本文提出了一种新一代的多参数分析平台，可提高细胞外囊泡亚群表征的通量。该方法结合了多重生物传感技术与原子力显微镜的计量学和形貌力学分析，并耦合拉曼光谱，用于对捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标进行定性分析。
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摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞产生的一类膜源性微小囊泡，直径范围从50到数百纳米不等，是细胞间通讯的重要媒介。它们正逐渐成为多种疾病诊断和治疗的有前景工具。细胞通过两种主要的生物发生途径产生EVs，这些EVs在大小、组成和内容物上存在差异。由于其在尺寸、组成及细胞来源方面的高度复杂性，对EVs的表征需要结合多种分析技术。本项目旨在开发新一代高通量多参数分析平台，用于EVs亚群的表征。为实现这一目标，研究基于课题组已建立的纳米生物分析平台（NBA），该平台通过将多重生物传感方法与原子力显微镜（AFM）对微阵列生物芯片上捕获的囊泡目标进行的计量学和形貌力学分析相结合，实现了对EVs的创新性研究。本工作的目标是进一步结合拉曼光谱技术，对EVs进行表型和分子水平的分析。这些技术发展使得能够提出一种多模态且易于使用的分析解决方案，用于临床相关生物液体中EV亚群的区分。
引言
外泌体（EV）研究在诊断和治疗领域的日益受关注1,2,3,4,5，加之该领域所面临的挑战，促使研究人员开发并应用了多种用于定量或表征这些囊泡的方法和技术。目前最常用的EV鉴定方法包括：通过蛋白质特异性免疫印迹和蛋白质组学分析来确认EV的来源，利用透射电子显微镜（TEM）观察其结构，以及采用纳米颗粒追踪分析（NTA）对样本体积中EV的数量及其粒径分布进行定量。
然而，这些技术单独使用时均无法提供表征细胞外囊泡（EV）亚群所需的全部信息。由于EV在生化和物理特性上的多样性，其本身具有高度异质性，这阻碍了对EV（尤其是混合物中的EV，即粗样品）进行可靠且可重复的全局分析。因此，亟需针对EV的检测与表征方法，既能用于单个EV的分析，也能用于总体表征，以补充其他虽快速但缺乏选择性的方法6.
通过透射电子显微镜（TEM 或 cryoTEM）或原子力显微镜（AFM）进行高分辨率成像，可实现对细胞外囊泡（EVs）形态和形貌参数的纳米级分辨率测定7,8,9,10,11,12。然而，电子显微镜用于生物样本（如 EVs）的主要局限在于其观测需在真空条件下进行，因而要求对样品进行固定和脱水处理。此类制样过程使得从观察到的结构推断溶液中 EVs 的真实形态变得困难。为避免样品脱水，冷冻电镜技术（cryoTEM）是表征 EVs 最为合适的方法13，该技术已广泛用于 EVs 超微结构的分析。利用生物功能化金纳米颗粒对囊泡进行免疫标记，还可识别 EVs 的特定亚群，并将其与复杂生物样本中的其他颗粒区分开来。然而，由于电子显微镜所分析的 EVs 数量较少，通常难以对复杂且异质性的样本实现具有代表性的表征。
为了揭示这种尺寸异质性，国际细胞外囊泡学会（ISEV）建议分析足够数量的宽场图像，并辅以高分辨率的局部放大图像，以清晰显示单个细胞外囊泡（EVs）14。原子力显微镜（AFM）是研究EVs的另一种替代方法，可作为光学方法和电子衍射技术的补充。该技术利用固定在弹性悬臂上的尖锐探针，逐行扫描沉积在支撑基底上的样品，并通过反馈回路调节探针与样品表面各组分之间的距离。这种方法可用于表征样品的表面形貌，并获取形态力学信息15,16,17,18。EVs可通过AFM进行扫描，既可在将其沉积于原子级平整基底后直接成像，也可在利用抗体、肽段或适配体功能化的特异性基底捕获后，用于表征不同的EV亚群18,19。由于AFM能够在无需预处理、标记或脱水的情况下，对复杂生物样本中的EVs结构、生物力学特性及膜结合生物分子含量进行定量和同步检测，因此目前正被越来越多地用于在生理温度和介质条件下，对EVs进行精细且多参数的表征。
本文提出了一种利用可进行多重（生物）化学功能化的核心金质生物芯片的方法。该基底构成了一种强大分析平台的基础，该平台结合了通过表面等离子共振对细胞外囊泡（EV）亚群进行生物检测的技术；当EV被吸附/接枝或通过免疫捕获固定在芯片上后，原子力显微镜（AFM）可实现对EV的计量学及形态力学特性表征。结合芯片上捕获的EV亚群的拉曼特征信号，该分析平台能够以无标记、无需任何预处理步骤的方式对生物样本中存在的EV进行定性分析。本文表明，借助高度严谨的基底制备与数据采集方法，将多种强大技术相结合，可实现对EV深入、明确且稳健的分析。
本方法的原理是制备金基底，吸附/接枝或捕获EV亚型，并通过原子力显微镜（AFM）扫描以评估每种EV亚群的尺寸和形态。此外，对吸附的EV进行拉曼光谱分析。该基底实际上可呈现三种复杂程度递增的界面类型：裸露表面、化学功能化表面或配体微阵列。在描述本实验方案的各个步骤之前，读者可参考图1中所示的纳米生物分析平台（NBA）方法的示意图，该方法结合了表面等离子体共振成像（SPRi）、原子力显微镜（AFM）和光谱技术。
图 1：纳米生物分析平台。该方法结合了（A）表面等离子体共振成像、（B）原子力显微镜以及红外/拉曼（纳米）光谱技术，所有技术均在同一基底——一种多重金芯片上进行。缩写：NBA = 纳米生物分析平台；SPRi = 表面等离子体共振成像；AFM = 原子力显微镜；EV = 细胞外囊泡。请点击此处查看此图的放大版本。
核心金质生物芯片构成了该平台的核心，因为所有无标记表征技术均在此生物芯片上进行。根据细胞外囊泡（EV）表征的需求（针对全部EV或特定EV亚群）以及所用方法的局限性或要求，已开发出三种类型的金质生物芯片表面：分别为“裸露”表面、经化学功能化的“C11/C16”表面，以及配体生物功能化的“配体”金表面。
这种裸芯片（称为“裸”）可实现细胞外囊泡（EVs）在金表面的简单吸附。研究者可自行选择所用缓冲液，并采用被动方式（孵育后洗涤）或在流动条件下（如表面等离子体共振成像，SPRi）进行吸附。此外，这种被动吸附既可在整个芯片表面进行（作为宏阵列），也可利用微量移液器点样仪将样品定位在微阵列区域。流动条件下的操作程序可使研究者实时监测EV吸附的动力学过程及吸附程度。当化学修饰层界面可能干扰分析方法时（例如拉曼光谱），通常采用这种基于裸金基底的方法。
这种化学功能化的生物芯片被称为“C11/C16”，当需要对细胞外囊泡（EV）样本进行整体分析时，可用于在金表面通过硫醇盐形成初级酰胺键，共价结合大量且稳定的EV“地毯”。具体而言，金表面通过巯基十一醇（11-MUOH：“C11”）和巯基十六烷酸（16-MHA：“C16”）的硫醇盐混合物进行功能化修饰，并将部分硫醇盐化学活化，以实现与靶标分子的共价结合。该策略既可通过被动方式实现（孵育后冲洗，可在“宏阵列”中操作，也可使用微量移液器点样仪在多个微阵列上操作），也可在流动条件下（如表面等离子体共振成像，SPRi）进行，以实时监测EV在金表面的接枝动力学过程和结合水平。
该 配体生物功能化生物芯片，称为 "配体通过化学活化，可将不同的配体（如抗体、受体）共价接枝到其表面，从而选择性地（通过亲和作用）捕获生物样本中共存的不同EV亚群。
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方案
1. 金基底的制备
注意：在金芯片上制备三种类型的表面：1）裸表面，2）化学功能化表面，以及 3）生物功能化表面（配体接枝于C11C16层上）。此后将分别称为“裸表面”、“C11C16”和“配体”。
- 金基底制备：
注意：本方案中使用的金生物芯片在洁净室内自行制备。自制生物芯片由玻璃载片（SF11）构成，表面镀有铬层（2 nm Cr）和金层（48 nm Au）。生物芯片长度为28 mm，宽度为12.5 mm，厚度为0.5 mm20。- 采用直流磁控溅射法15通过物理气相沉积（PVD）对载片进行镀膜。
- 化学功能化：
- 将未修饰的芯片在含有90%/10%（摩尔比）巯基-1-十一醇（11-MUOH：C11）和巯基-1-十六烷酸（16-MHA：C16）的无水乙醇溶液（1 mM）中，于室温下振荡孵育过夜，以实现功能化。
注意：此步骤将形成稳定的自组装单分子层（SAM），有利于后续配体的接枝。 - 用无水乙醇和超纯水轻轻清洗生物芯片，氮气吹干，并在洁净室条件下保存。
- 化学功能化生物芯片的活化：
注意：从本步骤开始，实验需在分析实验室中进行。- 用超纯水轻轻冲洗生物芯片，然后在温和气流下吹干。为活化C16羧基，将生物芯片在含有200 mM乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC）和50 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）的混合液中避光孵育至少30分钟，室温条件下进行。接枝实验前用水冲洗芯片。
- 将未修饰的芯片在含有90%/10%（摩尔比）巯基-1-十一醇（11-MUOH：C11）和巯基-1-十六烷酸（16-MHA：C16）的无水乙醇溶液（1 mM）中，于室温下振荡孵育过夜，以实现功能化。
- 在功能化生物芯片上接枝配体：
注意：配体（或某些实验中的EVs）在芯片上的固定可通过两种方式进行：一种是在SPRi仪器外被动孵育（将液滴孵育在活化芯片上），另一种是在SPRi仪器内通过流动动态进行。由此获得EV-或配体-修饰的芯片。图2展示了金生物芯片、微移液点样仪以及点样后每个液滴300 nL共16个配体液滴的生物芯片。- 进行配体接枝时，使用如抗体（例如抗CD41免疫球蛋白[特异性识别来源于天然血小板的微囊泡，称为N-PEVs]、抗CD61、抗CD62P、抗CD9和抗OVA[针对卵清蛋白的对照抗体]）以及Annexin V等分子。将其用酸性缓冲液稀释至200 µg/mL（pH 4.5至6之间，具体取决于配体活性或功能的最佳pH值）。
注意：抗体接枝的最佳pH值此前已通过SPR仪器上的预富集实验确定，用于评估配体接枝的最佳pH条件（见图3）。由于不同克隆的抗体其接枝条件可能不同，建议在开展SPRi实验前先优化确定这些条件。 - 在点样过程中，使用点样仪加入300 nL的EVs/配体溶液。
注意：左右两侧的孔中应放置浸湿的滤纸，以防止液滴蒸发。该步骤对于维持EVs/配体的稳定性与功能至关重要。 - 点样完成后，将生物芯片置于超声水浴中（频率：37 kHz，功率：30%）孵育30分钟。用超纯水从上方冲洗芯片，然后将其轻柔地放置在与生物芯片折射率（RI）相同的棱镜上。调整生物芯片位置时，在生物芯片与棱镜之间加入一滴折射率匹配的油（约2.3 µL），形成均匀的薄层。
注意：此步骤确保光路中存在连续且折射率一致的介质。操作中必须避免油层中产生气泡，否则会改变光路的光学特性，影响后续分析。
- 进行配体接枝时，使用如抗体（例如抗CD41免疫球蛋白[特异性识别来源于天然血小板的微囊泡，称为N-PEVs]、抗CD61、抗CD62P、抗CD9和抗OVA[针对卵清蛋白的对照抗体]）以及Annexin V等分子。将其用酸性缓冲液稀释至200 µg/mL（pH 4.5至6之间，具体取决于配体活性或功能的最佳pH值）。
图 2：生物芯片与手动点样装置。 金生物芯片（左），微量移液器点样装置（中），以及用每滴 300 nL 配体溶液点样后的生物芯片（右）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：预富集实验以确定配体接枝的最佳 pH 值。 该传感图显示了一种配体在相同浓度下、随机（在不同 pH 值条件下）注入表面后，相互作用水平随时间的变化，持续 2 分钟。OG 为去垢剂，可在每次注入之间恢复基线。此处，传感图表明 pH 6 条件下配体接枝量最大，SPRi 信号达到 1091 RU。缩写：OG = octyl glucoside；RU = response unit。 请点击此处查看该图的放大版本。
2. 表面等离子体共振成像
- 将生物芯片安装至 SPRi 系统上。保持 流速 PBS缓冲液（运行缓冲液）的 50 µL/min.
注意：如果存在任何气泡，可将流速提高至 500-1,000 µL/min，并频繁注入 40 mM 辛基葡萄糖苷（OG）以尽快去除它们。 - SPRi仪器中金生物芯片的预处理：工作角度的选择
- 单击软件左侧的下拉菜单，然后单击 工作目录 定义用于保存实验数据的文件夹。随后，点击 表面等离激元 | 图像采集.
- 找到图像（如下图所示） 图4A）上可见不同斑点，点击以 选择此图像. 为定义感兴趣区域（ROI），如图所示 图4，点击 自动检测 或 手动定义 斑点内部（图4B）或在芯片上指代特定位置，即使没有点样区域图 4C),.
- 当使用多重生物芯片时，写出配体家族的名称，然后点击相应的位点。
注意：一个配体家族对应多个用相同配体功能化的点位。通常，芯片上每种配体至少包含重复两次，甚至常常重复三次。 - 点击 完成物种定义 并等待系统引导至包含所获等离激元曲线的窗口。
- 选择一个 工作角度. 用光标拖动黑线至最佳工作角度，然后单击 将反射镜调整至工作角度.
注意：等离子体共振曲线由反射率（%）随角度变化的数值构成，软件会同时提供另一条斜率（%）随角度变化的曲线。为选择合适的工作角度，应选取斜率值最大的角度。- 若在仪器内部进行钝化步骤（由于白蛋白所致），请选择一个 工作角度 以获得对表面的最佳灵敏度，从而建立表面反应活性的质量控制。
注意：当芯片用于亲和力/捕获型生物检测时，此钝化步骤至关重要，可减少样本与生物芯片表面之间的非特异性相互作用。
- 若在仪器内部进行钝化步骤（由于白蛋白所致），请选择一个 工作角度 以获得对表面的最佳灵敏度，从而建立表面反应活性的质量控制。
- 点击 动力学 开始实时动力学监测。当软件提示用户定义阴性对照时，选择 无阴性对照 此时（以便观察阴性对照点的反应动力学）。
- 注射大鼠血清白蛋白（RSA, 200 µg/mL，用乙酸盐缓冲液（pH 4.5）配制）于 50 µL/min 4 分钟 用于钝化斑点周围的表面，并可能填充配体斑点内部的空隙。
注意：RSA 注射用于覆盖未结合任何配体的生物芯片。 - 注射 乙醇胺 (1 M) 在 20 µL/min 用于 10 min 使表面仍存在且具有反应性的羧基失活。
- 通过注入清洗生物芯片 40 mM OG 在 50 µL/min 用于 4 分钟.
注意：在钝化步骤之后，需调整工作角度（在样品注入前重新确定基线），以使目标区域的灵敏度达到最高。
- 注射大鼠血清白蛋白（RSA, 200 µg/mL，用乙酸盐缓冲液（pH 4.5）配制）于 50 µL/min 4 分钟 用于钝化斑点周围的表面，并可能填充配体斑点内部的空隙。
- 样品注入：
- 钝化后重新定义等离子体曲线，并根据此次的配体选择工作角度。
- 在动力学监测过程中，将流速降低至 20 µL/min，并等待 基线稳定.
- 以选定的浓度注入样品（从 1 × 108 EVs/mL 到 1 × 1010 EVs/mL 取决于EVs与接枝配体之间的亲和力），然后点击以下任一选项 手动注射 或 自动注射在手动注射的情况下，注射后 200 µL 样品的，点击 停止注射. 由于注射持续时间通常 10 min，开始遵循 相互作用的动力学，并测量 反射率变化 通过计算动力学监测过程中注射开始与结束时反射率的差异（图5).
注意：所注射的不同样品在代表性结果部分中进行了描述。
- 样品注入后，采用以下两种方法之一完成 SPRi 实验：
- 在 未固定/液体中 方法：将生物芯片从 SPRi 仪器中取出，在其表面滴加一滴液体，随后在液体环境中进行进一步的原子力显微镜（AFM）表面表征。
- 在 固定的 方法，注射 戊二醛 (0.5%) 用水稀释至 20 µL/min 用于 10 min 固定生物芯片上捕获的分子。注入水冲洗表面，取出生物芯片，用蒸馏水轻轻洗涤，然后空气干燥，以备后续在原子力显微镜（AFM）下进一步分析。
图 4：生物芯片的 SPRi CCD 图像。 （A、B）白蛋白钝化后的多重生物芯片。（A）无缺陷的芯片；（B）芯片上出现的一些缺陷：斑点融合（i）、接枝强度弱（ii）或灰尘及“污染物”（iii）。感兴趣区域（ROIs）在斑点中以颜色标示（每种配体家族对应一种颜色），选择时避开这些“污染物”。当斑点发生融合时，会予以标注，并被忽略或命名为“配体1和配体2的混合物”。（C）用于研究细胞外囊泡（EVs）在金表面吸附实验的无微阵列裸金芯片。蓝色箭头指示流动方向。该芯片无斑点，感兴趣区域（ROIs）的选择用于记录样品注入期间从第1行（L1，红色圆圈）到第4行（L4，紫色圆圈）的反射信号。比例尺 = 所有三幅图像的1 mm。缩写：SPRi = 表面等离子体共振成像；CCD = 电荷耦合器件；ROIs = 感兴趣区域；EVs = 细胞外囊泡。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：细胞外囊泡注入生物芯片的 SPRi 实验。（A）在多重生物芯片上进行的捕获实验，显示不同配体的反射率信号。此处，不同配体的信噪比非常理想（尤其是抗CD41点样区域），因为阴性对照的响应可忽略不计。（B）细胞外囊泡在裸芯片上的吸附实验。传感图显示了芯片用缓冲液冲洗两次并用OG清洗（1）、注入EV样品（2）以及EV相互作用后的反射率信号（3）的过程。该生物芯片上无阴性对照，但反射率信号（其动力学特征及注入后的稳定性）较强，表明这些细胞外囊泡能够在金芯片上吸附并保持稳定。缩写：EV = extracellular vesicle；OG = octyl glucoside。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 原子力显微镜
- 使用 接触模式 在空气中扫描生物芯片以及 定量成像模式 在液体条件下扫描生物芯片。
- 将生物芯片对准载玻片上的掩膜（实验室自制）顶部，以确定生物芯片上各微点的位置图6A).
注意：该掩膜上标有斑点标记，对应于所用点样仪上配体斑点的位置。该掩膜由一块玻璃载片构成，其上设有两个相互垂直的楔形结构，用于固定芯片。此外，玻璃载片上还标有16个绒布点，对应芯片上斑点的位置，可通过透光定位斑点并扫描目标区域。 - 尖端定位：
- 使用位于原子力显微镜（AFM）上方的CCD相机定位悬臂，使其对准需要扫描的正确位置。按照本方案操作时，请使用 三角形悬臂梁 的 200 µm 长度， 28 µm 宽度，以及一个 弹簧常数 的 0.08 N/m.
- 将激光对准悬臂顶部的位置，以在反馈控制机制中获得最佳响应。
- 扫描：
- 一旦探针与生物芯片表面接触并开始作用，即启动原子力显微镜采集 接触模式 或在 定量成像模式 从三个到五个大区域（通常为10 × 10 µm²）到小区域（1 × 1 µm²).
注意：图示为可扫描的不同区域示意图 图6D确保原子力显微镜（AFM）表征能够代表整个平方毫米区域，并在足够高的分辨率下观察到足够数量的细胞外囊泡（EVs），以进行可靠的分析（每种条件下至少计数和分析300个EVs），并开展形貌与尺寸测量。
- 一旦探针与生物芯片表面接触并开始作用，即启动原子力显微镜采集 接触模式 或在 定量成像模式 从三个到五个大区域（通常为10 × 10 µm²）到小区域（1 × 1 µm²).
- 原子力显微镜图像处理：
- 使用 JPK 数据处理软件处理原子力显微镜图像，首先进行选择 高度通道.
- 选择一个 多项式拟合 从每行中减去以获得校正后的扫描线。
- 选择 高度阈值 用金颗粒消除表面粗糙度。在参考软件中（见相关 材料表），在颗粒提取模块中，使用8.5 nm的高度阈值对颗粒进行标记。一旦颗粒被标记后 过滤的，该 颗粒数量 出现。
注意：通常，粗糙的金基底（RMS 约 ~3 nm）以及化学层和配体层的存在需要 阈值 设定为 8.5 nm. - 为了提取所标记颗粒的多个特性，例如 高度，体积，以及 直径，打开参考软件中的图像，然后选择 数据处理 | 谷物 | 阈值标记.
- 选择 滤膜颗粒 在 功能 的 性质当新窗口出现时，选择以下参数： 值 = 最大 z 最大值，表面 = 投影表面 A0. 然后，选择标准 A 和 B.
- 开放 粒度分布；在出现的窗口中，选择 值 （最大值）， 体积 （基线：零），以及 边界 （长度）。观察出现的表格（.txt 格式），该表格包含三列，分别显示 高度，体积，以及 直径 每张图像中在设定阈值下检测到的所有颗粒的数值。
- 从该高度 h，以及直径， D，计算曲率半径， Rc，使用公式（1)8，然后计算体积， V，使用公式（2):
(1)
(2) - 从 V，计算有效直径， d eff，使用公式（计算每个EV的等效体积直径（即具有相同体积的球体的直径）3):
(3) - 绘制图表，显示囊泡（EVs）的尺寸（测量高度、测量直径和计算的有效直径），每个被计数的颗粒以一个点表示。
注意：因此，在表征结束时，NBA 平台能够将生物检测信号以及表型结果与不同亚群细胞外囊泡（EV）的数量和大小进行关联分析。
图 6：通过原子力显微镜（AFM）对生物芯片进行表征。 表面等离子体共振成像（SPRi）实验后，芯片可被固定并干燥，或保持在液体环境中用于AFM表征。(A) 经过加工的玻璃载片（图中显示两个相互垂直的定位楔形结构，以“w”标记），其上带有与16个生物芯片微阵列位置匹配的掩模。通过光照和透明性，在安装用于AFM表征时，该玻璃载片可引导AFM探针精确定位于目标区域进行表征。(B) 安装在“掩模”载片上的生物芯片，并在缓冲液滴下以实现液体环境中的扫描。(C) 16个微阵列的SPRi图像。(D) 免疫捕获直径为920 nm的生物功能化校准纳米颗粒后，通过光学显微镜成像的一个微阵列。白色方框表示在每个感兴趣区域中由AFM扫描的不同位置采样点，以确保AFM表征的可靠性。比例尺 = (C) 1 mm，(D) 500 µm。缩写：AFM = atomic force microscopy；SPRi = surface plasmon resonance imaging。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. 拉曼光谱法
注意：进行拉曼光谱分析时，应将用作基底的玻璃载玻片替换为CaF2载玻片，因其拉曼信号可忽略不计。
- 图像采集的光学条件：
- 设置拉曼成像显微镜的以下条件： 显微镜物镜：50倍；激光波长：532 nm；激光功率：10 mW；曝光时间：500 ms；累积次数：140；光谱范围： 从 450 cm−1 到 3,200 cm−1.
注意：使用过高的功率和/或过长的采集时间可能导致样品损伤，表现为随时间推移光谱不稳定。应从较低的能量开始，若信号过弱再逐步增加。可采用较长的激光波长（如633 nm、785 nm）以减少对拉曼测量有害的荧光干扰。然而，信号强度随波长的四次方成反比下降，因此需考虑相机的光谱灵敏度。
- 设置拉曼成像显微镜的以下条件： 显微镜物镜：50倍；激光波长：532 nm；激光功率：10 mW；曝光时间：500 ms；累积次数：140；光谱范围： 从 450 cm−1 到 3,200 cm−1.
- 拉曼成像：
- 首先，使用较少的累积次数（10次）观察实时光谱，以找到信噪比最佳的区域。
注意：高频区域（2,800–3,000 cm⁻¹）出现强信号−1可缩短曝光时间，从而更轻松地检测表面的EVs，如先前研究所示10. - 选定感兴趣区域（ROI）后，根据采集可用的时间选择空间分辨率。
注意：空间分辨率受限于衍射极限（约500 nm）。 - 开始拉曼成像采集。
- 首先，使用较少的累积次数（10次）观察实时光谱，以找到信噪比最佳的区域。
- 数据预处理：
- 使用 Python 集成开发环境（IDE）（例如 Spyder），打开包含光谱的文件。
- 减去光谱的基线以校正可能的荧光干扰。例如，使用 "irfpy" 软件包中的 "arpls" 函数23. 测试参数“lam”的不同取值，以找到能够提供最佳基线校正效果的值（通常在103 和 107).
- 将光谱归一化，例如，将每个光谱的所有强度值除以其在 2,900 cm⁻¹ 处的强度值−1 或通过减去光谱的均值，再除以其标准差（“标准正态变量”标准化）。
注意：此步骤对于比较细胞外囊泡（EVs）的相对分子组成是必要的。
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结果
确定配体接枝的最佳pH条件
用于制备生物芯片的不同配体在不同pH条件下进行测试，以评估其与硫醇盐化学层相互作用的能力（图3）。将配体溶于不同pH值的乙酸盐缓冲液中，注入经C11C16化学功能化修饰的生物芯片表面。溶液在表面随机注入，每次配体注入后均注入去垢剂（40 mM OG）以恢复基线。该预富集测试可用于确定每种配体接枝的最佳pH值。如图3所示示例中，根据接枝斜率和接枝水平，选择pH 6作为最佳pH值。
SPRi CCD 图像
将生物芯片（裸金表面、化学功能化表面或带有微阵列的表面）插入 SPRi 仪器后，所记录的 SPRi CCD 图像如图4所示。对于带有微阵列的生物芯片，图像采集于表面经白蛋白钝化之后。芯片上系统性地设置了点样的重复孔（双复孔或三复孔），同时芯片上自动包含一个阴性对照...
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讨论
目前最常用的EV鉴定方法主要包括：通过蛋白质特异性免疫印迹法确认EV的来源，通过透射电子显微镜（TEM）确认其结构，以及通过纳米颗粒追踪分析（NTA）对样本体积中EV的数量和粒径分布进行定量3。然而，由于（生物）医学研究领域对EV的高度关注，以及现有分析工具的局限性，科学界迫切需要开发新的EV表征、区分与定量方法。
目前大多数研究进展集中于将免疫标记或免疫捕获原理与先进的物理方法相结合，用于细胞外囊泡（EV）的检测。其中一些方法致力于对单个EV进行鉴定，以在纳米级对象尺度上获得最大程度可靠的检测数据；另一些方法则更侧重于开发经济、可靠且适用于临床应用的全局性检测方法。
NBA 平台结合了在多重金基底上对细胞外囊泡（EVs）的生物检测与原子力显微镜（AFM）表征，能够对复杂生物液体中存在的纳米囊泡进行深入的定性分析。事实上，由于生物芯片具有高选择性，可直接注入粗制样品，并凸显囊泡的贡献。
该方法旨在对吸附/接枝或通过亲和力捕获...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢巴黎 IVETh 核心设施的 Kelly Aubertin 和 Fabien Picot 进行拉曼成像实验。感谢台北医学大学中国台湾的 Thierry Burnouf 和来自法国赫朗库尔的 Zuzana Krupova 分别提供了源自血小板和牛乳样品的细胞外囊泡样品。本研究工作得到了勃艮第-弗朗什-孔泰大区以及 EUR EIPHI 研究生院（NOVICE 项目，2021–2024）的支持。部分工作在 FEMTO-ENGINEERING 的 CLIPP 平台及 RENATECH 洁净室设施中完成，特此感谢 Rabah Zeggari 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CD41a 抗体 | Diaclone SAS (法国) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH，德国 | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| 乙醇胺 | Sigma | P5368-10PAK | |
| 血小板浓缩物来源的细胞外囊泡（Evs） | 合作单位：T. Burnouf 教授（TMU，中国台湾台北） | S2889 | |
| 牛乳来源的细胞外囊泡（Evs） | 合作单位：Z. Krupova 博士（Excilone，Helincourt—法国） | 3450 | |
| 戊二醛 | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| 磁控溅射设备 | PLASSYS | SAB5300165 | |
| 巯基十六烷酸（mercapto-1-hexadecanoic acid） | Sigma | G5882 | |
| 巯基-1-十一醇（Mercapto-1-undecanol） | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP 图像分析软件 | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| 辛基葡萄糖苷（Octyl Glucoside, OG） | Sigma | ||
| 卵清蛋白抗体 | Sigma | ||
| 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline, PBS） | Sigma | ||
| 大鼠血清白蛋白（Rat Albumin Serum, RSA） | Sigma | ||
| 醋酸钠缓冲液（Sodium acetate buffer） | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare / Cytiva life sciences | ||
| SPRi 生物芯片 | MIMENTO 技术平台 | 生物芯片于贝桑松洁净室内部制备 | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
参考文献
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