方法文章

一种钙磷酸盐诱导的小鼠腹主动脉瘤模型

DOI：

10.3791/64173

⸱

2022年11月18日

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1Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences; Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Science, Ministry of Education, Peking University, 2Department of Vascular and Endovascular Surgery, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种通过磷酸钙诱导的腹主动脉瘤（AAA）小鼠模型，用于研究腹主动脉瘤的病理特征和分子机制。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腹主动脉瘤（AAA）是一种全球范围内发生的危及生命的心血管疾病，其特征为腹主动脉不可逆性扩张。目前已有多种化学诱导的小鼠AAA模型，每种模型可模拟AAA发病机制的不同方面。与血管紧张素II诱导和弹性蛋白酶诱导的AAA模型相比，磷酸钙诱导的AAA模型具有快速且经济高效的优势。CaPO的应用4 晶体注入小鼠主动脉可导致弹性纤维降解、平滑肌细胞丢失、炎症反应以及钙沉积，这些变化与主动脉扩张相关。本文介绍了一种用于CaPO的标准实验方案4诱导的AAA模型。该方案包括材料准备、CaPO的手术应用4 至肾下腹主动脉的外膜，主动脉的取材以观察腹主动脉瘤，以及小鼠的组织学分析。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腹主动脉瘤（AAA）是一种致命的心血管疾病，其特征是腹主动脉永久性扩张，一旦发生破裂，死亡率极高。AAA 与衰老、吸烟、男性性别、高血压和高脂血症相关1。研究表明，多种病理过程参与了 AAA 的形成，包括细胞外基质纤维的蛋白水解、免疫细胞浸润以及血管平滑肌细胞的丢失。目前，AAA 的病理机制尚不明确，且尚无经证实可用于治疗 AAA 的药物1。由于人类主动脉样本稀少，对人类 AAA 的研究受到限制；因此，已建立并广泛采用多种化学诱导的动物 AAA 模型，包括皮下输注血管紧张素 II（AngII）、外膜或管腔内孵育弹性蛋白酶，以及外膜应用磷酸钙2。其中一种常用的小鼠模型是在肾下腹主动脉外膜施加磷酸钙（CaPO4），该方法成本较低，且无需进行基因改造。

Gertz 等人首次报道了将 CaCl2 直接应用于兔颈动脉周围以诱导动脉瘤样改变的方法3，随后该方法被应用于小鼠腹主动脉。Yamanouchi 等人进一步开发了利用 CaPO4 晶体诱导小鼠主动脉扩张的模型4。CaPO4 在小鼠主动脉中的沉积可重现人类腹主动脉瘤（AAA）的多种病理特征，包括显著的巨噬细胞浸润、细胞外基质降解以及钙盐沉积。人类 AAA 的危险因素（如高脂血症）也可加重小鼠中 CaPO4 诱导的 AAA5。与在 ApoE-/- 或 LDLR-/- 小鼠中通过 AngII 灌注诱导的 AAA 相比，CaPO4 诱导的 AAA 发生于肾下腹主动脉区域，更接近人类 AAA 的发生部位。目前，该方法已广泛用于评估基因修饰小鼠对 AAA 形成的易感性，并评价药物对 AAA 的抑制作用6,7。

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方案

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动物实验遵循北京大学医学部动物实验伦理委员会的指导原则，并经北京大学生物医学伦理委员会批准（批准号：LA2015142）。所有接受手术的小鼠均使用异氟烷（1.5%-2%）进行麻醉，并密切监测麻醉状态，以避免小鼠产生疼痛或不适。

1. 准备

  1. 将无粉橡胶手套和纱布剪成0.3 cm宽的条状。
  2. 购买8至10周龄的C57BL/6J雄性小鼠。将动物饲养在具有12小时光照-黑暗循环的空调环境中，并可自由获取食物和水。
  3. 手术前对纱布、棉签、剪刀和镊子进行高压灭菌。
  4. 准备聚维酮碘、70%乙醇和抗菌洗手液。
  5. 戴上口罩、手术服和无菌手套。

2. 手术步骤

  1. 手术前 2-4 小时，给 8-10 周龄的 C57BL/6J 小鼠喂食可咀嚼的卡洛芬片剂（剂量为 5 mg/kg）。然后将小鼠放入诱导室（206 mm × 210 mm × 140 mm）中，使用异氟烷，气体流速为 1.5%-2%。
    1. 监测小鼠约 5 分钟，直至呼吸明显减慢。确保小鼠对疼痛刺激无反应后，再进行手术。
  2. 在小鼠眼睛上涂抹眼用软膏，并使用加热垫或保温毯提供热支持。在手术过程中，每 15 分钟通过脚趾夹捏法确认麻醉深度。
  3. 使用电动剪刀或脱毛膏去除小鼠腹部的毛发。用聚维酮碘以环形方式多次擦拭剃毛区域，随后用 70% 乙醇重复擦拭数次。更换手套以维持无菌状态。
  4. 使用剪刀沿腹部中线在下腹部做一条约 1.5 cm 的切口。
  5. 用浸有生理盐水的无菌棉签小心移开肠管，直至露出肾下腹主动脉。
  6. 剥离肾下腹主动脉周围约 0.5 cm 长度的结缔组织和脂肪组织。注意背侧的小血管，避免撕裂。无需将腹主动脉与腹主静脉分离。
  7. 将一条浸有生理盐水的乳胶手套条片垫于腹主动脉和腹主静脉下方。用棉签擦去多余液体。
  8. 将一块浸有 0.5 M CaCl2 的纱布覆盖于肾下腹血管外膜，持续 10 分钟。对于假手术组小鼠，将 0.5 M CaCl2 替换为生理盐水。
  9. 移除纱布，再用另一块浸有 PBS 溶液的纱布覆盖 5 分钟，以在腹主动脉外膜原位生成 CaPO4 晶体 in situ。
  10. 小心移除乳胶手套条片和纱布，复位小鼠的肠道。
  11. 使用 5-0 缝线缝合腹部切口及皮肤。
  12. 将小鼠置于加热垫上，直至其恢复意识。根据当地动物伦理委员会的规定，提供术后镇痛护理和镇痛治疗。
  13. 继续饲养小鼠 14 天。术后密切观察小鼠，此后每天至少观察一次。若在此期间有小鼠死亡，应立即进行尸体解剖。

3. 主动脉成像的收获

  1. 术后14天，使用CO2处死小鼠。
  2. 从腹侧切开小鼠胸腔和腹腔，并剪开右心房。
  3. 通过左心室灌注PBS缓冲液以清除主动脉中的血液，随后按照先前描述的方法灌注4%多聚甲醛8。
  4. 在体视显微镜下分离主动脉。
  5. 将分离的主动脉置于含有5 mL 4%多聚甲醛的离心管中固定48小时。
  6. 在体视显微镜下小心去除主动脉外膜组织和脂肪，并用昆虫针将其固定在黑色石蜡板上。
  7. 获取主动脉图像。

4. 弹性纤维降解的评估

  1. 将主动脉瘤组织切成连续的冷冻切片（7 µm 厚）。
  2. 根据制造商说明书，使用商用弹性纤维 van Gieson（EVG）染色试剂盒分析弹性纤维。
  3. 对弹性蛋白降解程度进行分级：1级：<25% 降解；2级：25% 至 50% 降解；3级：50% 至 75% 降解；或 4级：>75% 降解。

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结果

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在应用 CaPO4 后的第14天，处死 C57BL/6J 雄性小鼠并取其主动脉组织进行清理。通过成像观察主动脉的形态以评估腹主动脉瘤（AAA）的形成情况。如图1A-B所示，应用 CaPO4 导致肾下腹主动脉扩张。组织学分析显示，CaPO4 引起弹性纤维显著降解，表现为弹性蛋白断裂（图1C）。

磷酸钙效应、显微组织学及动脉比较；生物学分析。
图1：8...

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讨论

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在小鼠中采用磷酸钙（CaPO4）进行腹主动脉周围应用是一种诱导腹主动脉瘤（AAA）的可靠方法。已有多个研究使用了CaPO4模型，并一致报道该方法是一种快速且可重复的小鼠AAA研究手段7,9。该模型被认为能够部分模拟人类主动脉瘤的特征，并有助于揭示AAA发病机制中的关键过程，包括炎症反应和细胞外基质降解。

人类腹主动脉瘤（AAA）的主要危险因素包括衰老、男性性别、吸烟、高脂血症、高血压和动脉粥样硬化10。尽管尚未系统研究，但在使用CaPO4模型时，也发现高脂血症可使小鼠更易发生AAA扩张。与人类不同，在小鼠CaPO4模型中，衰老在AAA形成过程中仅起次要作用5。既往大规模流行病学研究显示，糖尿病是人类AAA的一个独立的负性危险因素11。虽然...

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致谢

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本研究由国家自然科学基金委员会（NSFC, 81730010, 91839302, 81921001, 31930056, 和 91529203）及国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2019YFA0801600）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CaCl2MECKLINC805225
NaClBiomedSH5001-01
PBSHARVEYBIOMB5051
小型动物呼吸机RWDH1550501-012

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kent, K. C. Abdominal aortic aneurysms. The New England Journal of Medicine. 371, 2101-2108 (2014).
  2. Patelis, N., et al. Animal models in the research of abdominal aortic aneurysms development. Physiological Research. 66 (6), 899-915 (2017).
  3. Gertz, S. D., Kurgan, A., Eisenberg, D. Aneurysm of the rabbit common carotid artery induced by periarterial application of calcium-chloride in vivo. Journal of Clinical Investigation. 81 (3), 649-656 (1988).
  4. Yamanouchi, D., et al. Accelerated aneurysmal dilation associated with apoptosis and inflammation in a newly developed calcium phosphate rodent abdominal aortic aneurysm model. Journal of Vascular Surgery. 56 (2), 455-461 (2012).
  5. Wang, Y. T., et al. Influence of apolipoprotein E, age and aortic site on calcium phosphate induced abdominal aortic aneurysm in mice. Atherosclerosis. 235 (1), 204-212 (2014).
  6. Zhao, G., et al. Unspliced xbp1 confers VSMC homeostasis and prevents aortic aneurysm formation via foxo4 interaction. Circulation Research. 121 (12), 1331-1345 (2017).
  7. Jia, Y., et al. Targeting macrophage TFEB-14-3-3 epsilon interface by naringenin inhibits abdominal aortic aneurysm. Cell Discovery. 8 (1), 21(2022).
  8. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
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