通过听觉环路解析脆性X智力低下蛋白的细胞自主功能 在卵内 电穿孔

摘要

通过在卵内电穿孔技术，我们建立了一种方法，可在鸡胚发育过程中特定电路组装阶段，选择性地转染听觉内耳及耳蜗核，实现细胞群特异性的脆性X智力低下蛋白敲低。

摘要

脆性X智力低下蛋白（FMRP）是一种mRNA结合蛋白，可调控局部蛋白质翻译。FMRP的缺失或功能障碍会导致脆性X综合征（FXS）中出现异常的神经元和突触活动，该综合征以智力障碍、感觉异常以及社交沟通问题为特征。目前对FMRP功能及FXS发病机制的研究主要依赖于在转基因动物中敲除Fmr1基因（即编码FMRP的基因）。本文报道了一种利用鸡胚进行的体内方法，用于研究FMRP在神经环路组装和突触形成期间的细胞自主功能。该方法采用阶段特异性、位点特异性和方向特异性的电穿孔技术，导入包含Fmr1小发夹RNA（shRNA）和EGFP报告基因的药物可诱导载体系统。通过该方法，我们实现了在听觉神经节（AG）及其脑干靶区之一——巨细胞核（NM）中选择性敲低FMRP，从而实现了对AG-NM环路中特定组分的操控。此外，转染所呈现的嵌合模式可在同一动物内设置对照，并允许对邻近神经元或纤维进行比较，从而提高数据分析的可靠性和敏感性。该可诱导载体系统可对基因编辑的起始时间进行精确控制，以最小化发育过程中的累积效应。上述策略的结合为解析FMRP在突触和神经环路发育中的细胞自主功能提供了一种创新工具。

引言

脆性X综合征（FXS）是一种以智力障碍、感觉异常和自闭症样行为为特征的神经发育障碍。在大多数情况下，FXS由脆性X智力低下蛋白（FMRP；由FMR1基因编码）的全面缺失所致。 Fmr1 基因）从早期胚胎阶段开始¹FMRP 是一种 RNA 结合蛋白，通常在脑内的大多数神经元和胶质细胞中表达，也在感觉器官中表达。^2,3,4在哺乳动物大脑中，FMRP 可能与数百种编码对多种神经活动至关重要的蛋白质的 mRNA 相关联⁵常规研究 Fmr1 基因敲除动物实验表明，FMRP的表达对于突触神经传递的组装和可塑性尤为重要⁶多个条件性和嵌合型基因敲除模型进一步证明，FMRP的功能和信号在不同脑区、细胞类型及突触位点之间存在差异。 在包括轴突投射、树突发育和突触可塑性在内的多种发育过程中^7,8,9,10,....

方案

鸡蛋和鸡胚胎的处理均遵循暨南大学动物护理与使用委员会批准的动物实验方案，以谨慎和尊重的态度进行。

1. 卵母细胞与质粒的制备

1. 卵的准备
   1. 从华南农业大学获取新鲜的受精鸡卵（Gallus gallus），在孵化前储存于16 °C。为保证最佳活性，所有卵应在到达后一周内开始孵化。
   2. 将卵水平放置，在38 °C下孵化46–48小时，直至达到Hamburger和Hamilton（HH）12期²⁵，用于神经管转染；或孵化54–56小时至HH13期，用于耳囊转染。由于卵的动物极比植物极颜色更浅，水平放置可使胚胎位于卵的上方，便于操作。在此步骤及后续所有步骤中，需注意保持卵的水平位置。
   3. 使用手电筒从卵底部透光照射时，胚胎位置在蛋壳上呈现为一个较暗的区域。在达到目标HH期时，使用此透光法用铅笔在蛋壳上标记胚胎位置。
   4. 用含75%乙醇的纱布擦拭卵表面。用剪刀尖在卵的钝端钻一个小孔，使用18 G针头的注射器抽出2 mL蛋白液。确保孔的大小仅足以插入针头。若有蛋白液渗出，用纱布擦净，并用透明胶带封住小孔。
   5. 为减少开窗过程中产生裂纹并防止碎壳掉落，用透明胶带覆盖卵的顶部，中心对准铅笔标记的暗区。
2. 质粒DNA提取
   ....

结果

通过执行 在卵内 在不同部位和不同发育阶段进行电穿孔，我们实现了在听觉外周或听觉脑干中选择性地敲低FMRP。

在NM中敲低FMRP
针对鸡Fmr1基因的小发夹RNA（shRNA）被设计并克隆至Tet-On载体系统中，具体方法如前所述²⁰。在体电转染的实验装置如图1A所示。将用快绿染色的质粒DNA在HH12期注射至r5/r6水平的神经管内（图1B-C）。在r5/6水平的神经管两侧分别放置铂金双极电极（图1D）。施加两次12 V的脉冲，以将质粒驱动至电极正极侧的组织中。将多西环素（Dox）施加于尿囊绒毛膜上，以诱导Fmr1 shRNA和EGFP的表达。Dox处理24小时后，在荧光体视.......

讨论

为了确定FMRP的细胞自主功能，有必要在特定细胞群或细胞类型中调控其表达。由于FMRP的主要功能之一是调控突触的形成与可塑性，因此，要全面理解FMRP在突触通讯中的作用机制，必须能够选择性地操控特定神经环路中各个突触组分。通过鸡胚的in ovo电穿孔技术，我们展示了一种方法，可选择性地在AG-NM环路中的突触前AG神经元或突触后NM神经元中调控FMRP的表达。实现这一目标的关键步骤包括选择合适的胚胎发育阶段进行电穿孔，并准确地将电极定位至胚胎的相应位置。NM神经元起源于HH12阶段神经管菱脑节r5/6水平的神经前体细胞²³。在同一阶段，颅神经嵴细胞从神经管背侧顶端迁移至前庭耳蜗神经节，包裹未来的AG神经元³³。因此，NM神经元和AG中的胶质细胞均起源于神经管。相比之下，毛细胞和AG神经元则起源于外胚层²⁴。在HH10阶段，位于r5/6水平附近的外胚层增厚，至HH13阶段内陷形成听泡（otic cup）。随后听泡闭.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卵的孵化
16 °C 冰箱	MAGAT		用于受精卵的储存。
卵孵化仪	SHANGHAI BOXUN	GZX-9240MBE
受精卵	华南农业大学农场		为获得最佳活性，卵必须在一周内使用。
质粒制备
离心机	Sigma	10016
快绿染料（Fast green）	Solarbio	G1661	用蒸馏水配制0.1%工作液，并进行高压灭菌。
质粒大提试剂盒（Plasmid Maxi-prep kit）	QIAGEN	12162	将质粒DNA溶解于Tris-EDTA（TE）缓冲液中；使用无内毒素制备试剂盒
乙酸钠（Sodium Acetate）	Sigma-Aldrich	S2889	用无核酸酶水配制7.5 M工作液。
电穿孔与多西环素给药
电穿孔仪	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL 注射器	广州康福莱
体视显微镜	CNOPTEC	SZM-42
多西环素（Doxcycline）	Sigma-Aldrich	D9891	每次给药使用新鲜分装样品，并于-20 °C保存。
玻璃毛细管	贝博博美	RD0910	0.9–1.1 mm × 100 mm
实验室封口膜（Parafilm）	PARAFILM	PM996	透明薄膜
拉针仪	成都仪器厂	WD-2	拉制条件：500 °C 持续15秒
铂电极	自制		直径0.5 mm，间距1.5 mm。
橡胶管	Sigma-Aldrich	A5177
组织解剖与固定
镊子	RWD	F11020-11	尖端尺寸：0.05 × 0.01 mm
其他手术器械	RWD
多聚甲醛（Paraformaldehyde）	Sigma-Aldrich	158127	新配制的4% PFA磷酸盐缓冲液可在4 °C保存最多一周。
SYLGARD 184 硅胶弹性体试剂盒	DOW	01673921	用于黑色背景培养皿时，需添加食品级炭粉。
切片
冷冻切片机	LEICA	CM1850
明胶（Gelatin）	Sigma-Aldrich	G9391	来源于牛皮。
滑动式切片机	LEICA	SM2010
免疫染色
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠二抗	Abcam	ab150113	1:500 稀释，RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 山羊抗兔二抗	Abcam	ab150078	1:500 稀释，RRID: AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1:1000 稀释
Fluoromount-G 封片剂	Southern Biotech	Sb-0100-01
FMRP 抗体	Y. Wang, 佛罗里达州立大学	#8263	1:1000 稀释，RRID: AB_2861242
Islet-1 抗体	DSHB	39.3F7	1:100 稀释，RRID: AB_1157901
Netwell 培养板	Corning	3478
神经丝蛋白抗体（Neurofilament antibody）	Sigma-Aldrich	N4142	1:1000 稀释，RRID: AB_477272
小清蛋白抗体（Parvalbumin antibody）	Sigma-Aldrich	P3088	1:10000 稀释，RRID: AB_477329
SNAP25 抗体	Abcam	ab66066	1:1000 稀释，RRID: AB_2192052
成像
Adobe Photoshop	ADOBE		图像编辑软件
共聚焦显微镜	LEICA	SP8
荧光体视显微镜	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OLYMPUS		商用图像处理软件包