需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

鉴定在甲型流感病毒感染过程中切割蛋白质的半胱天冬酶及其基序

1.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64189

⸱

2022年7月21日

1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

本文内容

摘要

甲型流感病毒（IAV）感染会激活半胱天冬酶（caspases），从而切割宿主和病毒蛋白，这些切割产物具有促病毒和抗病毒功能。通过使用抑制剂、RNA干扰、定点突变以及蛋白质印迹和逆转录定量PCR技术，研究人员鉴定了在感染的哺乳动物细胞中切割宿主蛋白cortactin和组蛋白去乙酰化酶的半胱天冬酶。

摘要

半胱天冬酶（caspases）是一类半胱氨酸蛋白酶，可响应多种刺激（包括微生物感染）调控程序性细胞死亡。程序性细胞死亡最初被描述为凋亡，现已明确包含三种相互关联的通路：细胞焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis），这三种通路共同被称为“PANoptosis”。流感病毒（Influence A virus, IAV）感染可诱导哺乳动物细胞发生PANoptosis，通过激活不同的半胱天冬酶，进而切割多种宿主蛋白以及病毒蛋白，从而引发一系列生物学过程，例如激活宿主的天然抗病毒反应，或降解具有拮抗作用的宿主蛋白。已有研究发现，在动物和人类上皮细胞中，IAV感染可诱导半胱天冬酶3介导的宿主蛋白——皮层肌动蛋白（cortactin）、组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）和组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）——的切割。为验证这一点，研究人员采用了抑制剂、RNA干扰和定点诱变技术，随后通过蛋白质印迹法（western blotting）检测了cortactin、HDAC4和HDAC6多肽链的切割情况或抗切割能力及其恢复情况。这些方法结合RT-qPCR，构成了一种简单而有效的策略，可用于鉴定在IAV或其他人与动物病毒感染过程中发生半胱天冬酶介导切割的宿主及病毒蛋白。本方案详细阐述了该策略的代表性结果，并讨论了进一步提升其实验效果的方法。

引言

甲型流感病毒（IAV）是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的典型代表，可引起全球性流行病和不可预测的大流行。IAV 引发人类呼吸道疾病——流感，通常被称为"流感"。流感是一种急性疾病，会诱导宿主产生促炎性和抗炎性先天免疫反应，并导致人类呼吸道上皮细胞死亡。这两个过程均由一种称为程序性细胞死亡的现象所调控1。当多种病原体识别受体在宿主细胞内感知到入侵病毒颗粒时，程序性细胞死亡的信号通路即被激活。这会启动感染细胞的死亡程序，并通过三种相互关联的信号通路向邻近健康细胞发出信号，这三种通路分别为焦亡、凋亡和坏死性凋亡，最近被统称为一个整体过程——PANoptosis1。

PAN凋亡从诱导到执行阶段涉及多种宿主和病毒蛋白的蛋白水解加工。这类蛋白质的加工主要由一组称为半胱天冬酶（caspases）的半胱氨酸蛋白酶家族主导。1,2目前已知多达18种半胱天冬酶（从caspase 1到caspase 18）3大多数caspase以酶原形式表达，并通过自催化或其他caspase介导的自身蛋白水解加工而被激活4 在受到病毒等刺激时，感染甲型流感病毒（IAV）的细胞会发生PANoptosis，这被认为是一种宿主防御机制，但IAV已进化出逃逸并利用该过程以促进其自身复制的策略1,2,5,6其中之一是拮抗宿主因子 通过 caspase介导的裂解或降解，这些过程本身具有抗病毒作用，或可干扰甲型流感病毒（IAV）生命周期的某个步骤。为此，已有研究发现宿主因子cortactin、HDAC4和HDAC6在IAV感染的上皮细胞中会发生caspase介导的裂解或降解7,8,9HDAC4 和 HDAC6 是抗流感病毒 A 因子8,10，且皮层肌动蛋白（cortactin）在感染的后期阶段干扰IAV复制，可能发生在病毒组装和出芽过程中11.

此外，多种caspase也会被激活，进而切割多种蛋白质，从而在IAV感染期间激活宿主的炎症反应1,2。进一步研究表明，IAV的核蛋白（NP）、离子通道M2蛋白12,13,14以及其他病毒的多种蛋白质3,15,16在感染过程中也会经历caspase介导的切割，进而影响病毒的致病过程。因此，持续研究IAV及其他病毒感染过程中caspase介导的宿主和病毒蛋白质的切割或降解，对于理解病毒致病的分子机制至关重要。本文介绍了以下方法：（1）评估caspase对这些蛋白质的切割或降解作用；（2）鉴定参与该过程的caspase；（3）定位切割位点。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究已获得奥塔哥大学机构生物安全委员会的监管批准，允许开展流感病毒（IAV）和哺乳动物细胞的相关工作。实验中使用了Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞、人肺泡上皮A549细胞以及甲型H1N1流感病毒亚型。流感病毒在鸡胚中培养，具体方法见其他文献17。哺乳动物细胞操作均在无菌和无菌技术条件下进行，流感病毒亚型的操作则在生物安全二级（或物理 containment 2）实验室中的II级生物安全柜内完成。

1. 通过半胱天冬酶评估流感病毒A感染细胞中蛋白质的切割或降解

  1. 在12孔细胞培养板中每孔接种 3 × 105 个 MDCK 或 A549 细胞。
    注意：若使用 MDCK 细胞，需确保针对目标蛋白的抗体可识别犬源物种。
  2. 成对接种各孔，即设置对照组一对——一孔用于未感染-模拟处理样本，另一孔用于感染-模拟处理样本；以及实验组一对——一孔用于未感染-抑制剂 A 样本，另一孔用于感染-抑制剂 A 样本。每增加一种抑制剂，相应增加成对孔数（参见参考文献7,8）。
  3. 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养过夜。
  4. 次日，用流感病毒 A 型（IAV）（H1N1 亚型或其他亚型）感染细胞。
    1. 为此，将病毒储备液用 400 µL 无血清最低必需培养基（MEM）（见材料表）稀释，制备病毒接种物，感染复数（MOI）为 0.5–3.0 个空斑形成单位（pfu）/细胞7,11（计算 MOI 时需考虑细胞数量倍增系数）。
      注意：感染 MDCK 细胞时，需在病毒接种物中加入甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）-胰蛋白酶，终浓度为 1 µg/mL。
  5. 移除细胞中的旧培养基（步骤 1.3），用 1 mL/孔无血清 MEM 洗涤细胞 2 次。
  6. 向细胞中加入 400 µL 病毒接种物（步骤 1.4.1），在 35 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。
  7. 同时，在无血清 MEM 中分别将半胱天冬酶抑制剂（如 Z-DEVD-FMK）、溶酶体抑制剂（如 NH4Cl）或蛋白酶体抑制剂（如 MG132）（见材料表）稀释至终浓度分别为 40 µM、20 mM 或 10 µM7（见材料表）。后两种抑制剂作为对照。若其中一种抑制剂使用非水溶剂重悬，则用相同体积的该溶剂稀释无血清培养基作为模拟处理对照。
  8. 移除病毒接种物，并按步骤 1.5 的方法洗涤细胞（1 次）。
  9. 向细胞中加入 1 mL/孔无血清 MEM，模拟处理或添加抑制剂，然后按步骤 1.6 的条件进行孵育。此时间点记为感染 0 小时。
  10. 24 小时后，用 1 mL 注射器活塞（橡胶端）刮取细胞，转移至 1.5 mL 聚丙烯管中。
  11. 在室温下以 12,000 × g 离心 1–2 分钟。用移液器收集上清液。
    注意：此上清液可弃去，或用于空斑实验8，以测定释放病毒子代的滴度。
  12. 用 250 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，按步骤 1.11 再次离心洗涤。
  13. 移除上清液，加入 80–100 µL 细胞裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，0.5% 十二烷基硫酸钠（SDS），0.5% 脱氧胆酸钠，1% Triton X-100，以及 1× 蛋白酶抑制剂混合物，见材料表）裂解细胞，并涡旋混匀。
  14. 将样品管在 98 °C 加热 10 分钟，以彻底裂解细胞并制备全细胞裂解液。可将裂解液于 4 °C 保存，次日进行步骤 1.15–1.17，但为获得最佳结果，建议当天完成后续操作。
  15. 使用 BCA 蛋白定量试剂盒（见材料表）测定各样品中的蛋白含量。
  16. 采用标准 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）11，上样等量蛋白，并同时加入分子量标记物11，分别分析未感染和感染样本。
  17. 将蛋白转移至硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（见材料表）。
    注意：某些 Western 印迹成像系统中，PVDF 膜可能产生较高背景信号；请预先确认兼容性。
  18. 采用其他文献所述方法进行 Western 印迹实验，检测目标蛋白11。
  19. 比较模拟处理组与抑制剂处理组中感染样本条带的蛋白水平。
    注意：若在半胱天冬酶抑制剂处理的感染样本中蛋白水平恢复，则表明该蛋白被半胱天冬酶切割或降解；否则，其降解途径可能为溶酶体或蛋白酶体。
  20. 通过测量同一次实验至少三次重复中各条带的强度，并以相应上样对照条带进行归一化，定量蛋白恢复水平。
  21. 使用任意现代成像仪及配套软件（见材料表）对 Western 印迹图像进行成像并量化蛋白恢复情况。

2. 通过RNA干扰验证流感病毒A感染细胞中由caspase介导的蛋白质切割或降解

  1. 设计或获取靶向犬或人caspase 3、caspase 6和caspase 7（效应caspase1）的预设计小干扰RNA（siRNA），以及非靶向对照siRNA（参见材料表）。
  2. 通过反向转染法将每种siRNA递送至MDCK或A549细胞中8,11。
  3. 具体操作：在不同的试管中分别加入100 nM的对照siRNA或caspase siRNA，或推荐体积的转染试剂（参见材料表），用100 µL适当培养基（如OptiMEM，参见材料表）稀释，室温孵育5分钟。
  4. 每种稀释液需制备两个重复。
    注意：该重复包括一个用于通过RT-qPCR或蛋白质印迹法（若存在针对caspase的抗体）分析caspase表达敲低效果的重复，以及另一个用于通过蛋白质印迹法评估目标蛋白恢复情况的重复。
  5. 将100 µL每种siRNA溶液与100 µL转染试剂溶液（步骤2.3）混合，室温孵育20–45分钟，以形成siRNA-转染试剂复合物。
  6. 在此期间，将1 × 105个MDCK或A549细胞用800 µL完全生长培养基重悬，加入200 µL siRNA-转染试剂复合物（步骤2.5），混匀后将1 mL细胞悬液加入12孔培养板的一个孔中。此稀释使对照siRNA或caspase siRNA的终浓度为10 nM。
  7. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育72小时。
  8. 按照步骤1.10的方法收集其中一个重复的细胞，并采用标准方法和方案8,11，通过RT-qPCR或蛋白质印迹法分别验证或确认caspase 3、caspase 6和caspase 7表达的敲低效果。
  9. 对另一个重复的细胞，按照步骤1.4–1.9所述方法接种流感A病毒（IAV）（不加抑制剂）。
  10. 24小时后，按照步骤1.10–1.20所述方法收集、处理细胞并进行蛋白质印迹分析，检测并定量目标蛋白的恢复水平。

3. 定点突变法用于定位多肽中caspase切割位点

  1. 将目标蛋白的编码基因克隆至哺乳动物表达质粒中11，或从科研实验室或商业来源获取（参见材料表）。
    注意：建议将基因克隆为带有表位标签或GFP融合的形式，以便在蛋白质印迹（western blotting）过程中区分外源表达的多肽与内源表达的多肽。
  2. 利用caspase底物数据库4或蛋白质序列比对工具，在多肽序列上定位共识的caspase切割基序XXXD和DXXD。几乎所有caspase切割基序在切割位点（P1）均含有天冬氨酸3,4。
  3. 通过定点突变技术将推测的P1位点天冬氨酸突变为谷氨酸或非极性氨基酸（如丙氨酸、缬氨酸），随后采用标准方法和方案进行DNA测序验证11。
  4. 通过反向转染法将野生型（WT）和突变体质粒DNA导入MDCK或A549细胞11。
    1. 分别取2 µg质粒DNA或推荐体积的转染试剂，各自加入100 µL适当培养基中（参见步骤2.3和材料表），于单独的离心管中混匀，室温孵育5分钟。
    2. 将100 µL每种质粒DNA溶液与100 µL转染试剂溶液混合，室温孵育20–45分钟，以形成DNA-转染试剂复合物。
  5. 与此同时，将3 × 105个MDCK或A549细胞接种于800 µL完全生长培养基中，混入200 µL DNA-转染试剂复合物，将1 mL细胞悬液加入12孔培养板的一个孔中。
  6. 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。
  7. 48小时后，按照步骤1.4–1.9所述方法用IAV感染细胞（不添加抑制剂）。
  8. 24小时后，收集细胞，进行处理，并通过蛋白质印迹法分析（如适用，使用针对表位标签或GFP的抗体）。然后按照步骤1.10–1.20所述方法测定并定量蛋白回收情况。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

使用caspase 3抑制剂处理
研究发现，在犬（MDCK）和人（A549、NHBE）细胞中，宿主蛋白cortactin、HDAC4和HDAC6多肽在甲型流感病毒（IAV）感染后会发生降解7,8,9。通过上述方法进一步发现，IAV诱导的宿主caspase（尤其是caspase 3）介导了这些蛋白的降解7,8,9。cortactin的降解呈感染剂量和时间依赖性，且不受宿主细胞类型和IAV毒株的影响7。HDAC48和HDAC69也观察到类似结果。有趣的是，这三种宿主蛋白的降解与病毒核蛋白（...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

已知病毒会改造宿主因子和通路以利于自身。作为应对，宿主细胞则采用多种策略进行抵抗。其中一种策略是PAN凋亡（PANoptosis），宿主细胞利用该机制作为抵抗病毒感染的抗病毒策略。然而，诸如IAV之类的病毒已进化出自身的策略来对抗PAN凋亡，并将其转而为自身所用1,3,6。这种相互作用涉及caspase对多种宿主和病毒蛋白的切割。鉴定这些caspase及其在底物蛋白中的切割位点，对于阐明此类相互作用的机制与意义至关重要。

为此，采用标准的生物化学与分子生物学方法，鉴定宿主蛋白cortactin、HDAC4和HDAC6中caspase的识别及其切割位点7,8,9,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Jennifer Tipper、Bilan Li、Jesse vanWestrienen、Kevin Harrod、Da-Yuan Chen、Farjana Ahmed、Sonya Mros、Kenneth Yamada、Richard Webby、BEI 资源（NIAID）、新西兰健康研究理事会、Maurice 和 Phyllis Paykel 信托基金（新西兰）、H.S. 和 J.C. Anderson 信托基金（达尼丁）、以及奥塔哥大学微生物学与免疫学系和生物医学科学学院。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A549 细胞ATCCCRM-CCL-185人源，上皮细胞，肺组织
氯化铵Sigma-AldrichA9434
半胱天冬酶 3 抑制剂Sigma-Aldrich264156-M又称“InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem”
cOmplete, Mini 蛋白酶抑制剂混合物Roche11836153001
山羊抗 NP 抗体由 Richard Webby（美国孟菲斯圣裘德儿童’s 研究医院）赠予 MH
Lipofectamine 2000 转染试剂ThermoFisher Scientific31985062
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂ThermoFisher Scientific13778150
MDCK 细胞ATCCCCL-34犬源，上皮细胞，肾组织
MG132Sigma-AldrichM7449
最低必需培养基（MEM）ThermoFisher Scientific11095080根据需要添加 L-谷氨酰胺、抗生素或其他补充物
MISSION siRNA 通用阴性对照 #1Sigma-AldrichSIC001
Odyssey Fc 成像仪，配备 Image Studio Lite 软件 5.2 LI-COROdyssey Fc 已被 Odyssey XF 取代，Image Studio Lite 软件已被 Empiria Studio 软件取代。
Pierce BCA 蛋白定量检测试剂盒ThermoFisher Scientific23225
表达人源 cortactin-GFP 融合蛋白的质粒 Addgene50728由 Kenneth Yamada 赠送至 Addgene
预设计的靶向半胱天冬酶 3 的小干扰 RNA（siRNA）Sigma-AldrichNM_004346siRNA 编号：SASI_Hs01_00139105
预设计的靶向半胱天冬酶 6 的小干扰 RNASigma-AldrichNM_001226siRNA 编号：SASI_Hs01_00019062
预设计的靶向半胱天冬酶 7 的小干扰 RNASigma-AldrichNM_001227siRNA 编号：SASI_Hs01_00128361
预设计的 SYBR Green RT-qPCR 引物对Sigma-AldrichKSPQ12012引物对编号：H_CASP3_1；H_CASP6_1；H_CASP7_1
Protran Premium 硝酸纤维素膜Cytiva（原 GE Healthcare）10600003
兔抗肌动蛋白抗体Abcamab8227
兔抗 cortactin 抗体Cell Signaling3502
兔抗 GFP 抗体Takara632592
SeeBlue 预染蛋白质标准品ThermoFisher ScientificLC5625
转染用培养基 Opti-MEMThermoFisher Scientific11668019
Tris-HCl、NaCl、SDS、脱氧胆酸钠、Triton X-100Merck
经 TPCK 处理的胰蛋白酶Sigma-Aldrich4370285

参考文献

  1. Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
  2. Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
  3. Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
  4. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
  5. Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
  6. Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
  7. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
  8. Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
  9. Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
  10. Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
  11. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87(2020).
  12. Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
  13. Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
  14. Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
  15. Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940(2019).
  16. Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277(2012).
  17. Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421(2015).
  18. Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  19. Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539(2014).
  20. Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
  21. Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
  22. Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).
  23. Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
  24. Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

Caspase Caspase RNA PANoptosis
鉴定在甲型流感病毒感染过程中切割蛋白质的半胱天冬酶及其基序
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。