In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

摘要

鸡是一种经济、易得且广泛可用的模式生物，适用于多种研究。本文详细描述了一系列实验方案，旨在揭示禽类内耳发育与再生的分子机制。

摘要

内耳通过耳蜗和前庭感知声音并维持平衡。这一功能依赖于一种特化的机械感觉细胞，即毛细胞。内耳的基础研究已使人们深入理解了毛细胞的功能机制，以及其功能失调如何导致听力丧失和眩晕。在这些研究中，小鼠一直是占主导地位的模式系统。然而，与所有哺乳动物一样，小鼠已丧失了再生毛细胞的能力。因此，在探索恢复内耳功能的细胞治疗策略时，对其他脊椎动物物种开展互补性研究可能提供进一步的见解。鸟类的听觉上皮——基底乳头（basilar papilla, BP），是一层由机械感觉毛细胞（HCs）和支持细胞（SCs）交替排列组成的上皮结构。尽管基底乳头与哺乳动物耳蜗在解剖结构上存在差异，但两者在内耳发育和听觉的分子机制方面具有相似性。这使得基底乳头不仅适用于比较研究，也适用于再生机制的研究。本文描述了鸡内耳的解剖与操作技术，包括基因操作和小分子抑制方法，这些方法为研究内耳发育的分子机制提供了有力工具。我们讨论了在鸡胚内进行in ovo电穿孔的技术，利用CRISPR-Cas9介导的基因删除对基底乳头进行遗传干扰，随后分离基底乳头。此外，我们还展示了基底乳头的器官培养方法以及培养基质的优化使用，以观察上皮和毛细胞的发育过程。

引言

所有脊椎动物的内耳均起源于一种称为耳基板的简单上皮^1,2。耳基板将发育形成内耳中所有结构成分以及转导听觉和平衡感知相关机械感觉信息所必需的各种细胞类型。内耳中的毛细胞（HCs）是一类具纤毛的感觉细胞，周围由支持细胞（SCs）包绕。毛细胞通过第八脑神经的神经元将信息传递至听觉后脑，而这些神经元同样起源于耳基板³。声音的初级转导发生在听觉毛细胞的顶端表面，依赖于一种机械敏感性的纤毛束⁴。该过程由基于肌动蛋白的特化突起——静纤毛介导，静纤毛呈梯度排列，形成阶梯状结构⁵。此外，一种特化的初级纤毛，即动纤毛，参与调控纤毛束的形成，并位于最高一排静纤毛的旁边^6,7,8。静纤毛的结构对其将声能产生的机械刺激转化为电信号至关重要⁹。由于衰老、感染、声学创伤或耳毒性损伤等原因导致的听觉毛细胞损伤，可引起部分或完全性听力丧失，而在哺乳动物中，这种损伤是不可逆的¹⁰。

方案

涉及获取、培养和使用受精鸡卵及未孵化胚胎的实验方案已获得卡纳塔克邦班加罗尔国家生物科学中心机构动物伦理委员会的批准。

1. 在卵内 鸡听觉前体细胞的电穿孔

1. CRISPR/Cas9 基因敲除的 sgRNA 设计与克隆
   1. 为实现基因敲除，设计引导 RNA 以破坏基因的外显子区域，优先选择靠近编码区 5' 端的位置。
   2. 使用网络工具 CRISPOR²³ 筛选潜在的引导 RNA。将浏览器数据设置为 Gallus gallus ，并将原间隔序列邻近基序（PAM）序列设为 5'- NGG -3'。该程序根据输入序列确定引导 RNA，并基于靶上和脱靶活性赋予不同评分。选择评分最高的前四个引导序列用于后续研究。
   3. 为设计用于引导（g）RNA 合成的特异性模板寡核苷酸，需从 gRNA 设计工具的输出结果中去除 PAM 序列（5′- NGG -3′）。该序列在靶向过程中不需要，但包含 Cas9 切割识别序列。为每个潜在 gRNA 合成两条在两端均含有 BsmBI 限制性酶切位点的 HPLC 纯化的互补寡核苷酸。
   4. 将引导序列克隆至所选载体（此处使用 pcU6_1sgRNA 载体²⁴）的 tracrRNA 支架中，保持阅读框一致。....

结果

在电穿孔实验装置中，电极的位置可能影响转染区域。正极置于卵黄下方，负极置于胚胎上方（图1A）。这导致内耳大部分区域以及两个前庭器官（图1B）和听觉基底乳头（图1C，D）中绿色荧光蛋白（GFP）表达增强，证实实现了转染。

在评估CRISPR敲低后的表型时，我们设计了针对毛细胞转录因子Atonal同源物1（Atoh1）的向导RNA。Atoh1基因突变的小鼠无法形成毛细胞³²；在将Atoh1向导RNA电转染入样本并培养至E10后，我们发现与对照组（空质粒对照）相比，毛细胞的发育受到显著抑制（图2）。尽管电转染呈嵌合分布（图2E、F），但对照组中被电转染的细胞仍能正常发育为毛细胞。.......

讨论

鸡是一种经济且便捷的模式生物，可用于实验室研究内耳。本文所述方法在我们的实验室中常规使用，并可补充正在进行的哺乳动物内耳研究。In ovo 电穿孔技术用于将基因操作引入鸡的基因组。电穿孔还可用于导入编码靶向特定细胞器或亚细胞结构的荧光蛋白的载体^35,36。尽管该操作较为简单，但在 in ovo 条件下对胚胎的操作确实会影响其存活率。为了实现高效的电穿孔，应获取新鲜的鸡蛋（产下后尽快使用）。储存超过5天的鸡蛋常出现死亡率升高和/或发育异常的情况。采用无菌操作技术、确保蛋壳妥善封闭以防止水分流失，并尽量减少对胚胎的操作，均可提高胚胎存活率。

我们发现，在E3.5至E4阶段靶向耳囊可减少胚胎所受的创伤，而使用精确定位的电极能够有效靶向BP的感觉前体细胞。然而，到这一阶段，听觉-前庭神经节的前体细胞已从内耳迁移出去^37,38

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22287
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3	Integrated DNA Technologies	1081061	高保真 Cas9 蛋白
Anti-GFP 抗体	Abcam	ab290	兔多克隆抗 GFP 抗体
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647
二水合氯化钙	Thermo Fisher Scientific	Q12135
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源	Thermo Fisher Scientific	A1048301
Leica EM CPD300 临界点干燥仪	Leica
CUY-21 电穿孔仪	Nepagene
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
DM5000B 宽场显微镜	Leica
DMEM，高糖，含 GlutaMAX 添加剂和丙酮酸钠	Thermo Fisher Scientific	10569010
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-20
Dumont #55 镊子	Fine Science Tools	11255-20
快绿 FCF	Sigma-Aldrich	F7252
Fluoroshield	Sigma-Aldrich	F6182
Olympus FLUOVIEW 3000 激光扫描显微镜	Olympus
戊二醛 (25 %)	Sigma-Aldrich	340855
山羊抗小鼠 IgG 二抗，Alexa Fluor 488 标记	Thermo Fisher Scientific	A-11001
山羊抗小鼠 IgG 二抗，Alexa Fluor 594 标记	Thermo Fisher Scientific	A-11032
山羊抗兔 IgG 二抗，Alexa Fluor 488 标记	Thermo Fisher Scientific	A-11008
无菌过滤山羊血清	HiMedia	RM10701	经热灭活处理
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	14025092
LSM980 Airyscan 显微镜	Zeiss
Millicell 细胞培养小室，30 mm，亲水性 PTFE，0.4 µm	Sigma-Aldrich	PICM03050
MVX10 体视显微镜	Olympus
MYO7A 抗体	DSHB	138-1	小鼠单克隆抗非常规肌球蛋白-VIIa 抗体
MZ16 解剖显微镜	Leica
N-2 补充剂 (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502048
Noyes 剪刀，14 cm (5.5'')	World Precision Instruments	501237
四氧化锇 (4%)	Sigma-Aldrich	75632
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
PC-10 拉针仪	Narishige
pcU6_1sgRNA	Addgene	92395	带有修饰型鸡 U6 启动子的微型载体
青霉素 G 钠盐	Sigma-Aldrich	P3032
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36934
SMZ1500 解剖显微镜	Nikon
0.2 M 二甲胂酸钠缓冲液	Electron Microscopy Sciences	11652
氯化钠	HiMedia	GRM853
K550X 溅射镀膜仪	Emitech
标准玻璃毛细管，3 英寸，外径 1.0 mm，无纤维丝	World Precision Instruments	1B100-3
蔗糖	Sigma-Aldrich	84097
ZEISS MERLIN Compact VP	Zeiss
硫代碳酰肼	Alfa Aesar	L01205
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379