基于外膜囊泡显示SARS-CoV-2受体结合域的"即插即用"纳米颗粒疫苗平台

摘要

本协议将外膜囊泡的生物工程描述为"即插即用"疫苗平台，包括生产、纯化、生物偶联和表征。

摘要

从细菌或病毒中获得的仿生纳米颗粒引起了人们对疫苗研究和开发的极大兴趣。外膜囊泡（OMV）在平均生长过程中主要由革兰氏阴性菌分泌，具有纳米级直径和自佐活性，可能是疫苗递送的理想选择。OMV作为蛋白质、核酸和小分子的多方面递送系统发挥作用。为了充分利用OMV的生物学特性，利用生物工程大 肠杆菌衍生的OMV作为载体，以SARS-CoV-2受体结合域（RBD）为抗原，构建"即插即用"疫苗平台。 化脓性链球菌 中的SpyCatcher（SC）和SpyTag（ST）结构域用于偶联OMV和RBD。质粒转染后，溶细胞素A（ClyA）基因与SC基因一起翻译为融合蛋白，在OMV表面留下反应位点。在常规缓冲系统中将RBD-ST混合过夜后，OMV和RBD之间形成了共价结合。因此，实现了多价显示OMV疫苗。通过用多种抗原代替，OMVs疫苗平台可以有效地显示多种异质抗原，从而有可能快速预防传染病流行。该协议描述了构建OMV疫苗平台的精确方法，包括生产，纯化，生物偶联和表征。

引言

作为潜在的疫苗平台，外膜囊泡（OMV）近年来越来越受到关注1^，2。OMV主要由革兰氏阴性菌³自然分泌，是由脂质双层组成的球形纳米级颗粒，通常大小为20-300纳米⁴。OMV含有各种亲本细菌成分，包括细菌抗原和病原体相关分子模式（PAMP），可作为固体免疫增强剂⁵。得益于其独特的成分、天然囊泡结构和出色的基因工程修饰位点，OMV已被开发用于许多生物医学领域，包括细菌疫苗⁶，佐剂⁷，癌症免疫治疗药物⁸，药物递送载体⁹和抗菌粘合剂¹⁰。

自2020年以来在全球蔓延的SARS-CoV-2大流行对全球社会造成了沉重打击。刺突蛋白（S蛋白）中的受体结合域（RBD）可以与人血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，然后介导病毒进入细胞¹¹，^12，13。因此，RBD似乎是疫苗发现的主要目标¹⁴，^15，16。然而，单体RBD的免疫原性较差，其小分子量使免疫系统难以识别，因此通常需要佐剂¹⁷。

为了提高RBD的免疫原性，构建了显示多价RBD的OMV。使用OMV显示RBD的现有研究通常将RBD与OMV融合以在细菌中表达¹⁸。然而，RBD是一种病毒来源的蛋白质，原核表达可能会影响其活性。为了解决这个问题，使用源自 化脓性链球菌的SpyTag（ST）/SpyCatcher（SC）系统在常规缓冲系统中与OMV和RBD形成共价同价肽¹⁹。SC结构域通过生物工程大 肠杆菌以溶细胞素A（ClyA）作为融合蛋白表达，ST通过HEK293F细胞表达系统与RBD表达。OMV-SC和RBD-ST混合并孵育过夜。经超速离心或体积排阻色谱（SEC）纯化后，得到OMV-RBD。

方案

1. 质粒构建

1. 将编码 SpyCatcher 序列（补充文件1）的DNA插入BamH I和Sal I位点之间的氨苄青霉素耐药pThioHisA-ClyA质粒（参见 材料表），以构建质粒pThioHisA ClyA-SC之前发表的报告²⁰。
2. 将合成的SpyTag-RBD-Histag融合基因（补充文件1）连接成BamH I和EcoR I位点之间的pcDNA3.1质粒（参见 材料表），以构建质粒pcDNA3.1 RBD-ST，根据先前发表的报告¹⁹。

2. OMV-SC制备

1. 按照以下步骤执行 ClyA-SC 转换。
   1. 将 5 μL pThioHisA ClyA-SC 质粒溶液 （50 ng/μL） 加入 50 μL BL21 感受态菌株中，轻轻吹气，在冰上冷却 30 分钟。
   2. 将溶液置于42°C的水浴中90秒，然后立即将混合溶液放在冰上3分钟。
   3. 向细菌悬浮液中加入500μLLB培养基，混合后，在37°C下以220rpm培养1小时。
   4. 将所有转化物接种到含有氨苄青霉素（100μg/ mL，参见 材料表）的LB琼脂平板上，并在37°C下培养过夜。
      注意:在随后的实验中，氨苄西林在培养基中保持相同的浓度。否则，这可能会导致细菌中的质粒丢失。
2. 对于 OMV-SC 生产，请执行以下步骤。
   1. 从平板（步骤2.1.4）中分离单个菌落至20mL LB（氨苄西林耐药）培养基中，并在37°C下以220rpm培养过夜。
   2. 将细菌溶液（从步骤2.2.1）接种到2L培养基中，以220rpm，37°C培养5小时，直到对数生长阶段（OD_600nm 在0.6至0.8之间）。
   3. 当细菌溶液600nm处的OD达到0.6-0.8时，加入异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG，参见 材料表），使细菌溶液的最终浓度为0.5mM，然后在25°C下以220rpm培养过夜。
3. 进行OMV-SC纯化。
   1. 将细菌溶液在4°C下以7，000× g 离心30分钟。
   2. 用0.22μm膜过滤器过滤上清液，然后使用100kD超滤膜或中空纤维柱将其浓缩（参见 材料表）。
   3. 通过0.22μm膜过滤器过滤浓缩物，然后使用超速离心机在4°C下以150，000× g 离心2小时（参见 材料表），并用移液管弃去上清液。
   4. 用PBS重悬沉淀并将其储存在-80°C。 该溶液可在−80°C下保持长期稳定性。

3. RBD-ST 制备

1. 按照以下步骤进行RBD-ST转染。
   1. 选择合适的真核表达系统（例如，HEK293F），并在恢复后在37°C下以130rpm培养细胞过夜。
   2. 将20μLHEK293F细胞溶液加入自动细胞计数器中（参见 材料表），记录细胞数，将浓度调节至1 x 10⁶ 个细胞/ mL，然后将细胞在37°C下以130rpm培养4小时。
   3. 通过0.22μm膜过滤器过滤RBD-ST质粒，并将300μg质粒加入细胞培养基中（参见 材料表），直到最终体积为10mL;摇晃10秒。
   4. 在水浴中将PEI（1mg / mL，见 材料表）加热至65°C，将0.7mLPEI与9.3mL细胞培养基混合，并间歇摇动10秒。
      注意:不要剧烈摇晃溶液。否则，产生的气泡可能会影响转染效率。
   5. 将质粒溶液加入PEI溶液中，间歇摇动混合物10秒，并在37°C下孵育15分钟。
   6. 将混合物加入280mL细胞培养基中，并在37°C下以130rpm培养5天。
2. 进行RBD-ST纯化。
   1. 将细胞在25°C下以6，000× g 离心20分钟，并使用移液管收集上清液。
   2. 用 2 mL Ni-NTA 琼脂糖填充色谱柱（参见 材料表），并用 3x PBS 洗涤 3 次。
   3. 将咪唑（参见 材料表）加入细胞上清液中，使终浓度为20mM，并加载细胞上清液2x。
   4. 加入含有20mM咪唑的PBS的3柱体积（CV）进行洗涤，并收集洗涤级分。
   5. 用含有低至高浓度（例如，0.3 M、0.4 M、0.5 M）咪唑的 3 CV PBS 梯度洗脱;每种浓度洗脱2x。
   6. 使用 SDS-PAGE²¹ 识别不同浓度梯度中的 RBD-ST。

4. OMV-RBD生物偶联纯化

1. 通过BCA方法测定蛋白质浓度（见 材料表）。
   1. 将标准BSA蛋白溶液从2 mg / mL连续稀释至0.0625 mg / mL，稀释纯化的OMV-SC和RBD-ST 10x，然后以50:1（v / v）的比例混合BCA工作溶液A和B（在测定试剂盒中提供）。
   2. 加入稀释的蛋白质溶液（25μL/孔）并与BCA工作溶液（200μL/孔）混合;在37°C孵育30分钟。
   3. 测量每个孔的562nm处的吸光度（OD），并从标准曲线²²计算蛋白质浓度。
2. 按照以下步骤对OMV-SC和RBD-ST进行生物偶联。
   1. 在PBS中以40:1（w/w）的比例混合OMV-SC和RBD-ST。
   2. 垂直旋转以在4°C下以15rpm混合混合物过夜。
      注意:不同的抗原可能以不同的比例发生反应。可以根据抗原的特性尝试不同的反应比例。
3. 验证反应效率。
   1. 制备 10 μL OMV-SC、RBD-ST 和反应产物（步骤 4.2）。加入 2.5 μL 5x 上样缓冲液（参见 材料表），并将样品在 100 °C 下加热 5 分钟。将样品上样到凝胶中（10 μL/孔）。在60V下进行电泳20分钟，并将条件更改为120V1小时。
   2. 将蛋白质从凝胶转移到PVDF蛋白质印迹膜（参见 材料表）中，在100 V下70分钟。
   3. 将膜放入5%脱脂奶粉/ TBST中，摇晃1小时。然后，用TBST洗涤3次，每次摇动洗涤5分钟。
   4. 将膜放入0.1%His-Tag抗体/ TBST（参见 材料表）中并摇动1小时，然后用TBST洗涤3次，每次摇动洗涤5分钟。
   5. 将膜放入0.02%抗小鼠IgG1抗体（HRP）/ TBST（参见 材料表）中并摇动40分钟，然后用TBST洗涤3次，每次摇匀洗涤5分钟。
   6. 加入增强的化学发光溶液（见 材料表）并暴露膜。
4. 进行OMV-RBD的纯化。
   1. 将1mL反应的OMV-RBD溶液稀释至10mL，并在4°C下以150，000× g 离心稀释液2小时。
   2. 使用移液管弃去上清液，并用 10 mL PBS 悬浮残留物。将悬浮液在4°C下以150，000× g 离心2小时。
   3. 弃去上清液并用 1 mL PBS 悬浮残留物。
      注意:如果抗原的溶解度要低得多，则通过体积排阻色谱¹⁹可以实现相同的分离效果。

5. 表征

1. 执行动态光散射 （DLS）。
   1. 将样品稀释至 100 μg/mL 浓度，然后将 1 mL 样品加入样品池中。
   2. 为"测量类型"选择"尺寸"，"蛋白质"为"样品材料"，"水"为"分散剂"，"25°C"为"温度"，然后加载样品并自动测量²³。
2. 使用透射电子显微镜 （TEM） 捕获图像。
   1. 将样品稀释至 100 μg/mL。取一个 200 目铜网格，向其中加入 20 μL 样品，并使其被吸收 10 分钟。
   2. 使用滤纸吸掉溶液，向支撑膜中加入 20 μL 3% 乙酸铀酰，染色 30 秒。
   3. 吸掉乙酸铀酰并在室温下自然干燥薄膜1小时。
   4. 将样品加载到TEM系统（参见 材料表）并在80 kV下捕获图像。

结果

该协议的流程图如图 1 所示。该协议可能是利用OMV作为疫苗平台的一般方法;只需要根据抗原的类型选择合适的表达系统。

图2提供了可行的质粒设计方案。SC基因通过柔性接头与ClyA基因连接，而ST通过His标签基因连接到RBD基因的5'末端进行纯化和验证。蛋白质印迹显示，随着OMV-SC的增加，反应逐渐完成（图3A）。超速离心后，几乎所有未反应的RBD-ST都保留在上清液中。与第一次相比，第二次超速离心没有提供进一步的显着优势（图3B）。

粒径的分布由DLS确定（图4）。OMV-SC的Z平均流体动力学直径为133 nm，而OMV-RBD的Z平均流体动力学直径为152.6 nm（表1）。这些差异可能是因...

讨论

为了创建一个"即插即显示"的纳米颗粒疫苗平台，SC融合的ClyA在BL21（DE3）菌株中表达，BL21（DE3）菌株因其在蛋白质表达方面的优势而成为重组蛋白生产中使用最广泛的模型之一²⁴，因此在细菌增殖过程中OMV表面会有足够的SC片段显示。同时，制备了ST融合的靶抗原，用于抗原与OMV之间的化学偶联。该实验方案的优势和未来应用前景主要体现在三个方面。首先，实现不同抗原和生物纳米颗粒的"即插即用"系统。反应和纯化过程可以快速直接，这在开发针对紧急传染病和其他场景的疫苗方面具有显着优势。其次，实现了高密度抗原显示的目标，为一些免疫原性低的抗原提供了疫苗设计方法。第三，OMV和RBD（抗原蛋白）的个体表达有利于确保高抗原活性，因为传统的原核表达系统缺乏特定辅因子、分子伴侣和翻译后修饰等功能，这可能导致蛋白质损失和错误折叠。

在质粒构建过程中，ClyA被选为与SC连接的靶标，主要是由于ClyA的C端松散的桶形结构。研究表明，血红蛋白酶（Hbp）自转运蛋白酶可以显示 来自肺炎链球菌 和 结核分枝杆菌

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素钠	Sangon Biotech	A610028
自动细胞计数器	Countstar	BioTech
BCA 蛋白定量试剂盒	cwbio	cw0014s
ChemiDoc 触摸成像系统	Bio-rad
Danamic 光散射	Malvern	Zetasizer Nano S90
电泳仪	Cavoy	Power BV
EZ-Buffers H 10X TBST 缓冲液	Sangon Biotech	C520009
山羊 pAb 对小鼠 IgG1	Abcam	ab97240
高速冷冻离心机	Bioridge	H2500R
His-Tag 小鼠 mAb	细胞信号传输技术	2366s
咪唑	Sangon Biotech
β-D-硫代吡喃半乳糖苷异丙	Sangon Biotech	A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow	Qiagen	70691
脱脂奶粉	Sangon Biotech	A600669
OPM-293 细胞培养基	Opm biosciences	81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST 质粒	武汉基因创造
磷酸盐缓冲盐水	ZSGB-bio	ZLI-9061
聚乙烯亚胺 线性	Polysciences	23966-1
预染蛋白分子量标准	Thermo	26616
pThioHisA ClyA-SC 质粒	武汉基因创建生物技术
PVDF 蛋白质印迹膜	罗氏
Quixstand 台式系统（100 kD 中空纤维柱）	GE Healthcare
SDS-PAGE 上样缓冲液 （5x）	Beyotime	P0015
氯化钠	Sangon Biotech	A100241
Supersignal west pico PLUS（增强化学发光溶液）	Thermo	34577
悬浮仪器	Life Technology	草裙舞混合器
透射电子显微镜	日立	HT7800
胰蛋白胨	Oxoid	LP0042B
超速离心机	贝克曼库尔特	XPN-100
紫外分光光度计	日立	U-3900
酵母提取物	Sangon Biotech	A610961