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方法文章

食蟹猴视网膜器官型外植体培养

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DOI：

10.3791/64178

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2022年8月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Yunnan Eye Institute & Key Laboratory of Yunnan Province, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center, Affiliated Hospital of Yunnan University, Yunnan University, 2Institute for Ophthalmic Research, Eberhard-Karls-Universität Tübingen

本文内容

摘要

从野生型猕猴获得的视网膜外植体进行培养 体外使用PDE6抑制剂扎普利那特（zaprinast）诱导视网膜变性及cGMP-PKG信号通路。通过免疫荧光法验证不同扎普利那特浓度下外植体中cGMP的累积情况。

摘要

遗传性视网膜变性（RD）的特征是感光细胞进行性死亡。在感光细胞中，环磷酸鸟苷（cGMP）依赖性蛋白激酶（PKG）通路的过度激活会导致感光细胞死亡，尤其是在携带磷酸二酯酶6b（PDE6b）突变的模型中。以往关于RD的研究主要使用小鼠模型，如rd1或rd10小鼠。鉴于小鼠与人类之间存在遗传和生理差异，明确灵长类动物与啮齿类动物视网膜的可比性程度具有重要意义。猕猴与人类在遗传上具有高度相似性。因此，本研究选取野生型猕猴（年龄1-3岁），用于包含视网膜-视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜复合体的视网膜外植体的体外培养。这些外植体经不同浓度的PDE6抑制剂扎普司特（zaprinast）处理，以激活cGMP-PKG信号通路并模拟RD的发病过程。随后通过免疫荧光染色和TUNEL检测验证灵长类视网膜外植体中cGMP的累积及细胞死亡情况。本研究建立的灵长类视网膜模型可用于cGMP-PKG依赖性RD机制的相关且有效的研究，并为未来治疗策略的开发提供平台。

引言

遗传性视网膜变性（RD）的特征是感光细胞进行性死亡，由多种致病基因突变引起1。RD的最终结果是视力丧失，在绝大多数情况下，该疾病至今仍无法治疗。因此，利用能够真实模拟人类疾病状态的模型来研究导致感光细胞死亡的细胞机制显得尤为重要。在此方面，基于灵长类动物的模型因其与人类的高度相似性而具有特殊意义。值得注意的是，此类模型可能推动开发出有效的治疗干预措施，从而阻止或延缓感光细胞的死亡。

既往关于视网膜变性（RD）中细胞死亡机制的研究表明，由引发RD的基因突变导致的磷酸二酯酶6（PDE6）活性降低或丧失，会引起环磷酸鸟苷（cGMP）水解减少2,3。cGMP是视杆细胞外段（ROSs）中环核苷酸门控离子通道（CNGCs）的特异性激动剂，也是脊椎动物光感受器细胞中将光信号转化为电信号的关键分子4。cGMP水解减少会导致ROSs中cGMP积累，从而引起CNGCs开放5。其结果是光转导通路被激活，导致光感受器细胞内阳离子浓度升高。该过程给光感受器带来代谢负担，当其过度激活时（例如由PDE6基因突变引起），可能导致细胞死亡。

许多研究表明，在具有不同视网膜变性（RD）基因突变的小鼠模型中，感光细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）的显著过度积累可能导致cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）的激活3,6。这会引起大量凋亡的TUNEL阳性细胞增加，并导致感光细胞层逐渐变薄。先前的研究表明，由cGMP水平升高引起的PKG过度激活是诱导感光细胞死亡的必要且充分条件2,5。针对不同RD小鼠模型的研究还显示，感光细胞中因cGMP水平升高而引发的PKG激活会导致下游效应分子（如多聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和钙蛋白酶（calpain））的过度激活2,7,8,9。这提示这些不同的靶蛋白与感光细胞死亡之间存在因果关联。

然而，以往关于放射性损伤（RD）的病理学、毒理药理学及治疗研究主要基于RD的小鼠模型10,11,12然而，这些研究成果在临床转化方面仍面临巨大困难。这主要是由于小鼠与人类之间存在显著的遗传和生理差异，尤其是在视网膜结构方面。相比之下，非人灵长类动物（NHPs）在遗传特征、生理模式以及环境因素调控方面与人类具有高度相似性。例如，已有研究在非人灵长类动物模型中探索了光遗传学疗法用于恢复视网膜活性的可行性。13Lingam 及同事证明，符合药品生产质量管理规范级别的人诱导多能干细胞来源的视网膜光感受器前体细胞可能挽救非人灵长类动物中的视锥光感受器损伤14因此，非人灵长类动物模型对于探索视网膜变性（RD）的发病机制以及开发有效的治疗方法具有重要意义。特别是那些表现出与人类相似致病机制的非人灵长类动物RD模型，在研究RD的发生和发展中可能发挥关键作用。 体内 新药毒理药理学分析

鉴于其漫长的生命周期、较高的技术难度以及高昂的成本 体内 灵长类动物模型，我们建立了 体外 使用猕猴视网膜外植体培养建立的非人灵长类动物（NHP）模型。首先，选取1-3岁野生型猕猴进行实验。 体外 视网膜外植体培养，包含视网膜-视网膜色素上皮-脉络膜复合体。将外植体用不同浓度的PDE6抑制剂扎普利纳特（100 µM、200 µM和400 µM）处理，以激活cGMP-PKG信号通路。采用TUNEL法对外植体中感光细胞的死亡情况进行定量分析，并检测外植体中cGMP的累积水平 通过 免疫荧光。鉴于猴子与人类在视网膜细胞分布与形态、视网膜层厚度以及其他生理特征方面具有高度相似性，cGMP-PKG信号通路的建立在 体外 视网膜模型可能有助于未来对视网膜脱离发病机制的研究，以及针对视网膜脱离治疗新药的开发和毒理药理学研究。

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方案

动物研究已通过中国科学院动物研究所伦理审查委员会（IACUC-PE-2022-06-002）以及云南大学动物伦理审查和动物实验方案（YNU20220149）的审查与批准。

1. 视网膜外植体的制备

  1. 获取1至3岁野生型猕猴的眼球，置于组织保存液中，并在猴子被处死或自然死亡后3小时内冰上运输。
  2. 配制蛋白酶K溶液：将25 mg蛋白酶K溶解于250 µL蒸馏水中，然后取225 µL该溶液加入18.5 mL基础培养基（R16）中。
  3. 用10 mL 5%聚维酮碘溶液（聚维酮碘:水 = 1:19）清洗眼球30秒，再将其浸入5%青霉素/链霉素（PEN/STREP）:磷酸盐缓冲液 = 1:19的溶液中1分钟，以避免细菌污染。随后将眼球在10 mL R16培养基中孵育5分钟。
  4. 将蛋白酶K溶液预先置于37 °C培养箱中预热。然后将眼球浸入10 mL蛋白酶K溶液中孵育2分钟。接着将眼球转移至10 mL R16 + 胎牛血清（1:1）溶液中孵育5分钟，最后将眼球转入10 mL新鲜R16培养基中进行终末清洗。
  5. 分离出巩膜、角膜、虹膜、晶状体和玻璃体，并用镊子和剪刀从四个方向剪下视网膜（图1A-L）。
  6. 使用环钻刀将视网膜外植体切成五个部分——鼻侧、颞侧、上方和下方使用4 mm环钻刀，中央区域（包含视盘和黄斑）使用6 mm环钻刀（图1M-O）。切割位置距离视神经头分别为：鼻侧1.5 mm，颞侧4 mm，上方和下方均为2 mm。
  7. 用眼睑拉钩将视网膜外植体（包含视网膜和脉络膜）转移并放置于插入物中央，感光细胞层朝上（图1P）。在培养板膜下方加入约1 mL完全培养基（R16添加BSA、转铁蛋白、孕酮、胰岛素、T3、皮质酮、维生素B1、维生素B12、视黄醇、视黄醇乙酸酯、DL-生育酚、生育酚乙酸酯、亚油酸、L-半胱氨酸盐酸盐、谷胱甘肽、谷氨酰胺、维生素C），以完全覆盖视网膜。

2. 灵长类视网膜外植体培养

  1. 将视网膜外植体在完全培养基中培养，并置于37 °C、充有湿润5% CO2的培养箱中。
  2. 向视网膜培养基中加入适当浓度的药物处理（例如，使用100 µM、200 µM或400 µM浓度的扎普司特）。每种处理条件至少使用三个外植体，并以未加药物的外植体作为对照。药物处理持续4天。

3. 固定与冷冻切片

  1. 将视网膜外植体与1 mL多聚甲醛（PFA）孵育45分钟，用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）短暂漂洗，然后依次与10%蔗糖孵育10分钟、20%蔗糖孵育20分钟、30%蔗糖孵育30分钟（每个视网膜外植体使用1 mL溶液）。
  2. 使用环钻刀片切割视网膜外植体，以确保从不同部位获取的外植体大小一致，具体要求为：周边部分分为四个象限，中央部分直径6 mm。随后，将视网膜外植体转移至锡盒（约1.5 cm × 1.5 cm × 1.5 cm）中，并用O.C.T.包埋介质覆盖组织。立即在液氮中冷冻组织切片，并置于-20 °C冰箱中保存。
  3. 使用锋利刀片将琼脂修整成包含组织样本的小块，将样本块切成10 µm厚的切片，并用软毛刷将其转移至防脱载玻片上。然后在40 °C下干燥45分钟，之后于-20 °C保存备用。

4. 免疫组织化学（图2）

  1. cGMP 染色
    1. 将载玻片干燥，并用疏水性标记笔在视网膜切片周围画出疏水圈以覆盖样本。
    2. 将载玻片浸入每片 200 µL 的 0.3% 磷酸盐缓冲液含吐温-20（PBST）中，室温孵育 10 分钟，随后在封闭液（5% 正常驴血清、0.3% PBST、1% BSA，每片 200 µL）中室温孵育 1 小时。
    3. 将样本与一抗（1:250，羊抗 cGMP，每片 200 µL）在封闭液中 4 °C 过夜孵育，然后用 PBS 每片 200 µL 漂洗 10 分钟，重复 3 次。
    4. 加入二抗（1:300，驴抗羊 Alexa Fluor 488，每片 200 µL）室温孵育 1 小时，再用 PBS 每片 200 µL 漂洗 10 分钟，重复 3 次。用含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂覆盖样本，4 °C 孵育至少 30 分钟后成像。
  2. TUNEL 染色
    1. 室温干燥载玻片 15 分钟，用液体阻断笔在视网膜组织样本周围画出疏水屏障圈，随后在 40 mL PBS 中孵育 15 分钟。
    2. 将载玻片置于每五张 42 mL 的 TBS（0.05 M Tris 缓冲液）中，37 °C 孵育。吸除 TBS 后，加入 6 µL 蛋白酶 K 孵育 5 分钟，然后用 TBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。
    3. 将载玻片置于切片盒内的乙醇-乙酸溶液（40 mL）中，覆盖透明膜，在 -20 °C 孵育 5 分钟。随后用 TBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。
    4. 加入封闭液（1% BSA；根据需要每片 200–300 µL），在湿盒中孵育 1 小时。
    5. 按以下比例配制 TUNEL 试剂盒溶液（TMR 红色）：每张切片取 62.50 µL 封闭液（1% BSA）、56.25 µL 标记液（TMR-dUTP）和 6.25 µL 酶液。每张切片加入约 130 µL 该溶液，37 °C 孵育 1 小时，然后用 PBS 每片 200 µL 漂洗 5 分钟，重复 2 次。
    6. 在样本上滴加含 1–2 滴含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂的盖玻片，4 °C 孵育至少 30 分钟后成像。
  3. cGMP 染色与 TUNEL 染色联合进行
    1. 先进行 cGMP 染色，再进行 TUNEL 染色。依次执行步骤 4.2.1 至 4.2.5 的 TUNEL 染色步骤，然后继续执行步骤 4.1.2 至 4.1.4 的 cGMP 染色步骤。
  4. 使用以下相机参数进行明场与荧光显微镜成像：曝光时间 = 125 ms，ROI 尺寸 = 2752 x 2208，颜色 = 黑白。通过软件采集图像。每张切片使用数码相机在 20 倍放大下拍摄四个不同视野，利用 DAPI（465 nm）、EGFP（509 nm）、TMP（578 nm）获取视网膜中央区域的代表性图像，Z-Stack 扫描间隔为 1 µm，可选间隔为 1.251 µm。

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结果

本研究中，采用包含视网膜-视网膜色素上皮-脉络膜复合体的猕猴视网膜外植体进行外植体培养图1, 补充图 S1）。与 体外 使用未附着视网膜色素上皮和脉络膜的视网膜进行视网膜细胞培养，本实验中的外植体培养有助于提高细胞存活率，从而延长光感受器细胞的存活时间。

我们使用不同浓度的PDE6抑制剂扎普林ast（100 µM、200 µM和400 µM；补充图S2）处理体外光感受器细胞，以诱导cGMP积累并继而激活PKG。体外实验中每种浓度分别处理4天。使用400 µM扎普林ast处理的体外视网膜模型显示出最多数量的TUNEL阳性细胞、显著的cGMP信号，同时对视网膜色素上皮（RPE）及内层视网膜神经元细胞的毒性较低。图2中TUNEL阳性细胞占比较高，提示cGMP活性升高可能加剧扎普林ast诱导的视网膜细胞变性，且cGMP的积累在光感受器变性过程中发挥一定...

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讨论

视觉光转导是指眼睛视网膜中的感光细胞将光信号转化为电信号的生物学过程。感光细胞是具有极性的神经元，能够进行光转导，根据其外段的形态可分为两种类型：视杆细胞和视锥细胞。视杆细胞负责暗视觉，而视锥细胞负责明视觉和高敏锐度视觉。遗传性视网膜变性（RD）是一类以进行性视网膜感光细胞死亡为特征的神经退行性疾病15。

目前关于RD的研究主要基于RD的小鼠模型，包括 体外 源自小鼠视网膜变性模型的视网膜外植体培养16然而，小鼠与人类之间存在显著的遗传和生理差异，尤其是在视网膜结构方面。相比之下，非人灵长类动物（NHPs）与人类具有高度相似性，因此NHP模型最适合用于视网膜变性（RD）发病机制的研究及治疗策略的开发。

在本研究中，我们建立了一种 体外 通过培养猕猴视网膜外植体建立非人灵长类动物模型。与常规的单细胞原代培养及一种 体外 永生化细胞系的培养，一种 体外 视网膜外植体...

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披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

本研究得到中国国家自然科学基金（编号：81960180）、Zinke遗产基金会、Charlotte和Tistou Kerstan基金会以及云南眼病临床医学中心（编号：ZX2019-02-01）的资助。我们感谢中国科学院昆明动物研究所吕龙宝教授分享本研究所用的猴眼球。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白（BSA）SigmaB2064封闭溶液
皮质酮SigmaC2505完全培养基添加剂
DL-生育酚SigmaT1539完全培养基添加剂
驴抗羊二抗，Alexa Fluor 488标记Life technologies corporationA11015cGMP的二抗
乙醇-乙酸溶液ShyuanyeR20492固定液
胎牛血清Gemini900-108封闭溶液
荧光显微镜Carl ZeissAxio Imager.M2免疫荧光成像
谷氨酰胺SigmaG8540完全培养基添加剂
谷胱甘肽SigmaG6013完全培养基添加剂
原位细胞死亡检测试剂盒，TMR redRoche12156792910TUNEL检测
胰岛素Sigma16634完全培养基添加剂
L-半胱氨酸盐酸盐SigmaC7477完全培养基添加剂
亚油酸SigmaL1012完全培养基添加剂
MACS组织保存液Miltenyi130-100-008新鲜器官和组织样本的优化保存
正常驴血清SolarbioSL050封闭溶液
多聚甲醛（PFA）BiosharpBL539A固定剂
青霉素/链霉素 100×MilliporeTMS-AB2-C青霉素/链霉素抗生素
磷酸盐缓冲液（PBS）SolarbioP1010缓冲溶液
聚维酮碘上海利康310411消毒剂
孕酮SigmaP8783完全培养基添加剂
蛋白酶KMillpore539480降解蛋白质
R16培养基Life technologies corporation074-90743A基础培养基
视黄醇SigmaR7632完全培养基添加剂
醋酸视黄酯SigmaR7882完全培养基添加剂
羊抗cGMP抗体Jan de Vente, Maastricht University, the NetherlandscGMP的一抗
蔗糖GHTECH57-50-1脱水剂
T3SigmaT6397完全培养基添加剂
Tissue-Tek包埋介质（O.C.T. Compound）SAKURA4583包埋介质
醋酸生育酚SigmaT1157完全培养基添加剂
转铁蛋白SigmaT1283完全培养基添加剂
TranswellCorning Incorporated3412细胞/组织培养
Tris缓冲液（TBS）SolarbioT1080封闭缓冲液
吐温X-100Solarbio9002-93-1表面活性剂
含DAPI的VECTASHIELD封片剂VectorH-1200封片介质
维生素B1SigmaT1270完全培养基添加剂
维生素B12SigmaV6629完全培养基添加剂
维生素CSigmaA4034完全培养基添加剂
扎普林司特SigmaZ0878PDE6抑制剂
Zeiss Imager M2显微镜 Zeiss, Oberkochen,Germany正置显微镜
LSM 900 Airyscan高分辨率激光扫描显微镜
Zeiss Axiocam Zeiss, Oberkochen,Germany数码相机
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)
来自野生型猕猴的灵长类眼球KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGYSYXK (figure-materials-1) K2017 -0008
Super Pap Pen Pen（液体阻断笔，Diado，0010，日本）
TUNEL试剂盒溶液（货号12156792910，Roche，德国）

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