完整斑马鱼胚胎中正常与异常胞嘧啶甲基化的快速高效时空监测

摘要

本文介绍了一种在完整斑马鱼胚胎中对正常和异常胞嘧啶甲基化进行快速、高效时空监测的实验方案。

摘要

胞嘧啶甲基化在脊椎动物物种间高度保守，作为表观遗传编程和染色质状态的关键驱动因素，在早期胚胎发育中发挥重要作用。酶促修饰可将胞嘧啶主动甲基化为5-甲基胞嘧啶（5-mC），并进一步将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。表观遗传重编程是发育过程中的一个关键时期 在子宫内 发育过程中，母体暴露于化学物质可能重新编程子代的表观基因组，从而可能导致不良后果，例如即时的表型效应、成年期疾病易感性的长期影响，以及可遗传表观遗传标记的跨代效应。尽管基于亚硫酸氢盐的测序技术能够使研究人员在碱基对分辨率上检测胞嘧啶甲基化，但基于测序的方法成本高昂，因此难以用于监测不同发育阶段、每种化学物质多个浓度梯度以及每种处理条件下多个胚胎重复样本中的胞嘧啶甲基化情况。由于自动化操作简便 体内 成像，基因操作，快速 子宫外 发育时间以及胚胎发生期间的饲养条件，斑马鱼胚胎仍被广泛用作生理结构完整的模型，以揭示外源性物质介导并导致早期胚胎发育不良结局的通路。因此，利用 commercially available 5-mC 特异性抗体，我们描述了一种经济高效的方法，通过结合整体免疫组织化学染色、自动化高内涵成像以及在统计分析前使用编程语言进行高效数据处理，实现对单个完整斑马鱼胚胎中胞嘧啶甲基化时空动态的快速、有效监测。据目前所知，该方法是首个成功检测并定量 5-mC 水平的 原位 在斑马鱼胚胎早期发育过程中检测DNA甲基化。该方法能够检测细胞团中的DNA甲基化，同时可在母源-合子转换期间检测定位于卵黄的母源mRNA中的胞嘧啶甲基化。总体而言，该方法将有助于快速鉴定可能干扰胞嘧啶甲基化的化学物质。 原位 在表观遗传重编程过程中。

引言

酶促修饰介导胞嘧啶主动甲基化为5-甲基胞嘧啶（5-mC），并进一步将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶^1,2三(1,3-二氯-2-丙基)磷酸酯（TDCIPP）是一种在美国广泛使用的阻燃剂，先前已证明其在受精后0.75小时（hpf）至早期原肠胚形成阶段（6 hpf）的胚胎早期暴露可改变胞嘧啶甲基化的动态过程。^3,4,5,6,7,8在脊椎动物中，5-甲基胞嘧啶（5-mC）及其修饰衍生物对调控早期胚胎发育至关重要⁹胚胎受精会触发亲本DNA的去甲基化，随后发生母源mRNA降解、合子基因组激活以及合子基因组的重新甲基化。⁹利用胞嘧啶甲基化的生物学相关过程包括组蛋白修饰、转录机器的招募、RNA甲基化、表观遗传重编程以及染色质结构的决定^10,

方案

成年繁殖个体的处理和操作均依照加州大学河滨分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的动物使用方案（编号：20180063）进行。

1. 斑马鱼胚胎采集与化学暴露

1. 将缸内繁殖陷阱加入含有性成熟且具有生殖能力的成年雄性和雌性斑马鱼的鱼缸中。每个6 L的鱼缸至少加入三个陷阱，并在收集前至少12小时（约上午9:00）放置，此时为鱼缸内卵子受精和产卵的大致时间。
2. 在收集当天早晨配制新鲜的暴露溶液。使用5 mL移液器将5.0 mL无颗粒的系统水加入一个60 mm玻璃培养皿中来配制暴露溶液。
3. 然后使用10 µL玻璃微量毛细管移液器，将10 µL溶剂（二甲基亚砜，DMSO）或化学储备液转移至玻璃培养皿中的系统水中。
4. 轻轻旋转玻璃培养皿，确保储备液充分扩散。再向玻璃培养皿中加入5.0 mL系统水，再次旋转培养皿以使暴露溶液均匀混合。
5. 对每个处理组重复上述操作，设置四次重复，每个处理组获得四个重复样本。
6. 暴露溶液配制完成后，用玻璃盖盖住玻璃培养皿，以尽量减少蒸发。
7. 从每个鱼缸中取出繁殖陷阱时，应小心让陷阱内的水先排回鱼缸后再取出，确保陷阱始终保持正立状态。
8. 将繁殖陷阱转移至实验台水槽，使用装有反渗透（RO）水的冲洗瓶，通过先前用10%次氯酸钠溶液浸泡并用水冲洗过的滤网对陷阱进行冲洗。冲洗胚胎直至....

结果

本实验方案的总体目标是通过评估固定并标记的斑马鱼胚胎中荧光的总面积和相对强度，来确定某种处理是否影响5-mC的相对丰度。完成实验方案后，可使用荧光体视显微镜首先判断整体免疫组化（IHC）是否成功。当在FITC或GFP滤光片下观察标记的胚胎时，若胚胎内出现阳性FITC信号，则表明结果为阳性；而对照组胚胎内无荧光信号则表明结果为阴性。此外，使用高内涵筛选系统，在图像采集过程中通过FITC滤光片也可验证这些结果。在数据分析阶段，自定义模块将识别并量化荧光的总面积和总荧光强度。成功结果的代表性图像如图1所示，其中采集的图像已被自定义模块成功测量，并分别对总面积和总荧光强度获取了单个数据点（以蓝色叠加显示）。

在数据提取过程中，自定义模块内的阈值严格程度是一个需要优化的额外变量，以最大化信噪比，并提高检测到5-mC丰度治疗特异性差异的显著性的概率。在优化过程中，该最终阈值提供了对照组与处理组中位数之间最显著的分离（例如，最大的信噪比）。不同自定义模块阈值下影响信噪比的代表性结果如图2

讨论

在本实验方案中，有几个步骤至关重要。首先，在去除胚胎的卵膜时，应将针头朝向远离胚胎组织/卵黄囊/细胞团的方向，因为发育中胚胎的这些部分非常脆弱，容易被刺破。其次，在将标记的胚胎转移至各个孔中时，应使用玻璃移液器进行转移，因为胚胎会黏附在塑料移液器上。第三，在进行整体免疫组织化学染色（whole-mount IHC）时，需确保将培养板避光保存。最后，在完成整体免疫组织化学染色步骤后，应将培养板在4 °C条件下于1×PBS中孵育过夜，再进行成像，以最大限度减少可能干扰成像的自发荧光。

如果在去卵丘或免疫组化过程中有胚胎被切断，应将这些胚胎从后续实验步骤中剔除。如果未检测到荧光信号，可通过延长孵育时间（最长可达16小时）来解决。由于该抗体特异性识别5-甲基胞嘧啶（5-mC），因此DNA和RNA均可能被标记。对空间定位的总体理解非常重要。

该方法存在一些局限性。首先，它是一种非靶向性技术，意味着无法提供5-mC的精确含量，而只能基于荧光的总面积和积分强度来反映其相对丰度。此外，该方案目前仅在体节形成前的胚胎中进行过测试，因此若用于检测.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	Fisher Scientific	540225
10-µL 玻璃毛细吸管	Fisher Scientific	211762B
100 mm 塑料培养皿	Fisher Scientific	08757100D
10× 磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP399500
1 mL 移液器	Fisher Scientific	13690032
250 mL 锥形瓶	Fisher Scientific	FB501250
5 mL 移液器	Fisher Scientific	13690033
带盖 60 mm 玻璃培养皿	Fisher Scientific	08747A
96 孔板	Fisher Scientific	720089
AlexaFluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体	Fisher Scientific	A21121
牛血清白蛋白	Fisher Scientific	BP67110
DMSO	Fisher Scientific	BP2311
加热板	Fisher Scientific	1110016SH
水箱内繁殖陷阱	Aquatic Habitats	N/A	由于 Pentair 收购了 Aquatic Habitats，该产品已不再供应。  研究人员可使用来自多个供应商的标准离体繁殖用培养缸。
ImageXpress Micro XLS 宽场高内涵筛选系统	Molecular Devices	N/A	任何配备透射光和 FITC 滤光片的高内涵筛选系统均可适用。
免疫化学（IHC）篮	N/A	N/A	由实验室自制，使用去除锥形部分并在底部安装网筛的微量离心管制成，适用于 24 孔或 48 孔板。
MetaXpress 6.0.3.1658	Molecular Devices	N/A	任何能够定量荧光总面积和积分强度的软件均可适用。
微型刮铲	Fisher Scientific	2140115
单克隆小鼠抗 5-mC 抗体	Millipore Sigma	MABE146
NaOH	Fisher Scientific	BP359-500
轨道摇床	Fisher Scientific	50998290
Parafilm	Fisher Scientific	1337412
多聚甲醛	Fisher Scientific	18612139
塑料移液管	Fisher Scientific	1368050
Rstudio	RStudio	N/A	RStudio 是开源软件，可在 https://www.rstudio.com 下载。
绵羊血清	Millipore Sigma	S3772-5ML
体视显微镜	Leica	10450103
温控培养箱	Fisher Scientific	PR505755L
Tween-20	Fisher Scientific	P7949-500ML