利用新生大鼠缺氧缺血性脑病模型早期检测脑损伤的病理学与磁共振方法

摘要

本实验方案描述了一种用于识别新生鼠脑组织缺氧-缺血性损伤早期变化的啮齿类动物模型，可通过大体形态学和磁共振成像进行评估。相较于现有模型，该模型具有优势：现有模型可用于研究晚期损伤，但无法评估可重复的早期变化。

摘要

围产期缺氧缺血性脑病（HIE）是一种可能影响新生儿的急性疾病，可导致不同程度的长期和短期神经发育后果。早期诊断对于识别可能从干预中获益的婴儿至关重要；然而，目前的早期诊断主要依赖于临床标准。尚无分子或影像学检测方法在早期脑损伤的检出方面显示出明确前景。研究表明，磁共振成像（MRI）能够显示血流/缺血变化以及代谢紊乱。但这些方法均用于评估损伤发生后疾病的继发阶段（>12 h）。早期诊断对于在符合条件的婴儿中迅速启动治疗性低温至关重要，目前建议在出生后6小时内开始治疗。缺氧缺血性损伤的大鼠模型于1981年建立，已被广泛验证并用于研究脑灌注、脑损伤标志物及形态学的变化。然而，该模型主要被用作“晚期模型”，即在初始缺血损伤数天后评估损伤情况。已知该模型在评估可靠且可重复的早期脑部变化方面敏感性较差。本研究的目的是建立一种可靠的模型，结合病理染色与脑部磁共振成像/磁共振波谱技术，用于研究HIE的早期宏观形态学及影像学标志物。

引言

缺氧缺血性脑病（HIE）是一种由新生儿多种因素引起的严重疾病¹。围产期窒息和/或脑血流中断可能导致脑组织出现局灶性或弥漫性缺血性改变²。该病的发生率约为每1,000例活产婴儿中有1.6例，在发展中国家可高达每1,000例活产婴儿中有12.1例³。该疾病具有较高的死亡率（20%-50%），而存活者中约有25%可能长期存在神经系统功能障碍，如智力障碍、癫痫或脑性瘫痪⁴。目前唯一被证实对轻中度损伤有效的治疗手段是治疗性低温，且必须在出生后6小时内开始实施^5,6,7,8,9。尽管该疗法有助于预防导致继发性损伤的代谢改变，但也可能存在低血压、血小板减少、凝血时间延长、颅内出血、心律失常、脂肪坏死及血清电解质紊乱等潜在副作用^4,5。由于诊断标准具有主观性且高度依赖随时间演变的体格检查结果，HIE在新生儿中的早期诊断往往较为困难。磁共振成像可在损伤后数天至数周内显示反映脑损伤的改变，但在中度脑病患儿中——这类患儿最有可能从治疗性低温中获益——T1/T2加权磁共振成像的形态学改变可能在多达三分之二的病例中表现为正常¹⁰。根据近期报道，磁共振波谱分析（MRS）可能在新生儿HIE早期即显示出与病情相关的代谢变化¹¹。然而，截至目前尚未进行标准化或有效性验证。

许多研究者依赖动物模型来评估脑血管损伤的潜在诊断或治疗干预措施。创建梗死最常用的方法是结扎啮齿类动物的大脑中动脉^12,13。尽管该方法常用于研究成人缺血性卒中，但由于新生啮齿类动物体型小且在相当于人类新生儿疾病的年龄段时幼崽极为脆弱，该技术在新生动物中操作难度较大。此外，该方法并不能代表在缺氧缺血性脑病（HIE）中可能观察到的全脑性缺血改变。自20世纪80年代以来，大鼠单侧颈总动脉结扎的Rice-Vanucci模型¹⁴被用作一种经济有效的啮齿类动物模型，用于研究缺氧缺血性脑损伤。然而，早期脑血管变化存在较大变异性，且早期实验中死亡率较高。大多数研究报道的是脑损伤的长期变化（即损伤后24小时以上），这些变化更为一致。本研究旨在建立一种方法，用于评估HIE大鼠模型中损伤后6小时内早期的分子和影像学变化。该方案设计旨在确保在较早（相当于足月新生儿）年龄阶段诱导缺血，并提高幼崽存活率，尤其是在缺氧暴露期间。采用磁共振成像（MRI）和磁共振波谱（MRS）评估损伤后6小时内血流改变、脑组织变化及代谢变化的影像学证据。同时对梗死区域进行了大体形态学评估。通过在多窝幼崽中重复实验，进一步验证了该模型的可重复性。

方案

所有实验程序均经俄克拉荷马医学研究基金会（OMRF）机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 IACUC #17-17）。本研究使用妊娠14天（E14）的雌性Sprague-Dawley大鼠仔鼠。动物购自商业来源（见材料表）。

1. 动物准备

1. 在分娩前将动物置于动物饲养设施中进行适应性饲养。
2. 所有大鼠均维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，并饲喂标准大鼠饲料。
3. 分娩后，将仔鼠与其各自的母鼠一同饲养。实验中使用雄性和雌性两种性别的仔鼠。
4. 在出生后第10天（P10），将仔鼠随机分配至假手术组或HIE组。
   ​注意：实验时间线见图1。所有实验均在P10当天完成。

2. 实验性HIE组的颈动脉结扎术（CAL）

1. 将新生大鼠幼崽置于加热垫上。
2. 使用鼻罩以含4%异氟烷的氧气（0.6 LPM）诱导麻醉，直至夹趾反射消失。维持麻醉时将气体流量降低至0.5%-2%。确保幼崽处于无意识状态，同时不抑制其呼吸驱动。
3. 在幼崽尾部做标记以供识别，并用胶带轻轻固定四肢。
4. 剃除颈部区域毛发，并使用70%碘伏溶液棉片进行消毒（见材料表）。
5. 使用#11刀片沿颈部正中线切开皮肤，长约1 cm。仔细分离左侧腮腺及筋膜，直至暴露左侧颈总动脉。使用止血钳轻柔游离血管，使其脱离周围筋膜组织。
6. 用小型止血钳小心将两根5-0缝线（见材料表）穿过血管，间距0.5 cm，并牢固结扎。
7. 使用小剪刀在两根结扎线之间剪断动脉，以确保血流完全中断。使用5-0丝线缝合皮肤和筋膜（见材料表）。
8. 腹腔注射布托啡诺（10单位溶于800 μL无菌生理盐水中），并在颈部背部皮下注射另外800 μL生理盐水，以预防脱水。
   注意：手术操作必须在10-12分钟内完成。
9. 将幼崽放回母鼠笼中，让其自然苏醒并恢复1-2小时。

3. 对照组的假手术操作步骤

1. 将新生大鼠幼崽置于加热垫上。
2. 使用鼻罩以含4%异氟烷的氧气（0.6 LPM）诱导麻醉，直至夹趾反射消失。维持麻醉时将气体流量降低至0.5%-2%。确保幼崽处于无意识状态，同时不抑制其呼吸驱动。
3. 在幼崽尾部做标记以供识别，并用胶带轻轻固定四肢。
4. 剃除颈部区域毛发，并使用70%碘伏溶液棉片进行消毒。
5. 使用#11刀片在颈部正中皮肤做1 cm切口，随后用5-0丝线缝合切口。
6. 术后护理、补液及镇痛处理与HI组相同（步骤2.8–2.9）。

4. 对CAL组和假手术组进行缺氧暴露

1. 准备透明聚碳酸酯缺氧室（参见 材料表通过将管路连接到腔室盖上，以持续供应6升/分钟的低氧气体混合物（8%氧气，92%氮气）来实现。
2. 在密闭室中放入一张蓝色吸水垫，立即将两组幼鼠放入密闭室内。让幼鼠在低氧环境中停留45分钟。
3. 将 chamber 浸入持续流动的温水浴中，以维持 chamber 内部温度恒定在 37 °C。
4. 用口服生理盐水溶液为幼崽补水 通过 在放入低氧舱前灌胃600 μL，并在45分钟结束时再次灌胃600 μL。
5. 将所有幼崽放回各自母鼠（实验组和假手术组）的笼中，并在靠近小动物影像设施的房间内让其恢复2小时。

5. 磁共振成像与波谱分析

1. 在颈动脉结扎结束后 4 小时，进行磁共振成像（MRI）和磁共振波谱（MRS），以识别和评估放射学及代谢标志物。在小动物影像中心，在持续心血管监测的麻醉条件下进行该操作。
2. 使用 1.5% 异氟烷和 0.7 L/min 氧气对每只动物进行麻醉，并将其仰卧置于MR探头（见材料表）中，下方垫有覆盖加热垫的蓝色吸水垫。使用腹部气动垫（见材料表）持续监测动物的呼吸频率。
3. 采用头部表面线圈作为信号接收器，并通过四通道容积线圈（内径 72 mm，见材料表）向样品发射射频脉冲。
4. 根据已发表的方法^15,16,17进行MRI，以评估脑血流量（CBF）和水扩散常数（ADC）的变化。进行MRI形态学（T1 和 T2）、扩散和灌注成像，以确定脑部受损最严重且灌注最差的区域。
   注：每组中灌注和扩散（ADC）的平均值在结扎侧与对照侧（未结扎颈动脉侧）之间进行比较。
5. 根据已发表的方法^15,17进行MRS，并使用基于Mathematica软件（见材料表）自主编写的程序进行分析。
6. 通过以水峰（4.78 ppm）为参考进行校准，将MR谱图以百万分之一（ppm）为单位进行标度。识别主要的脑代谢物峰：N-乙酰天门冬氨酸（NAA）位于 2.02 ppm，胆碱（Cho）位于 3.22 ppm，肌酸（Cr）位于 3.02 ppm，肌醇（myo-inositol）位于 3.53 ppm。
   ​注：通过代谢物峰面积测量值计算以下比值：NAA/Cho（NAA与Cho之比）、Cr/Cho（Cr与Cho之比）以及 Myo-Ins/Cho（肌醇与Cho之比）¹⁵。

6. 血清和脑组织分析

1. 在颈动脉结扎或假手术后5.5小时，按照先前发表的方法进行采血。¹⁸.
2. 用4%异氟烷再次麻醉幼鼠。
3. 使用锋利的#11刀片，进行腹部切口，随后进行横膈切口，以暴露心脏。
4. 进行采血 通过 心脏穿刺，如先前所述¹⁸将一支1 mL注射器上的32 G针头插入右心室，轻柔抽吸1 mL血液。
5. 让全血凝固，随后在1,000 x g下离心 g 在 4 °C 下离心 15 分钟。将血清转移至干净的微量离心管中。
6. 将整个蛹头切除以进行脑部病理学的大体评估，随后将其浸入冰中2分钟。
7. 从颅骨基部至鼻尖沿背侧头皮做一切口，剥离脑周颅骨，将完整的大脑取出并置于洁净的培养皿中。
8. 用无毒标记笔标记大脑右侧。将大脑头侧朝上放置，使两侧半球均可见。使用预冷的剃刀刀片，沿冠状面平行将大脑切成四个相等的部分。
9. 将脑切片浸入2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC，参见 材料表在用铝箔覆盖的培养皿中加入溶液，以防止光敏化，并在 37 °C 下孵育 15 分钟。
   注意：梗死区域表现为缺乏红色TTC染色的白色区域。
10. 若梗死灶不明显或难以识别，可在剖腹及开胸后，将0.5–1 mL的氯化三苯基四氮唑（TTC，1%）溶于磷酸盐缓冲液中，直接注入右心，灌注2分钟后，再对幼崽进行断头处理。
11. 如需进一步分析，将脑组织和血清保存在 −80 °C。

结果

本方案用于制备和评估HIE后早期脑部变化，易于实施，可在P10大鼠幼崽损伤后6小时内实现脑损伤的大体病理学和放射学观察。图1展示了实验设计。雌雄两性合并分析，每组共检测来自五个窝的24只动物。动物死亡率极低，直至终末实验完成时，动物存活率达到99%。

在大脑切片经TCC染色后，结扎冠状动脉左前降支（CAL）和缺氧处理6小时后，缺血区域清晰可见。这些病灶表现为未着色的明显白色损伤区域，如图2所示。观察损伤无需对任何样本进行心脏灌注TCC。许多动物显示出多个梗死区域。大部分病灶位于脑皮层表面。

与大脑未手术侧或对侧相比，结扎侧脑组织的磁共振灌注成像显示灌注减少。在HIE组中，结扎侧脑组织的灌注在颈总动脉结扎（CAL）和缺氧处理后3小时减少了80%。如预期所示，假手术组大脑两侧之间无明显差异。代表性磁共振成像结果见图3。在弥散扫描中，大脑两侧也呈现出相似的...

讨论

已成功设计出一种针对新生大鼠幼崽的研究方案，用于可视化和分析缺氧缺血性脑病（HIE）中脑损伤的早期标志物。迄今为止，尚缺乏可用于客观评估新生儿群体中早期脑损伤的检测工具。在缺氧缺血（HI）损伤后，存在一个阶段（1–6 小时），此时脑组织的氧化代谢功能受损尚有可能部分恢复，随后才会进入线粒体功能不可逆衰竭的阶段¹⁹。这一潜伏期即为神经保护干预（如治疗性低温）的治疗时间窗⁶。大多数已发表的临床试验均建议在出生后6小时内启动治疗^5,7，且多数医疗机构不会在此时间之后提供该疗法。然而，低温治疗必须谨慎选择使用，因其可能引发严重不良反应²⁰，包括心律失常、低血压、血小板功能障碍和血小板减少、持续性肺动脉高压、凝血功能障碍以及皮下脂肪坏死²¹。因此，治疗的启动必须严格筛选，仅针对那些最可能从中获益的婴儿实施。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 生理盐水	Fisher Scientific	Z1376
2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）	Millipore Sigma	T8877
腹部气动垫	SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
带防水防潮层的吸水垫，58.4 × 91.4 cm，680 mL	Fisher Scientific	501060566
BD 30 G 针头和注射器	Fisher Scientific	目录号 14-826-10
Biospec 7.0 特斯拉/30 cm 水平孔径磁体小动物成像系统	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany
布托啡诺			由兽医医学提供
带探针的紧凑型温度计	Fisher Scientific	S01549
气体混合物：92% 氮气，8% 氧气	Airgas
头部表面线圈	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
异氟烷气体			由兽医医学提供
Isotemp 浸入式循环器 2100	Fisher Scientific	已停产	浸入水浴腔中，通过管道维持连续水流
铅环烧瓶配重	VWR	29700-060	用于水浴的配重，确保啮齿类动物腔体保持浸没于水浴中
Mathematica 软件	Wolfram Research, Champaign, IL, USA	版本 6.0
Pedialyte 电解质溶液，补水饮料，1 升，无味	Pedialyte		从 CVS 购得
磷酸盐缓冲液（DPBS，1×），Dulbecco 配方	Millipore Sigma	J67670.AP
透明塑料桶			我们使用了一个旧的啮齿类动物饲养笼——一个良好的替代品是：Cambro 182615CW135 Camwear 食品储存盒，18" × 26" × 15"，型号：182615CW135
有机玻璃啮齿类动物固定腔	Pedialyte/CVS		兽医医学提供了一个用于固定啮齿类动物的小型腔体，尺寸约为 6 × 4 × 4 英寸
E14 期的妊娠 Sprague Dawley 大鼠	Charles River	品系编号 400
Purdue Products Betadine 棉签	Fisher Scientific	19-061617
四通道体积线圈（72 mm 内径）	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting 丝线缝合线	Fisher Scientific	目录号 10-000-656
Vicryl 5-0 缝合线	Fisher Scientific	NC1985424