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方法文章

完整斑马鱼胚胎中正常与异常胞嘧啶甲基化的快速高效时空监测

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DOI：

10.3791/64190

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2022年8月18日

 , 
1Department of Environmental Sciences, University of California, Riverside

本文内容

摘要

本文介绍了一种在完整斑马鱼胚胎中对正常和异常胞嘧啶甲基化进行快速、高效时空监测的实验方案。

摘要

胞嘧啶甲基化在脊椎动物物种间高度保守，作为表观遗传编程和染色质状态的关键驱动因素，在早期胚胎发育中发挥重要作用。酶促修饰可将胞嘧啶主动甲基化为5-甲基胞嘧啶（5-mC），并进一步将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。表观遗传重编程是发育过程中的一个关键时期 在子宫内 发育过程中，母体暴露于化学物质可能重新编程子代的表观基因组，从而可能导致不良后果，例如即时的表型效应、成年期疾病易感性的长期影响，以及可遗传表观遗传标记的跨代效应。尽管基于亚硫酸氢盐的测序技术能够使研究人员在碱基对分辨率上检测胞嘧啶甲基化，但基于测序的方法成本高昂，因此难以用于监测不同发育阶段、每种化学物质多个浓度梯度以及每种处理条件下多个胚胎重复样本中的胞嘧啶甲基化情况。由于自动化操作简便 体内 成像，基因操作，快速 子宫外 发育时间以及胚胎发生期间的饲养条件，斑马鱼胚胎仍被广泛用作生理结构完整的模型，以揭示外源性物质介导并导致早期胚胎发育不良结局的通路。因此，利用 commercially available 5-mC 特异性抗体，我们描述了一种经济高效的方法，通过结合整体免疫组织化学染色、自动化高内涵成像以及在统计分析前使用编程语言进行高效数据处理，实现对单个完整斑马鱼胚胎中胞嘧啶甲基化时空动态的快速、有效监测。据目前所知，该方法是首个成功检测并定量 5-mC 水平的 原位 在斑马鱼胚胎早期发育过程中检测DNA甲基化。该方法能够检测细胞团中的DNA甲基化，同时可在母源-合子转换期间检测定位于卵黄的母源mRNA中的胞嘧啶甲基化。总体而言，该方法将有助于快速鉴定可能干扰胞嘧啶甲基化的化学物质。 原位 在表观遗传重编程过程中。

引言

酶促修饰介导胞嘧啶主动甲基化为5-甲基胞嘧啶（5-mC），并进一步将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶1,2三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯（TDCIPP）是一种在美国广泛使用的阻燃剂，先前已证明其在受精后0.75小时（hpf）至早期原肠胚形成阶段（6 hpf）的胚胎早期暴露可改变胞嘧啶甲基化的动态过程。3,4,5,6,7,8在脊椎动物中，5-甲基胞嘧啶（5-mC）及其修饰衍生物对调控早期胚胎发育至关重要9胚胎受精会触发亲本DNA的去甲基化，随后发生母源mRNA降解、合子基因组激活以及合子基因组的重新甲基化。9利用胞嘧啶甲基化的生物学相关过程包括组蛋白修饰、转录机器的招募、RNA甲基化、表观遗传重编程以及染色质结构的决定10,11胞嘧啶甲基化在脊椎动物物种间也具有保守性，凸显了理解与研究异常的胞嘧啶甲基化如何影响生物体发育进程的重要性11此外， 在子宫内 发育对母体暴露敏感，可能导致不良后果，例如即时的表型效应、对成年期疾病易感性的长期影响，以及表观遗传标记的跨代遗传效应12,13,14.

长片段的胞嘧啶-鸟嘌呤配对序列，即CpG岛，一直是研究人员关注的重点，旨在表征全基因组范围内胞嘧啶甲基化的动态变化15,16,17。基于亚硫酸氢盐的策略，如全基因组亚硫酸氢盐测序、简化基因组亚硫酸氢盐测序和亚硫酸氢盐扩增子测序，是实现单碱基分辨率下胞嘧啶甲基化检测的金标准。然而，基于测序的方法成本高昂，因此难以用于监测发育不同阶段、每种化学物质多个浓度梯度以及每种处理条件下多个重复胚胎中的胞嘧啶甲基化状态。此外，基于测序的方法无法提供空间定位信息，而这一信息对于理解发育中胚胎内可能受影响的细胞类型和区域至关重要。类似地，全局DNA甲基化检测方法，如依赖甲基化的限制性酶切分析、5-甲基胞嘧啶（5-mC）酶联免疫吸附测定（ELISAs）以及5-甲基-2'-脱氧胞苷（5-mC）液相色谱-质谱联用（LC-MS），均依赖于细胞或组织匀浆样本，因此无法在完整样本中实现对胞嘧啶甲基化在时空维度上的定位与程度监测12,18。

由于自动化操作的简便性 体内 成像，遗传操作，快速 子宫外 发育时间及胚胎发生期间的饲养管理，斑马鱼胚胎因其生理完整性，仍被广泛用作揭示外源性物质介导的、导致早期胚胎发育不良结局的信号通路的模型。因此，本方案利用市售的5-mC特异性抗体，结合整体免疫组织化学（IHC）、自动化高内涵成像以及在统计分析前使用编程语言进行高效数据处理，描述了一种经济高效的方法，用于对单个完整的斑马鱼胚胎中胞嘧啶甲基化的时空动态进行快速、高效的监测。

据目前所知，该方法是首个可在完整斑马鱼胚胎内监测5-甲基胞嘧啶（5-mC）的方法。该方法能够检测细胞团内的DNA甲基化，同时还能检测母源mRNA在卵黄定位区域的胞嘧啶甲基化，尤其是在母源-合子转换期间。总体而言，该方法将有助于快速鉴定可能干扰胞嘧啶甲基化的化学物质 原位 在表观遗传重编程过程中。

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方案

成年繁殖个体的处理和操作均依照加州大学河滨分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的动物使用方案（编号：20180063）进行。

1. 斑马鱼胚胎采集与化学暴露

  1. 将缸内繁殖陷阱加入含有性成熟且具有生殖能力的成年雄性和雌性斑马鱼的鱼缸中。每个6 L的鱼缸至少加入三个陷阱，并在收集前至少12小时（约上午9:00）放置，此时为鱼缸内卵子受精和产卵的大致时间。
  2. 在收集当天早晨配制新鲜的暴露溶液。使用5 mL移液器将5.0 mL无颗粒的系统水加入一个60 mm玻璃培养皿中来配制暴露溶液。
  3. 然后使用10 µL玻璃微量毛细管移液器，将10 µL溶剂（二甲基亚砜，DMSO）或化学储备液转移至玻璃培养皿中的系统水中。
  4. 轻轻旋转玻璃培养皿，确保储备液充分扩散。再向玻璃培养皿中加入5.0 mL系统水，再次旋转培养皿以使暴露溶液均匀混合。
  5. 对每个处理组重复上述操作，设置四次重复，每个处理组获得四个重复样本。
  6. 暴露溶液配制完成后，用玻璃盖盖住玻璃培养皿，以尽量减少蒸发。
  7. 从每个鱼缸中取出繁殖陷阱时，应小心让陷阱内的水先排回鱼缸后再取出，确保陷阱始终保持正立状态。
  8. 将繁殖陷阱转移至实验台水槽，使用装有反渗透（RO）水的冲洗瓶，通过先前用10%次氯酸钠溶液浸泡并用水冲洗过的滤网对陷阱进行冲洗。冲洗胚胎直至所有碎片被清除，仅留下干净的胚胎。
  9. 使用装有RO水的冲洗瓶将滤网中的胚胎转移至一个100 mm塑料培养皿中。在受精后0.75小时（hpf）随机挑选50个存活胚胎，并去除多余的RO水。
  10. 使用微型刮铲将分选好的胚胎放入处理溶液中。所有胚胎必须在上午9:45或之后进入溶剂或处理溶液中。轻轻旋转玻璃培养皿，确保胚胎在处理溶液中均匀分布。
  11. 每个处理组设置四个重复培养皿（每重复N = 50），完成后盖上玻璃盖，将所有培养皿转移至温度控制在28 °C的培养箱中，孵育至2 hpf、4 hpf、6 hpf、8 hpf或10 hpf。
  12. 在终止暴露前至少4小时配制新鲜的4%多聚甲醛（PFA），并在4 °C保存。
    1. 将加热板调至115 °C，在50 mL离心管中配制20 mL 1x磷酸盐缓冲液（PBS）（2 mL 10x PBS + 18 mL RO水），并称取800 mg多聚甲醛。
    2. 在化学通风橱内，将1x PBS溶液转移至250 mL锥形瓶中，加入800 mg多聚甲醛，再加入2 µL 10 N NaOH。将温度计插入瓶中，将锥形瓶置于加热板上，边搅拌边监测温度。
    3. 当温度达到62–65 °C时，立即将4% PFA从加热板上取下，静置冷却至室温（RT）。将4% PFA储存于4 °C。
  13. 暴露时间结束后，将胚胎从培养箱中取出，将所有存活胚胎转移至1.5 mL微量离心管中。使用1 mL移液器吸除残留的暴露溶液，注意不要吸走任何胚胎。
  14. 向1.5 mL微量离心管中加入500 µL预冷的4% PFA，通过反复倒置混匀胚胎与4% PFA。让胚胎在4% PFA中固定过夜。
    ​注意：不建议让胚胎在PFA中固定超过12小时。

2. 胚胎去壳

  1. 次日，吸除4% PFA，将胚胎重悬于1× PBS中，轻轻吹打30秒。如有需要，可在本步骤暂停实验流程，并将胚胎置于4 °C的1× PBS中保存最多48小时。
  2. 使用塑料移液管，小心地将固定后的胚胎转移至盛有反渗水（RO水）的玻璃培养皿中，轻轻晃动30秒。重复此步骤一次。
  3. 在体视显微镜下使用5.0倍放大倍率，用注射器针头手动去除所有胚胎的卵膜。操作时用针尖刺破卵膜，然后轻轻将其从卵黄和细胞团上剥离4。
  4. 胚胎去膜完成后，使用玻璃微量移液管将最多25个完整胚胎转移至一个免疫组化（IHC）篮中，并将IHC篮放入96孔板内。使用1 mL移液器吸除每孔中的反渗水。

3. 使用5-mC特异性抗体进行免疫组织化学

  1. 每孔加入 500 µL 封闭缓冲液（1x PBST + 2% 羊血清 + 2 mg/mL 牛血清白蛋白），重悬胚胎，并用封口膜和铝箔纸包裹培养板以避光。在 4 °C、100 rpm 的摇床上孵育 4 小时。
  2. 移除封口膜和铝箔纸，使用 1 mL 移液器从每孔中吸除封闭缓冲液。每孔加入 500 µL 用封闭缓冲液按 1:100 稀释的单克隆小鼠抗 5-mC 抗体。除一部分溶剂对照胚胎仅加入封闭缓冲液以消除背景噪声外，其余所有胚胎均与一抗共同孵育。此步骤中需小心操作，避免破坏胚胎完整性或吸出胚胎。
  3. 重新用封口膜和铝箔纸包裹培养板，在 4 °C、100 rpm 的摇床上避光过夜孵育。
  4. 次日，从每孔中移除一抗溶液，替换为 1x PBS + 0.1% Tween-20（1x PBST）。在摇床（100 rpm）上用 1x PBST 每次洗涤 15 分钟，共洗涤三次。
  5. 将 1x PBST 替换为用封闭缓冲液按 1:500 稀释的山羊抗小鼠 IgG 二抗溶液，所有胚胎均与二抗共同孵育。将培养板置于 4 °C、100 rpm 的摇床上过夜孵育。
  6. 次日，移除二抗溶液，在摇床（100 rpm）上用 1x PBST 每次洗涤 15 分钟，共洗涤三次。
    注意：若将 IHC 篮置于盛有 1x PBS 的洁净孔中保存，本方案可在此处暂停最多 48 小时。
  7. 使用 1 mL 移液器从每孔中吸除 1x PBST，将 IHC 篮转移至盛有反渗水（RO 水）的玻璃培养皿中。在标准体视显微镜下，将完整胚胎随机分选至 96 孔板中，每孔一个胚胎。
  8. 使用 1 mL 移液器从各个孔中完全移除 RO 水，每孔加入 200 µL 1x PBS。将培养板以 1 × g 离心 3 分钟。

4. 在96孔板内对胚胎进行自动化成像

  1. 使用高内涵筛选系统（材料表），在透射光和FITC通道下，以2倍物镜对胚胎进行成像。
    注意：使用上述放大倍数和FITC滤光片，可自动获取每个胚胎的荧光图像19。
    1. 选择自动对焦，以确保相机焦点位于孔板底部，并根据底部厚度进行偏移。
    2. 选择FITC波长，曝光时间为100 ms，并将自动对焦设置为激光模式并设定Z轴偏移量。在开始整板成像前，应先观察多个孔，确认图像采集正常。
      注意：仪器将自动采集所有选定孔中胚胎的图像。一张96孔板的图像采集和数据存储过程约需30分钟。在采集期间，成像系统的内部温度维持在室温（RT）。
  2. 完成图像采集后，使用高内涵筛选系统及自定义的自动化图像分析流程进行数据分析。在96孔板上选择每个待分析的胚胎，测量其总面积和荧光积分强度。
    注意：分析结果包括显示分析所得数据点叠加图的图像。
  3. 随后，通过进入测量菜单并选择打开数据日志，将数据点整理成表格并导出至电子表格中。板上成像采集与数据分析流程如图1所示。

5. 数据分析

  1. 将导出的电子表格上传至计算机程序，使用部署包（dplyr）对每个孔的数据进行排序、汇总，并按孔号进行筛选。然后使用 writexl 包将汇总后的数据导出为电子表格。5mC 程序代码见补充文件 1。

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结果

本实验方案的总体目标是通过评估固定并标记的斑马鱼胚胎中荧光的总面积和相对强度，来确定某种处理是否影响5-mC的相对丰度。完成实验方案后，可使用荧光体视显微镜首先判断整体免疫组化（IHC）是否成功。当在FITC或GFP滤光片下观察标记的胚胎时，若胚胎内出现阳性FITC信号，则表明结果为阳性；而对照组胚胎内无荧光信号则表明结果为阴性。此外，使用高内涵筛选系统，在图像采集过程中通过FITC滤光片也可验证这些结果。在数据分析阶段，自定义模块将识别并量化荧光的总面积和总荧光强度。成功结果的代表性图像如图1所示，其中采集的图像已被自定义模块成功测量，并分别对总面积和总荧光强度获取了单个数据点（以蓝色叠加显示）。

在数据提取过程中，自定义模块内的阈值严格程度是一个需要优化的额外变量，以最大化信噪比，并提高检测到5-mC丰度治疗特异性差异的显著性的概率。在优化过程中，该最终阈值提供了对照组与处理组中位数之间最显著的分离（例如，最大的信噪比）。不同自定义模块阈值下影响信噪比的代表性结果如图2

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讨论

在本实验方案中，有几个步骤至关重要。首先，在去除胚胎的卵膜时，应将针头朝向远离胚胎组织/卵黄囊/细胞团的方向，因为发育中胚胎的这些部分非常脆弱，容易被刺破。其次，在将标记的胚胎转移至各个孔中时，应使用玻璃移液器进行转移，因为胚胎会黏附在塑料移液器上。第三，在进行整体免疫组织化学染色（whole-mount IHC）时，需确保将培养板避光保存。最后，在完成整体免疫组织化学染色步骤后，应将培养板在4 °C条件下于1×PBS中孵育过夜，再进行成像，以最大限度减少可能干扰成像的自发荧光。

如果在去卵丘或免疫组化过程中有胚胎被切断，应将这些胚胎从后续实验步骤中剔除。如果未检测到荧光信号，可通过延长孵育时间（最长可达16小时）来解决。由于该抗体特异性识别5-甲基胞嘧啶（5-mC），因此DNA和RNA均可能被标记。对空间定位的总体理解非常重要。

该方法存在一些局限性。首先，它是一种非靶向性技术，意味着无法提供5-mC的精确含量，而只能基于荧光的总面积和积分强度来反映其相对丰度。此外，该方案目前仅在体节形成前的胚胎中进行过测试，因此若用于检测...

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了加州大学河滨分校研究生院向 SAB 提供的研究生奖学金、NRSA T32 培训项目奖学金（T32ES018827）向 SAB 提供的支持，以及美国国立卫生研究院基金（R01ES027576）和美国农业部国家食品与农业研究所哈奇项目（1009609）向 DCV 提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管Fisher Scientific540225
10-µL 玻璃毛细吸管Fisher Scientific211762B
100 mm 塑料培养皿Fisher Scientific08757100D
10× 磷酸盐缓冲液 Fisher ScientificBP399500
1 mL 移液器 Fisher Scientific13690032
250 mL 锥形瓶Fisher ScientificFB501250
5 mL 移液器Fisher Scientific13690033
带盖 60 mm 玻璃培养皿Fisher Scientific08747A
96 孔板Fisher Scientific720089
AlexaFluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体 Fisher ScientificA21121
牛血清白蛋白Fisher ScientificBP67110
DMSOFisher ScientificBP2311
加热板 Fisher Scientific1110016SH
水箱内繁殖陷阱Aquatic HabitatsN/A由于 Pentair 收购了 Aquatic Habitats，该产品已不再供应。  研究人员可使用来自多个供应商的标准离体繁殖用培养缸。
ImageXpress Micro XLS 宽场高内涵筛选系统Molecular DevicesN/A任何配备透射光和 FITC 滤光片的高内涵筛选系统均可适用。
免疫化学（IHC）篮N/AN/A由实验室自制，使用去除锥形部分并在底部安装网筛的微量离心管制成，适用于 24 孔或 48 孔板。
MetaXpress 6.0.3.1658 Molecular DevicesN/A任何能够定量荧光总面积和积分强度的软件均可适用。
微型刮铲Fisher Scientific2140115
单克隆小鼠抗 5-mC 抗体Millipore SigmaMABE146
NaOHFisher ScientificBP359-500
轨道摇床 Fisher Scientific50998290
Parafilm Fisher Scientific1337412
多聚甲醛 Fisher Scientific18612139
塑料移液管Fisher Scientific1368050
RstudioRStudioN/ARStudio 是开源软件，可在 https://www.rstudio.com 下载。
绵羊血清Millipore SigmaS3772-5ML
体视显微镜Leica10450103
温控培养箱 Fisher ScientificPR505755L
Tween-20 Fisher ScientificP7949-500ML

参考文献

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