通过产 卵电 穿孔解剖听觉回路中脆性X智力迟钝蛋白的细胞自主功能

Summary

利用 卵 电穿孔，我们设计了一种选择性转染鸡胚胎中听觉内耳和耳蜗核的方法，以实现在电路组装的离散期间脆性X智力迟钝蛋白的细胞组特异性敲低。

Abstract

脆性X染色体智力低下蛋白（FMRP）是一种调节局部蛋白质翻译的mRNA结合蛋白。FMRP丧失或功能障碍导致脆性X综合征（FXS）的神经元和突触活动异常，其特征是智力障碍，感觉异常和社会沟通问题。FMRP功能和FXS发病机制的研究主要在转基因动物中使用 Fmr1 （编码FMRP的基因）敲除进行。在这里，我们 报告了一种体内 方法，该方法用于使用鸡胚胎确定FMRP在电路组装和突触形成期间的细胞自主功能。该方法采用含有 Fmr1 小发夹RNA（shRNA）和EGFP报告基因的药物诱导载体系统的阶段，位点和方向特异性电穿孔。通过这种方法，我们在听觉神经节（AG）及其脑干靶标之一大细胞核（NM）中实现了选择性FMRP敲低，从而在AG-NM电路中提供了组件特异性操作。此外，转染的镶嵌模式允许动物内对照和邻近神经元/纤维比较，以提高数据分析的可靠性和灵敏度。诱导载体系统提供基因编辑开始的时间控制，以最大限度地减少累积的发育影响。这些策略的组合为剖析FMRP在突触和电路发育中的细胞自主功能提供了一种创新工具。

Introduction

脆性 X 综合征 （FXS） 是一种以智力障碍、感觉异常和自闭症行为为特征的神经发育障碍。在大多数情况下，FXS是由从早期^{胚胎阶段开始}的脆性X智力迟钝蛋白（FMRP;由Fmr1基因编码）的全球损失引起的1。FMRP是一种RNA结合蛋白，通常在大脑中的大多数神经元和神经胶质细胞以及感觉器官中表达²，^3，4。在哺乳动物的大脑中，FMRP可能与数百种编码对各种神经活动很重要的蛋白质的mRNA有关⁵。对常规Fmr1基因敲除动物的研究表明，FMRP表达对突触^{神经传递的}组装和可塑性尤为重要6。一些条件和马赛克敲除模型进一步证明，FMRP作用和信号在几个发育事件中因大脑区域，细胞类型和突触部位而异，包括轴突投影，树突状图案和突触可^塑性7，⁸，⁹，^10，11，^12，13

Protocol

鸡蛋和鸡胚胎按照暨南大学动物护理和使用委员会批准的动物规程进行谨慎和尊重的处理。

1. 卵子和质粒制备

1. 鸡蛋准备
   1. 从华南农业大学获得新鲜受精鸡蛋（Gallus gallus），并在孵化前储存在16°C。为了获得最佳的活力，请在到达后一周内设置所有种蛋进行孵化。
   2. 将鸡蛋水平放置并在38°C下孵育46-48小时，直到汉堡和汉密尔顿（HH）阶段12²⁵ 进行神经管转染，或54-56小时直到HH13进行耳囊转染。由于卵子的动物极比植物极轻，因此水平放置将胚胎放置在卵的顶部以便于操作。在此步骤和所有后续步骤中，请小心保持鸡蛋水平。
   3. 当使用手电筒从鸡蛋底部投射光线时，胚胎的位置在蛋壳上显示为黑暗区域。在所需的HH阶段，使用这种手电筒方法用铅笔标记胚胎在蛋壳上的位置。
   4. 用含有75%乙醇的纱布擦拭鸡蛋。用剪刀尖端在鸡蛋的尖端钻一个孔，然后用 2 G 针头注射器取出 18 mL 白蛋白。确保孔仅足够大以允许针头插入。用纱布擦去任何泄漏的白蛋白，并用透明胶带密封孔。
   5. 为了尽量减少裂缝并防止在开窗过程中掉落的贝壳碎屑，请用透明胶带覆盖鸡蛋的顶部，以铅笔标记的黑暗区域为中心。
2. 质粒DNA提取
   1. 如前所述

Results

通过在不同部位和不同发育阶段进行 卵 电穿孔，我们在听觉外周或听觉脑干中实现了选择性FMRP敲低。

新墨西哥州的FMRP敲低
如前所述，设计针对鸡Fmr1的小发夹RNA（shRNA）并将其克隆到Tet-On载体系统中²⁰。 卵内电穿孔的设置如图1A所示。将带有快速绿色着色的质粒DNA在HH12下以r5 / r6水平注射到神经管中（图1B-C）。在r5/6水平的神经管的每一侧放置一个铂双极电极（图1D）。传递两个12 V脉冲以将质粒驱动到电极正极附近的组织中。将Dox施加在脉络膜尿囊膜上以触发Fmr1 shRNA和EGFP的表达。Dox处理24小时后，EGFP在荧光体视显微镜下明显。.......

Discussion

为了确定FMRP的细胞自主功能，需要操纵其在单个细胞组或细胞类型中的表达。由于FMRP的主要功能之一是调节突触形成和可塑性，因此选择性地操纵某个回路的每个突触组件是充分了解突触通信中FMRP机制的先决条件。在鸡胚胎的卵电穿孔中，我们展示了一种在突触前AG神经元或突触后NM神经元中靶向AG-NM回路中FMRP表达的方法。为了实现这一目标，为电穿孔选择合适的发育阶段并将电穿孔电极准确定位在胚胎上是关键步骤。NM 神经元起源于神经管中 r5/6 水平的神经祖细胞，位于 HH12²³。在同一阶段，颅神经嵴细胞从神经管的背尖迁移到耳蜗前庭神经节，以包裹未来的AG神经元³³。因此，AG中的NM神经元和神经胶质细胞都是神经管衍生的。相比之下，毛细胞和AG神经元起源于外胚层²⁴。与r5/6水平相邻的外胚层在HH10处增厚，然后在HH13处内陷形成耳杯。然后耳杯关闭并与外胚层分离形成耳囊，前部成为听觉感觉器官，后部为前庭系统做出贡.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
种蛋孵化
16 °C 冰箱	MAGAT		用于储存受精卵。
鸡蛋孵化器	上海博讯	GZX-9240MBE
华南农业大学		精蛋	鸡蛋必须在一周内使用，以获得最佳活力。
质粒制备
离心机	Sigma	10016
Fast green	Solarbio	G1661	在蒸馏水中制备 0.1% 的工作溶液并高压灭菌。
质粒 Maxi 制备试剂盒	QIAGEN	12162	将质粒 DNA 溶解在 Tris-EDTA （TE） 缓冲液中;无内毒素制备试剂盒
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889	在无核酸酶的水中制备 7.5M 工作溶液。
电穿孔和多西环素给药
电穿孔仪	BTX	ECM399
1 mL / 5 mL注射器	广州康福莱
解剖显微镜	CNOPTEC	SZM-42
多斯环素	Sigma-Aldrich	D9891	每次剂量使用新鲜的等分试样，并储存在 -20 &摄氏度。
玻璃毛细管	BEIBOBOMEI	RD0910	0.9-1.1 mm*100 mm
实验室封口膜	PARAFILM	PM996	透明膜
管拉拔器	成都仪器厂	WD-2	拉动条件：500 °C 为 15 秒
铂金电极	自制		0.5 毫米直径，间隔 1.5 毫米。
橡胶管	Sigma-Aldrich	A5177
组织解剖和固定
镊子	RWD	F11020-11	尖端尺寸：0.05*0.01 毫米
其他手术工具	RWD
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127	新鲜制备的磷酸盐缓冲盐水中的 4% PFA 溶液可以储存在 4 &°g 中;C 长达 1 周。
SYLGARD 184 有机硅弹性体套件	DOW	01673921	对于黑色背景板，使用了食品级碳粉。
切片
低温恒温器	LEICA	CM1850
明胶	Sigma-Aldrich	G9391	来自牛皮。
滑动切片机	LEICA	SM2010
免疫染色
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠	Abcam	ab150113	1：500 稀释，RRID：AB_2576208
Alexa Fluor 555 山羊抗兔	Abcam	ab150078	1：500 稀释，RRID：AB_2722519
DAPI	Abcam	ab285390	1：1000稀释
Fluoromount-G 封固剂	Southern  生物技术	Sb-0100-01
FMRP 抗体	Y. Wang，佛罗里达州立大学	#8263	1：1000 稀释度，RRID：AB_2861242
Islet-1 抗体	DSHB	39.3F7	1：100 稀释度，RRID：AB_1157901
Netwell 板	康宁	3478
神经丝抗体	Sigma-Aldrich	N4142	1：1000 稀释度，RRID：AB_477272
小清蛋白抗体	Sigma-Aldrich	P3088	1：10000 稀释度，RRID：AB_477329
SNAP25 抗体	Abcam	ab66066	1：1000 稀释度，RRID：AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop	ADOBE		图像编辑软件
共聚焦显微镜	LEICA	SP8
荧光体视显微镜	OLYMPUS	MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0	OlYMPUS		商用图像处理软件包