection（激光显微切割）；ROI = region of interest（感兴趣区域）；TMT = tandem mass tag（串联质谱标签）；Quant. = quantification（定量）；Ident. = identification（鉴定）；LC-MS/MS = liquid chromatography-tandem mass spectrometry（液相色谱-串联质谱）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2激光显微切割富集样本与全肿瘤样本中蛋白质的分析 (A对高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和卵巢透明细胞癌（OCCC）的激光显微切割富集样本及全肿瘤样本中丰度变异最大的100种蛋白质进行无监督层次聚类分析。B) log 相关性₂ 本研究中HGSOC与OCCC全肿瘤收获物之间蛋白质丰度的倍数变化（Mitchell等.，x轴）以及Hughes等人的一项类似研究. （y轴）¹¹缩写：LMD = 激光显微切割；HGSOC = 高级别浆液性卵巢癌；OCCC = 卵巢透明细胞癌；log₂FC = log₂转化后的蛋白质组丰度。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充表 S1：在 HGSOC 和 OCCC 组织样本的激光显微切割富集样本及全肿瘤样本中共同定量的 5,971 种蛋白质的丰度。 缩写：LMD = laser microdissection；HGSOC = high-grade serous ovarian cancer；OCCC = ovarian clear cell carcinoma。请点击此处下载该表格。

补充表 S2：高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）与卵巢透明细胞癌（OCCC）全肿瘤样本中差异表达的蛋白质（共215种）（LIMMA 调整后 p < 0.05）。 缩写：HGSOC = 高级别浆液性卵巢癌；OCCC = 卵巢透明细胞癌。 请点击此处下载该表格。

补充文件 1：包含四个载玻片位置标准校准标记的代表性形状列表数据（.sld）文件。 该文件可导入 LMD 软件中。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：H 的代表性 .svs 图像文件&E染色的高分辨率（20倍）组织切片。 该文件可使用图像分析软件或LMD软件打开和查看。缩写：H&E = 苏木精和伊红；LMD = 激光显微切割。 请点击此处下载此文件。

补充文件3：分区全肿瘤片段的代表性.annotation文件。 该文件可导入图像分析软件。请点击此处下载该文件。

补充文件4：校准器基准标记段的代表性_calib.annotation文件。 坐标信息表示从每个箭头形基准点引出的短校准线的方向定位。该文件可导入图像分析软件中使用。请点击此处下载该文件。

补充文件 5：Malleator 算法生成的代表性可扩展标记语言（.xml）文件。 该文件可导入激光显微切割软件中。 请点击此处下载该文件。

补充文件6：用于激光显微切割富集样本的AI分类区段的代表性.annotation文件。该文件可导入图像分析软件。缩写：AI = 人工智能；LMD = 激光显微切割。请点击此处下载该文件。

讨论

尽管已有大量研究致力于开发和/或优化从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和/或新鲜冷冻组织中富集目标细胞亚群的工作流程，以及在处理过程中维持样本质量的方法^{9,12,13,14,15}，但仍迫切需要开发自动化策略，以制备用于分子分析的临床组织样本，从而降低变异性和提高可重复性。本工作流程描述了一种标准化的半自动化方案，该方案整合了现有的图像分析软件工具（见材料表），可从临床组织样本中通过激光显微切割（LMD）实现组织学分辨下的特定细胞群体的分离获取。

通过激光显微切割（LMD）对捕获特定细胞群体的感兴趣区域（ROI）进行空间分辨的富集，是多组学分析前的一项新一代组织处理步骤，可提升分子特征的表征与鉴定能力，并促进细胞选择性生物标志物的发现。本方案改进了现有方法，减少了组织切片因由组织学家手动分割ROI而长时间暴露于环境中的情况（在LMD收集前此类操作通常耗时>1–2小时）。该工作流程改由人工智能引导的分类与分割预先确定ROI。缩短组织在环境中的停留时间，将降低对高度不稳定的分子靶标（如磷酸化肽段和mRNA）检测时的非特异性变异，也有利于依赖靶蛋白保持天然构象才能检测的基于抗体的分析技术。

将清晰可见的整齐校准标记切割到PEN膜载玻片上，使其在扫描的载玻片图像中清晰可辨，是实现图像分析软件整合的关键步骤之一（参见 材料表)与LMD工作流程相结合。确保校准品具有精确的（"清洁"）位于底部的点 "V" 形状可用于在图像分析软件中选择一个精确的点，以便从中绘制校准线，具体操作如步骤 5.1.6 和 5.2.13 所述。在导入 LMD 软件时，这些点的对齐对于正确叠加注释至关重要（通过生成兼容的 .xml 文件来实现） "锤子" 和/或 "Dapọ" 算法）应用到物理 LMD 载玻片上相应的组织 ROI 区域。必须突出显示所有形状，并进行整体 "拖放" 即使在导入LMD软件时对齐精确，也需将其固定到位，以记录载玻片在激光显微切割仪上的垂直（z平面）位置。如有需要，此步骤中也可对组织ROI上标注的位置进行微调。

当前版本的 Malleator 算法存在一个局限性，即其与图像分析软件提供的预定义注释形状工具不兼容（参见材料表），尽管未来对该算法的更新版本将致力于改善此兼容性问题。使用这些工具绘制的形状所生成的 .annotation 文件中，每个注释仅包含两组配对的 x 和 y 坐标，缺乏围绕这些点的完整空间方位信息。目前使用这些工具会导致在导入过程中注释被转换为仅由两个点定义的直线。为成功转换为 XML 格式并导入 LMD，必须手动定义组织 ROI 片段。这可以通过针对目标区域使用单独的手绘多边形注释逐一手动定义每个 ROI 来实现；或者，如有需要，也可在整个组织 ROI 片段上应用近似的圆形或矩形注释，这两种方式均适用于本工作流程。

尽管本文展示的工作流程是针对新鲜冷冻的人类癌症组织样本的蛋白质组学分析，但这种由人工智能驱动的激光显微切割（LMD）工作流程同样适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织、非癌性组织类型以及非人类来源的组织。该工作流程还可支持其他下游分子分析流程，包括转录组学、基因组学或磷酸化蛋白质组学分析。此工作流程亦可利用图像分析软件的其他功能（参见材料表），例如细胞计数或其他分析模块，包括"Multiplex IHC"模块或"Tissue Microarray (TMA) Add-on"。未来对该工作流程的应用还可通过预先定义每个感兴趣区域（ROI）片段中的细胞数量，以确保多次采集之间的细胞输入量一致；或通过其他方法定义感兴趣的细胞ROI，例如免疫组织化学或细胞社会学方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1260 Infinity II 系统	安捷伦科技公司		离线液相色谱系统
96个微型胶囊（150 μL）散装	Pressure Biosciences Inc	MC150-96
96个微型研磨杵（散装）	Pressure Biosciences Inc	MP-96
96 根微型管（无管盖），散装	Pressure Biosciences Inc	MT-96
9mm MS 认证透明螺纹套件	Fisher Scientific	03-060-058	用于离线液相色谱分离和质谱分析的样品瓶
乙腈，Optima LC/MS 级	Fisher Chemical	A995-4	流动相溶剂
Aperio AT2	Leica Microsystems	23AT2100	切片扫描仪
Axygen 0.5 mL 平盖 PCR 管	Fisher Scientific	14-222-292	样品管；尺寸适配PCT管和PCR仪
Barocycler 2320EXT	Pressure Biosciences Inc	2320-EXT	Barocycler
BCA 蛋白检测试剂盒	Fisher Scientific	P123225
cOmplete，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11836170001
Easy-nLC 1200	赛默飞世尔科技		液相色谱法
EasyPep Maxi 样品制备试剂盒	赛默飞世尔科技	NCI5734	标记后样品纯化柱
EASY-SPRAY C18 2 μm 50 cm × 75	Fisher Scientific	ES903	分析柱
伊红Y水溶液	Sigma Aldrich	HT110216
甲酸，99+%	赛默飞世尔科技	28905	流动相添加剂
ggplot2 版本 3.3.5	CRAN	https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/
HALO	Indica Labs		图像分析软件
空闲 （集成开发与学习环境）	Python 软件基金会
iheatmapr 版本 0.5.1	CRAN	https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/
iRT 试剂盒	Biognosys	Ki-3002-1	LC-MS 质量控制标准
limma 版本 3.42.2	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html
LMD 扫描台 Ultra LMT350	徕卡显微系统	11888453	配备PCT管架的LMD载物台型号
LMD7（软件版本 8.2.3.7603）	徕卡显微系统		LMD装置（显微镜、激光器、相机、PC、平板电脑）
Mascot Server	矩阵科学		数据分析软件
质谱兼容的人源蛋白提取物与消化	Promega	V6951	LC-MS 质量控制标准
迈耶’苏木精溶液	Sigma Aldrich	MHS32
PEN膜玻片	Leica Microsystems	11532918
多肽保留时间校准混合物	赛默飞世尔科技	88321	LC-MS 质量控制标准
磷酸酶抑制剂混合物2	Sigma Aldrich	P5726
磷酸酶抑制剂混合物3	Sigma Aldrich	P0044
Pierce LTQ Velos ESI 正离子校准溶液	赛默飞世尔科技	88323	仪器校准溶液
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK	Fisher Scientific	164535	柱前
Proteome Discoverer	赛默飞世尔科技	OPTON-31040	数据分析软件
Python	Python 软件基金会
Q Exactive HF-X	赛默飞世尔科技		质谱仪
R 版本 3.6.0	CRAN	https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/
RColorBrewer 版本 1.1-2	CRAN	https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/
可溶性智能消化试剂盒	赛默飞世尔科技	3251711	消化试剂
TMTpro 16重标记试剂盒	赛默飞世尔科技	A44520	等压TMT标记试剂
Veriti 60孔热循环仪	应用生物系统公司	4384638	PCR仪
水，Optima LC/MS 级	Fisher Chemical	W6-4	流动相溶剂
ZORBAX Extend 300 C18，2.1 × 12.5 mm，5 µm，保护柱（ZGC）	安捷伦科技公司	821125-932	离线液相色谱捕获柱
ZORBAX Extend 300 C18，2.1 × 150 mm，3.5 µm	安捷伦科技公司	763750-902	离线液相色谱分析柱