小型猪（迷你猪）是研究人工耳蜗植入的理想大型动物模型。在小型猪中进行人工耳蜗植入手术，可用于在与人类相似的活体系统中，初步验证新型电极阵列和手术方法的安全性及潜在性能。
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摘要
摘要
人工耳蜗（CI）是治疗重度至极重度感音神经性听力损失患者最有效的方法。尽管人工耳蜗已在全球范围内广泛应用，但目前尚无统一的标准模型用于研究接受人工耳蜗植入的患者或动物模型的电生理学和组织病理学特征，也无法用于评估新型电极阵列的设计。具有与人类耳蜗特征相似的大动物模型，可在新型或改进型电极阵列应用于人体之前，为其提供一个有效的研究与评估平台。
为此，我们采用巴马小型猪建立了标准的人工耳蜗植入方法，其内耳解剖结构与人类高度相似。将专为人类设计的电极阵列通过圆窗膜植入小型猪的耳蜗，并采用与人类人工耳蜗植入受试者相似的手术入路。电极阵列植入后，进行诱发复合动作电位（ECAP）测量，以评估听觉神经功能。本研究描述了动物准备、手术步骤、电极阵列植入以及术中电生理测量的全过程。
结果表明，用于人类的相同人工耳蜗可通过标准化手术方法轻松植入小型猪体内，并且其电生理学结果与人类人工耳蜗受试者所测得的结果相似。小型猪可能是一种有价值的动物模型，可在将新型电极阵列和手术方法应用于人类之前，提供有关其安全性和潜在性能的初步证据。
引言
根据世界卫生组织（WHO）的数据，全球有超过10亿人面临听力损失的风险，预计到2050年，每四人中就有一人将患有听力损失1。在过去20年中，人工耳蜗（CI）已成为治疗永久性重度和极重度感音神经性听力损失（SNHL）最有效的干预手段。人工耳蜗可将声音的物理信号转化为生物电信号，刺激螺旋神经节神经元（SGNs），从而绕过毛细胞。随着时间推移，人工耳蜗的适应证已逐步扩大，现已包括具有残余听力、单侧听力损失以及年龄极小或极大的人群2,3,4。同时，全植入式人工耳蜗和先进电极阵列也已得到开发5。然而，目前尚无经济可行的大型动物模型用于研究人工耳蜗植入后内耳的电生理学和组织病理学变化。这种大型动物模型的缺乏限制了旨在改进人工耳蜗技术以及深入了解人工耳蜗对内耳电生理影响的相关研究。
在人工耳蜗（CI）研究中已应用了多种啮齿类动物模型，如小鼠6、沙鼠7、大鼠8和豚鼠9；然而，这些动物在形态学和电生理反应方面的特征与人类存在差异。传统上用于CI研究的动物模型（如猫、豚鼠及其他动物）的耳蜗结构与人类耳蜗结构差异显著10。尽管已在猫11和兔12身上实施过电极阵列植入，但由于其耳蜗较小，所使用的阵列并非为人类设计。此外，也已探索了一些大型动物作为CI研究的模型。羔羊是无创性人工耳蜗植入训练的理想模型，但因其耳蜗尺寸较小，无法实现完整阵列的植入13。由于解剖结构与人类高度相似，灵长类动物可能是最适合用于CI研究的动物14,15；然而，猴子性成熟较晚（4–5年），妊娠期长达约165天，每只雌性通常每年仅产一胎16。加之成本高昂，这些因素限制了灵长类动物在CI研究中的广泛应用。
相比之下，猪在5至8个月时达到性成熟，妊娠期约为114天，因此作为大型动物模型，猪在人工耳蜗（CI）研究中更具可及性16。巴马香猪（迷你猪）起源于1985年中国的一种小型猪种，其遗传背景已得到充分研究。该猪种具有天生体型小、性成熟早、繁殖快以及易于管理等特点17。由于在形态学和电生理学方面与人类高度相似，迷你猪是耳科学和听力学研究的理想模型18。巴马迷你猪的鼓阶长度为38.58 mm，接近人类的36 mm10。迷你猪耳蜗有3.5圈，与人类的2.5至3圈相近10。除了形态学相似外，巴马迷你猪的电生理特性也与人类高度相似18。因此，在本研究中，我们通过圆窗膜将专为人类设计的电极阵列插入迷你猪耳蜗，并采用与人类人工耳蜗植入患者相似的手术方法。术中采用ECAP测量以评估手术效果。本文所述方法既可用于与人工耳蜗相关的临床前转化研究，也可作为住院医师培训的平台。
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方案
所有实验操作和动物手术均按照中国人民解放军总医院伦理委员会的指南进行，并已获得批准。
1. 麻醉与手术准备
- 对猪（雄性，2月龄，5 kg）进行肌肉注射替来他明-唑拉西泮（tiletamine和zolazepam），剂量为10–15 mg/kg，并使用5.5-French气管导管进行气管插管。通过呼吸机辅助通气并吸入异氟烷维持麻醉。监测血氧饱和度（>90%）、呼吸（15-20次/分钟）和心率（60-120次/分钟），使用连接至猪舌头的ECG监护仪的脉搏血氧仪夹。
- 将迷你猪置于左侧卧位（当需植入右侧时） 一个温控加热垫以防止 低体温。通过多种刺激确认猪已充分麻醉，确保所有反应均消失（例如，脚趾夹捏） 反射）。将人工泪液软膏涂抹于小型猪的眼部，以防止角膜干燥。使用医用敷料保持眼睛闭合。
- 剃除耳垂周围直径10 cm范围内的手术区域毛发 (图1）并进行消毒 用三根交替的碘棉签擦拭 以圆形方式从中心向外周擦拭酒精。用无菌手术巾覆盖手术区域。
- 用无菌塑料套覆盖显微镜，并取下目镜和物镜上的遮盖物。
2. 手术步骤
- 在耳垂水平，于耳后沟后方1 cm处定位耳蜗的表面投影位置。以该投影点为中心，使用#15手术刀做一条长约5 cm的耳后切口。用显微剪刀逐层分离皮下组织、腮腺及胸锁乳突肌，暴露乳突骨表面（图2A）。必要时使用双极电凝以减少出血。
- 乳突皮质切除术
- 在乳突骨上耳蜗的表面投影区域（图2B）进行钻骨，直至外耳道（EAC），该区域骨质致密且呈淡蓝色（图2C）。操作时需小心，避免损伤位于EAC背侧的淡色或微红色面神经垂直段，以防出血（图2C）。
注：若面神经受损，可使用双极电凝有效止血。
- 在乳突骨上耳蜗的表面投影区域（图2B）进行钻骨，直至外耳道（EAC），该区域骨质致密且呈淡蓝色（图2C）。操作时需小心，避免损伤位于EAC背侧的淡色或微红色面神经垂直段，以防出血（图2C）。
- 通过磨除外耳道后方骨性EAC周围的骨质，暴露鼓室（图2D）。使用皮下注射针头分离EAC皮肤与面神经，避免损伤面神经。小心地将EAC皮肤推向前方，以暴露鼓室（包括听骨链）及圆窗龛（图3A）。
- 暴露圆窗膜。使用小型金刚砂钻头去除圆窗龛结构，并持续进行吸引-冲洗，以暴露耳蜗基回及圆窗膜（图3B）。
- 固定接收器包。分离颅顶肌，形成一个刚好可容纳接收器的肌下囊袋。将内部接收器包置入肌下囊袋中，并用固定缝线加以固定。
- 插入电极阵列。使用锐利的显微外科刀切开圆窗膜，随后用显微镊子将连接于已固定于肌下囊袋中接收器的电极阵列，缓慢、稳定且连续地沿耳蜗蜗轴方向插入（图3C）。使用可吸收 缝线2-0号缝合手术切口。
- ECAP测量
注：测量系统由一台安装MAESTRO软件的计算机组成，通过刺激装置（MAX编程接口）和人工耳蜗线圈与受试者的人工耳蜗（CI）连接。- 通过皮肤将CI线圈磁性连接至CI接收器。使用MAESTRO软件自动执行CI遥测功能，确认CI完整性，并在ECAP测量前检测所有通道的电极阻抗（图4A，B）。
- 按照先前描述的方法进行ECAP测量19。选择ECAP模块，设定全部12个电极为刺激电极，等待各电极的ECAP测试完成。有关测量ECAP反应所用的软件和刺激装置，请参见材料表。采用双相脉冲刺激，每相持续时间为30 µs，使用交替极性范式，平均叠加25次，刺激频率为45.1脉冲/秒，对全部12个电极进行ECAP测量。
3. 术后护理
- 持续监测迷你猪，防止其因无意识活动而受伤，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。将 将小型猪置于恒温调节的加热垫上以防止 低体温
- 将迷你猪单独放回其居住笼中。
- 注射抗生素以预防术后感染，持续7天。
- 检查小型猪是否出现前庭损伤症状，例如眼球震颤、转圈或翻滚。
4. 术后CT扫描
- 以 3% 戊巴比妥钠 1 ml/kg 和萝卜硫素 0.1 ml/kg 对小型猪进行肌肉注射以诱导麻醉。使用 37℃加热板维持体温。注射后 3 至 5 分钟 后，可进行 CT 扫描 。
- 为确认电极阵列的正确位置，术后 1 周使用替来他明和唑拉西泮对小型猪进行麻醉。使用 3D Slicer 图像计算平台（见材料表）进行 CT 扫描及三维重建20。导入 CT 的 DICOM 数据，并运行容积渲染模块以获得人工耳蜗植入体（CI）的三维图像。
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结果
通过 MAESTRO 软件确认了人工耳蜗植入体的完整性（图 4A）和阻抗（图 4B）。ECAP 结果显示，全部 12 个电极均表现出良好的神经反应（图 4C），表明电极阵列与耳蜗轴贴合良好，并有效刺激了听觉神经。图 5 展示了右侧耳蜗术后三维重建的电极线圈。电极阵列未发生折叠或移位。电极阵列盘绕于耳蜗的基底转（图 5A），电极以绿色呈现（图 5B）。三维重建结果显示，电极阵列在耳蜗内呈螺旋形盘绕（图 5C）。
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讨论
全球约有15%的人口存在不同程度的听力损失，其中超过5%为重度听力损失21。对于患有重度至极重度感音神经性听力损失的成人和儿童患者，人工耳蜗植入（CI）是目前最有效的治疗方法。作为首个成功应用于临床的可植入颅神经刺激器，在过去20多年中，人工耳蜗已使数千名听力障碍者重新进入声音世界，并得以（重新）融入主流社会。尽管如今的人工耳蜗在外观和功能上已与最初版本大相径庭，但目前人工耳蜗研究仍缺乏一种与人类相近的大型动物模型。一种经济且易于获取的大型动物模型将提供重要的电生理学和组织病理学信息，而这些信息直接从人体获取既困难又不符合伦理要求。
目前，多种基于人工耳蜗（CI）的生物电治疗手段正在被研究。Guo 等人22发现，通过人工耳蜗进行电-声刺激可促进神经干细胞增殖并分化为神经元。此外，多种因子如生长激素23、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）24和脑源性神经营养因子（BDNF）
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（编号：81970890）和重庆市科研机构绩效激励项目（编号：19540）资助。我们感谢MED-EL公司的Anandhan Dhanasingh和Zhi Shu提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mm 钻石磨头 | |||
| 1 mm 钻石磨头 | |||
| 5 mm 钻石磨头 | |||
| 2-0 丝线缝合线 | |||
| 3D Slicer 图像计算平台 | CT 图像三维重建 | ||
| 酒精 | |||
| 双极电凝器 | |||
| 双极电凝 | 止血 | ||
| 用于人体的听觉脑干植入体（CONCERTO FLEX28） | MED-EL | Concerto F28 | |
| 敷料钳 | |||
| 心电监护仪 | |||
| 碘酊 | |||
| 异氟烷 | 3.6 mL/h | ||
| 喉镜 | |||
| MAESTRO 软件 | MED-EL | 测量 ECAP 反应 | |
| 显微镊 | |||
| 微型刮匙 | |||
| 蚊式钳 | |||
| 持针器 | |||
| 探针 | |||
| 负压吸引装置 | |||
| 耳科手术器械 | |||
| 呼吸麻醉机 | |||
| 15 号刀片手术刀 | |||
| 剪刀 | |||
| 磨钻 | |||
| 刺激设备（MAX 编程接口） | MED-EL | 测量 ECAP 反应 | |
| 手术显微镜 | Leica | ||
| 手术电钻 | |||
| 外科动力装置 | |||
| 替来他明与唑拉西泮 | 10–15 mg/kg | ||
| 组织钳 | |||
| 气管插管 |
参考文献
- World Health Organization. World report on hearing. World Health Organization. , Geneva, Switzerland. Available from: https://www.who.int/publications/i/item/world-report-on-hearing (2021).
- Lee, S. Y., et al. Natural course of residual hearing preservation with a slim, modiolar cochlear implant electrode array. American Journal of Otolaryngology. 43 (2), 103382(2022).
- Lorens, A., et al. Binaural advantages in using a cochlear implant for adults with profound unilateral hearing loss. Acta Oto-Laryngologica. 139 (2), 153-161 (2019).
- Lally, J. W., Adams, J. K., Wilkerson, B. J. The use of cochlear implantation in the elderly. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 27 (5), 387-391 (2019).
- Rhodes, R. M., Tsai Do, B. S. Future of implantable auditory devices. Otolaryngologic Clinics of North America. 52 (2), 363-378 (2019).
- Colesa, D. J., et al. Development of a chronically-implanted mouse model for studies of cochlear health and implant function. Hearing Research. 404, 108216(2021).
- Toulemonde, P., et al. Evaluation of the efficacy of dexamethasone-eluting electrode array on the post-implant cochlear fibrotic reaction by three-dimensional immunofluorescence analysis in Mongolian gerbil cochlea. Journal of Clinic Medicine. 10 (15), 3315(2021).
- King, J., Shehu, I., Roland, J. T., Svirsky, M. A., Froemke, R. C. A physiological and behavioral system for hearing restoration with cochlear implants. Journal of Neurophysiology. 116 (2), 844-858 (2016).
- Chen, M., Min, S., Zhang, C., Hu, X., Li, S. Using extracochlear multichannel electrical stimulation to relieve tinnitus and reverse tinnitus-related auditory-somatosensory plasticity in the cochlear nucleus. Neuromodulation. , (2021).
- Yi, H., et al. Miniature pigs: A large animal model of cochlear implantation. American Journal of Translational Research. 8 (12), 5494-5502 (2016).
- Vollmer, M., Beitel, R. E., Schreiner, C. E., Leake, P. A. Passive stimulation and behavioral training differentially transform temporal processing in the inferior colliculus and primary auditory cortex. Journal of Neurophysiology. 117 (1), 47-64 (2017).
- Sunwoo, W., Delgutte, B., Chung, Y. Chronic bilateral cochlear implant stimulation partially restores neural binaural sensitivity in neonatally-deaf rabbits. The Journal of Neuroscience. 41 (16), 3651-3664 (2021).
- Mantokoudis, G., et al. Lamb temporal bone as a surgical training model of round window cochlear implant electrode insertion. Otology & Neurotology. 37 (1), 52-56 (2016).
- de Abajo, J., et al. Effects of implantation and reimplantation of cochlear implant electrodes in an in vivo animal experimental model (Macaca fascicularis). Ear and Hearing. 38 (1), 57-68 (2017).
- Johnson, L. A., Della Santina, C. C., Wang, X. Temporal bone characterization and cochlear implant feasibility in the common marmoset (Callithrix jacchus). Hearing Research. 290 (1-2), 37-44 (2012).
- Yin, P., Li, S., Li, X. J., Yang, W. New pathogenic insights from large animal models of neurodegenerative diseases. Protein & Cell. , (2022).
- Yu, S. M., Wang, C. W., Zhao, D. M., Zhang, Q. C., Pei, D. Z. Raising and pathogen purification of Chinese experimental mini-pig. Laboratory Animal Science and Administration. 20, 44-46 (2003).
- Guo, W., et al. The morphology and electrophysiology of the cochlea of the miniature pig. The Anatomical Record. 298 (3), 494-500 (2015).
- Christov, F., et al. Electric compound action potentials (ECAPs) and impedances in an open and closed operative site during cochlear implantation. Cochlear Implants International. 20 (1), 23-30 (2019).
- Zhong, L. L., et al. Inner ear structure of miniature pigs measured by multi-planar reconstruction techniques. American Journal of Translational Research. 10 (3), 709-717 (2018).
- The Lancet. Hearing loss: An important global health concern. The Lancet. 387 (10036), 2351(2016).
- Guo, R., et al. Cochlear implant-based electric-acoustic stimulation modulates neural stem cell-derived neural regeneration. Journal of Materials Chemistry B. 9 (37), 7793-7804 (2021).
- Gabrielpillai, J., Geissler, C., Stock, B., Stöver, T., Diensthuber, M. Growth hormone promotes neurite growth of spiral ganglion neurons. Neuroreport. 29 (8), 637-642 (2018).
- Li, H., et al. Guided growth of auditory neurons: Bioactive particles towards gapless neural - electrode interface. Biomaterials. 122, 1-9 (2017).
- Wille, I., et al. Development of neuronal guidance fibers for stimulating electrodes: Basic construction and delivery of a growth factor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 776890(2022).
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