本文提出了一种新一代的多参数分析平台，可提高细胞外囊泡亚群表征的通量。该方法结合了多重生物传感技术与原子力显微镜的计量学和形貌力学分析，并耦合拉曼光谱，用于对捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标进行定性分析。
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本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞产生的一类膜源性微小囊泡，直径范围从50到数百纳米不等，是细胞间通讯的重要媒介。它们正逐渐成为多种疾病诊断和治疗的有前景工具。细胞通过两种主要的生物发生途径产生EVs，这些EVs在大小、组成和内容物上存在差异。由于其在尺寸、组成及细胞来源方面的高度复杂性，对EVs的表征需要结合多种分析技术。本项目旨在开发新一代高通量多参数分析平台，用于EVs亚群的表征。为实现这一目标，研究基于课题组已建立的纳米生物分析平台（NBA），该平台通过将多重生物传感方法与原子力显微镜（AFM）对微阵列生物芯片上捕获的囊泡目标进行的计量学和形貌力学分析相结合，实现了对EVs的创新性研究。本工作的目标是进一步结合拉曼光谱技术，对EVs进行表型和分子水平的分析。这些技术发展使得能够提出一种多模态且易于使用的分析解决方案，用于临床相关生物液体中EV亚群的区分。
引言
外泌体（EV）研究在诊断和治疗领域的日益受关注1,2,3,4,5，加之该领域所面临的挑战，促使研究人员开发并应用了多种用于定量或表征这些囊泡的方法和技术。目前最常用的EV鉴定方法包括：通过蛋白质特异性免疫印迹和蛋白质组学分析来确认EV的来源，利用透射电子显微镜（TEM）观察其结构，以及采用纳米颗粒追踪分析（NTA）对样本体积中EV的数量及其粒径分布进行定量。
然而，这些技术单独使用时均无法提供表征细胞外囊泡（EV）亚群所需的全部信息。由于EV在生化和物理特性上的多样性，其本身具有高度异质性，这阻碍了对EV（尤其是混合物中的EV，即粗样品）进行可靠且可重复的全局分析。因此，亟需针对EV的检测与表征方法，既能用于单个EV的分析，也能用于总体表征，以补充其他虽快速但缺乏选择性的方法6.
通过透射电子显微镜（TEM 或 cryoTEM）或原子力显微镜（AFM）进行高分辨率成像，可实现对细胞外囊泡（EVs）形态和形貌参数的纳米级分辨率测定
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方案
1. 金基底的制备
注意：在金芯片上制备三种类型的表面：1）裸表面，2）化学功能化表面，以及 3）生物功能化表面（配体接枝于C11C16层上）。此后将分别称为“裸表面”、“C11C16”和“配体”。
- 金基底制备：
注意：本方案中使用的金生物芯片在洁净室内自行制备。自制生物芯片由玻璃载片（SF11）构成，表面镀有铬层（2 nm Cr）和金层（48 nm Au）。生物芯片长度为28 mm，宽度为12.5 mm，厚度为0.5 mm20。- 采用直流磁控溅射法15通过物理气相沉积（PVD）对载片进行镀膜。
- 化学功能化：
- 将未修饰的芯片在含有90%/10%（摩尔比）巯基-1-十一醇（11-MUOH：C11）和巯基-1-十六烷酸（16-MHA：C16）的无水乙醇溶液（1 mM）中，于室温下振荡孵育过夜，以实现功能化。
注意：此步骤将形成稳定的自组装单分子层（SAM），有利于后续配体的接枝。 - 用无水乙醇和超纯水轻轻清洗生物芯片，氮气吹干....
- 将未修饰的芯片在含有90%/10%（摩尔比）巯基-1-十一醇（11-MUOH：C11）和巯基-1-十六烷酸（16-MHA：C16）的无水乙醇溶液（1 mM）中，于室温下振荡孵育过夜，以实现功能化。
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结果
确定配体接枝的最佳pH条件
用于制备生物芯片的不同配体在不同pH条件下进行测试，以评估其与硫醇盐化学层相互作用的能力（图3）。将配体溶于不同pH值的乙酸盐缓冲液中，注入经C11C16化学功能化修饰的生物芯片表面。溶液在表面随机注入，每次配体注入后均注入去垢剂（40 mM OG）以恢复基线。该预富集测试可用于确定每种配体接枝的最佳pH值。如图3所示示例中，根据接枝斜率和接枝水平，选择pH 6作为最佳pH值。
SPRi CCD 图像
将生物芯片（裸金表面、化学功能化表面或带有微阵列的表面）插入 SPRi 仪器后，所记录的 SPRi CCD 图像如图4所示。对于带有微阵列的生物芯片，图像采集于表面经白蛋白钝化之后。芯片上系统性地设置了点样的重复孔（双复孔或三复孔），同时芯片上自动包含一个阴性对照.......
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讨论
目前最常用的EV鉴定方法主要包括：通过蛋白质特异性免疫印迹法确认EV的来源，通过透射电子显微镜（TEM）确认其结构，以及通过纳米颗粒追踪分析（NTA）对样本体积中EV的数量和粒径分布进行定量3。然而，由于（生物）医学研究领域对EV的高度关注，以及现有分析工具的局限性，科学界迫切需要开发新的EV表征、区分与定量方法。
目前大多数研究进展集中于将免疫标记或免疫捕获原理与先进的物理方法相结合，用于细胞外囊泡（EV）的检测。其中一些方法致力于对单个EV进行鉴定，以在纳米级对象尺度上获得最大程度可靠的检测数据；另一些方法则更侧重于开发经济、可靠且适用于临床应用的全局性检测方法。
NBA 平台结合了在多重金基底上对细胞外囊泡（EVs）的生物检测与原子力显微镜（AFM）表征，能够对复杂生物液体中存在的纳米囊泡进行深入的定性分析。事实上，由于生物芯片具有高选择性，可直接注入粗制样品，并凸显囊泡的贡献。
该方法旨在对吸附/接枝或通过亲和力捕获.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢巴黎 IVETh 核心设施的 Kelly Aubertin 和 Fabien Picot 进行拉曼成像实验。感谢台北医学大学中国台湾的 Thierry Burnouf 和来自法国赫朗库尔的 Zuzana Krupova 分别提供了源自血小板和牛乳样品的细胞外囊泡样品。本研究工作得到了勃艮第-弗朗什-孔泰大区以及 EUR EIPHI 研究生院（NOVICE 项目，2021–2024）的支持。部分工作在 FEMTO-ENGINEERING 的 CLIPP 平台及 RENATECH 洁净室设施中完成，特此感谢 Rabah Zeggari 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CD41a 抗体 | Diaclone SAS (法国) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH，德国 | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| 乙醇胺 | Sigma | P5368-10PAK | |
| 血小板浓缩物来源的细胞外囊泡（Evs） | 合作单位：T. Burnouf 教授（TMU，中国台湾台北） | S2889 | |
| 牛乳来源的细胞外囊泡（Evs） | 合作单位：Z. Krupova 博士（Excilone，Helincourt—法国） | 3450 | |
| 戊二醛 | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| 磁控溅射设备 | PLASSYS | SAB5300165 | |
| 巯基十六烷酸（mercapto-1-hexadecanoic acid） | Sigma | G5882 | |
| 巯基-1-十一醇（Mercapto-1-undecanol） | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP 图像分析软件 | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| 辛基葡萄糖苷（Octyl Glucoside, OG） | Sigma | ||
| 卵清蛋白抗体 | Sigma | ||
| 磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline, PBS） | Sigma | ||
| 大鼠血清白蛋白（Rat Albumin Serum, RSA） | Sigma | ||
| 醋酸钠缓冲液（Sodium acetate buffer） | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare / Cytiva life sciences | ||
| SPRi 生物芯片 | MIMENTO 技术平台 | 生物芯片于贝桑松洁净室内部制备 | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
参考文献
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001(2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R.
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