本文介绍了一种检测产硫化氢细菌的实验方案，该方法基于用于硫化铋（BS）沉淀的改良方案。本方法的主要优势在于操作简便、易于评估，且无需使用专业设备。
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本文内容
摘要
摘要
硫化氢（H2S）是一种由细菌在含硫氨基酸和蛋白质的蛋白水解过程中产生的有毒气体，在人体健康中发挥着重要作用。H2S 产生试验是重要的细菌生化鉴定试验之一。传统方法不仅繁琐且耗时，而且由于含硫培养基中重金属盐的毒性作用容易抑制细菌生长，常导致假阴性结果。本文建立了一种检测细菌中 H2S 的简便且灵敏的方法。该方法是对硫化铋（BS）沉淀法的改进，采用 96 孔透明微量滴定板进行操作。将细菌培养物与含 L-半胱氨酸的铋溶液混合后孵育 20 分钟，即可观察到黑色沉淀。该方法对 H2S 的目视检测限为 0.2 mM。基于明显的颜色变化，可实现对产 H2S 细菌的简单、高通量、快速检测。综上所述，该方法可用于鉴定细菌是否产生 H2S。
引言
产生硫化氢的细菌能够利用含硫氨基酸和蛋白质生成硫化氢（H2S）。H2S的产生通常发生在革兰氏阴性肠杆菌科细菌中，也见于 Citrobacter spp.、Proteus spp.、Edwardsiella spp. 和 Shewanella spp.1 等菌属成员。这些细菌能够将硫酸盐还原为硫化氢（H2S）以获取能量。硫化氢已被证实与细菌耐药性的形成有关。H2S可通过保护细菌免受活性氧（ROS）毒性的损伤，从而拮抗抗生素的抗菌作用2,3。H2S在维持机体稳态方面也具有重要的生理作用。当浓度超过生理水平时，H2S会对机体产生显著毒性。在人体内，H2S还作为一种气体信号分子，参与多种生理和病理过程。H2S可调节心脏的收缩功能，在血管舒张、抑制血管重塑及心肌保护方面发挥重要的生理作用4,5。H2S在调节神经系统和消化道功能方面也具有重要作用6,7。研究发现，当细菌暴露于杀菌性抗生素时，会产生致死性的活性氧（ROS），导致细胞死亡8,9,10,11。
作为一种微生物学实验课程中常见的生化试验，硫化氢试验是细菌鉴定的重要实验，尤其适用于肠杆菌科细菌的鉴定。目前，硫化氢试验通常通过将待测细菌接种于含大量含硫氨基酸和醋酸铅的培养基中进行。经过一段时间的培养（2–3天）后，通过观察培养基或醋酸铅试纸条是否因生成硫化铅而变黑来判断结果。11然而，这些传统方法不仅繁琐且耗时，而且由于含硫培养基中重金属盐的毒性作用，容易抑制细菌生长，常导致假阴性结果。一种基于铋的检测方法已建立，用于检测 H2S12,13H2S 可与铋反应，形成黑色的硫化铋沉淀。为了对该生化试验进行改进，需要建立一种简单快速且对细菌生长无副作用的方法。本文建立了一种检测产氢硫化物细菌的简易方法，适用于在培养基中生长的细菌 体外 在96孔微孔板中以硫化铋为底物的环境中
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方案
1. 细菌菌株
注意：本实验使用了九种标准菌株，包括Salmonella paratyphi A、Salmonella paratyphi B、Fusobacterium nucleatum、Enterococcus faecalis、Staphylococcus aureus、Pseudomonas aeruginosa PAO1、Aeromonas hydrophila YJ-1、Proteus vuigaris 和 Klebsiella pneumoniae（表1）。根据以往文献报道1，Salmonella paratyphi A、Fusobacterium nucleatum、Pseudomonas aeruginosa 和 Proteus vuigaris 能够产生 H2S。
- 细菌培养物的制备
- 从Luria-Bertani（LB）琼脂平板中挑取一环甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi A）、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi B）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）、嗜水气单胞菌YJ-1（Aeromonas hydrophila YJ-1）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），接种于100 mL LB液体培养基中，于37 °C培养12–16小时，直至菌液浓度约为1 × 109 个细胞/mL（以OD600 = 1为指示）。
- 从胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）琼脂平板中挑取一环核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）和普通变形杆菌（Proteus vuigaris），接种于100 mL TSB液体培养基中，在37 °C厌氧条件下培养24小时，直至菌液浓度约为1 × 109 个细胞/mL（以OD600 = 1为指示）。
2. H2S蛋白检测实验
- 硫化氢产生试验
- 在96孔微孔板中，将100 µL细菌培养物与100 µL新配制的铋溶液（pH 8.0；10 mM 三氯化铋、0.4 M 三乙醇胺盐酸盐、20 mM 吡哆醛-5'-磷酸一水合物、20 mM EDTA 和 40 mM L-半胱氨酸）混合，并在37 °C下培养20分钟。每种细菌菌株均需设三个重复样本进行分析。
- 20分钟后，观察颜色变化。若溶液颜色由浅黄色变为黑色，则表明该细菌能够产生H2S。此检测需重复三次。
- 方法的灵敏度
- 使用不同浓度的硫氢化钠（NaHS）：2 mM、1 mM、0.8 mM、0.6 mM、0.4 mM、0.2 mM、0.1 mM 和 0 mM，与BS溶液混合，以测定该方法的灵敏度14。
- 通过观察是否形成黑色BS沉淀来判断HS−/S2−的存在。采用视觉评分法对各孔颜色进行评分，评分标准从无颜色产生（-）到最深黑色产生（++++++）。
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结果
检测产硫化氢细菌
H的性能2S试验采用所列的选定细菌菌株的纯培养物进行研究，如以下所示： 表1结果表明 副伤寒沙门菌 B, 梭杆菌属 具核梭杆菌，粪肠球菌，铜绿假单胞菌，和 普通变形杆菌 能产生 H2S 伴有黑色 BS 沉淀，而 副伤寒沙门菌 A, 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌，嗜水气单胞菌，以及 肺炎克雷伯菌 未观察到任何黑色沉淀。最快的 H2S的生成被观察到 具核梭杆菌 nucleatum，达到最大显色程度（图1).
方法的灵敏度
通过将不同浓度的硫氢化钠（NaHS）与BS溶液混合，确定了该方法的灵敏度。目视观察显示，随着HS−/S
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讨论
硫化氢产生试验是用于细菌菌株鉴定与区分的传统表型试验之一。许多细菌种类可在其自然环境中（如水生环境）产生硫化氢。这些细菌包括Salmonella sp.、Citrobacter sp.、Proteus sp.、Pseudomonas sp.、某些Klebsiella sp.菌株、Escherichia coli以及某些厌氧梭菌（Clostridia）物种15,16。然而，传统H2S试验方法的灵敏度较低，且耗时较长17,18。传统的H2S试验培养基中含有醋酸铅（PbAc），该成分对细菌生长具有毒性作用，且培养物需穿刺接种至半固体琼脂中。培养基下层的氧气含量较低，导致需氧菌生长不良，因此常出现假阴性结果。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由江苏省高校优势学科建设工程（PAPD）和中国药科大学教学改革研究项目（2019XJYB18）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三氯化铋 | 上海麦克林生化科技有限公司 | 7787-60-2 | |
| EDTA | 南京化学试剂股份有限公司 | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-半胱氨酸 | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| 三乙醇胺盐酸盐 | 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 | 637-39-8 |
参考文献
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