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方法文章

基于展示SARS-CoV-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

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DOI：

10.3791/64213

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2022年7月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了外膜囊泡的生物工程化，以构建“即插即用”型疫苗平台，包括其制备、纯化、生物偶联及表征。

摘要

由细菌或病毒获得的仿生纳米颗粒在疫苗研究与开发中引起了广泛关注。外膜囊泡（OMVs）主要由革兰氏阴性菌在正常生长过程中分泌，具有纳米级直径和自佐剂活性，可能非常适合作为疫苗递送载体。OMVs 已被用作蛋白质、核酸和小分子的多功能递送系统。为了充分利用 OMVs 的生物学特性，本研究采用经生物工程改造的 Escherichia coli-来源 OMVs 作为载体，并以 SARS-CoV-2 受体结合域（RBD）作为抗原，构建了一种“即插即显”"（Plug-and-Display"）疫苗平台。利用化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）中的 SpyCatcher（SC）和 SpyTag（ST）结构域实现 OMVs 与 RBD 的偶联。质粒转染后，Cytolysin A（ClyA）基因与 SC 基因翻译为融合蛋白，从而在 OMVs 表面暴露出反应性位点。将 RBD-ST 在常规缓冲体系中与 OMVs 混合过夜后，OMVs 与 RBD 之间形成共价结合，从而获得一种多价展示的 OMV 疫苗。通过替换不同的抗原，该 OMV 疫苗平台可高效展示多种异源抗原，有望快速应对传染病疫情。本实验方案详细描述了构建 OMV 疫苗平台的精确方法，包括 OMV 的制备、纯化、生物偶联及表征。

引言

作为一种潜在的疫苗平台，外膜囊泡（OMVs）近年来受到越来越多的关注1,2。OMVs 主要由革兰氏阴性菌自然分泌3，是由脂质双层构成的球形纳米级颗粒，通常大小为 20–300 nm4。OMVs 含有多种亲本细菌成分，包括细菌抗原和病原体相关分子模式（PAMPs），这些成分可作为强效的免疫增强剂5。得益于其独特的成分、天然囊泡结构以及丰富的基因工程改造位点，OMVs 已被开发应用于多种生物医学领域，包括细菌疫苗6、佐剂7、癌症免疫治疗药物8、药物递送载体9以及抗细菌黏附剂10。

自2020年以来，SARS-CoV-2大流行已蔓延全球，对全球社会造成了严重冲击。刺突蛋白（S蛋白）中的受体结合域（RBD）可与人血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，从而介导病毒进入细胞11,12,13。因此，RBD似乎是疫苗研发的主要靶点14,15,16。然而，单体形式的RBD免疫原性较弱，且其分子量较小，难以被免疫系统识别，因此通常需要佐剂17。

为了提高RBD的免疫原性，构建了展示多价RBD的细菌外膜囊泡（OMV）。目前利用OMV展示RBD的研究通常将RBD与OMV融合并在细菌中表达18。然而，RBD是一种病毒来源的蛋白，原核表达可能影响其活性。为解决这一问题，采用来源于Streptococcus pyogenes的SpyTag（ST）/SpyCatcher（SC）系统，在常规缓冲体系中使OMV与RBD之间形成共价异肽键19。SC结构域通过基因工程改造的Escherichia coli以Cytolysin A（ClyA）融合蛋白的形式表达，ST则通过HEK293F细胞表达系统与RBD共同表达。将OMV-SC与RBD-ST混合后过夜孵育，再经超速离心或尺寸排阻色谱法（SEC）纯化，获得OMV-RBD。

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方案

1. 质粒构建

  1. 将编码 SpyCatcher 序列的 DNA（补充文件 1）插入氨苄青霉素抗性的 pThioHisA-ClyA 质粒（参见材料表）的 BamH I 和 Sal I 位点之间，参照先前发表的文献20构建质粒 pThioHisA ClyA-SC。
  2. 将合成的 SpyTag-RBD-Histag 融合基因（补充文件 1）连接至 pcDNA3.1 质粒（参见材料表）的 BamH I 和 EcoR I 位点之间，参照先前发表的文献19构建质粒 pcDNA3.1 RBD-ST。

2. OMV-SC 的制备

  1. 按照以下步骤进行ClyA-SC转化。
    1. 将5 µL pThioHisA ClyA-SC质粒溶液（50 ng/µL）加入50 µL BL21感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置30 min。
    2. 将混合液置于42 °C水浴中90 s，然后立即放回冰上冷却3 min。
    3. 向菌液中加入500 µL LB培养基，混匀后于37 °C、220 rpm条件下培养1 h。
    4. 将全部转化产物涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL，参见材料表）的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
      注意：在后续实验中，培养基中的氨苄青霉素浓度应保持一致。若未保持该浓度，可能导致细菌丢失质粒。
  2. 进行OMV-SC的制备，执行以下步骤。
    1. 从平板（步骤2.1.4）挑取单菌落接种至20 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，于37 °C、220 rpm条件下过夜培养。
    2. 将上述菌液（来自步骤2.2.1）接种至2 L培养基中，于37 °C、220 rpm条件下培养5 h，直至进入对数生长期（OD600nm在0.6至0.8之间）。
    3. 当菌液在600 nm处的OD值达到0.6–0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，参见材料表），使终浓度为0.5 mM，随后于25 °C、220 rpm条件下过夜培养。
  3. 进行OMV-SC的纯化。
    1. 在4 °C条件下，以7,000 × g离心菌液30 min。
    2. 用0.22 µm膜过滤上清液，然后使用100 kD超滤膜或中空纤维柱（参见材料表）进行浓缩。
    3. 将浓缩液再次经0.22 µm膜过滤，随后在4 °C条件下，使用超速离心机以150,000 × g离心2 h（参见材料表），弃去上清液。
    4. 用PBS重悬沉淀物，并于−80 °C保存。该溶液在−80 °C下可长期保持稳定。

3. RBD-ST 的制备

  1. 按照以下步骤进行 RBD-ST 转染。
    1. 选择合适的真核表达系统（例如 HEK293F），复苏后在 37 °C、130 rpm 条件下培养过夜。
    2. 取 20 µL HEK293F 细胞溶液加入自动细胞计数仪（见材料表），记录细胞数量，调整浓度至 1 × 106 个细胞/mL，然后在 37 °C、130 rpm 条件下培养 4 小时。
    3. 将 RBD-ST 质粒经 0.22 µm 滤膜过滤后，加入 300 µg 质粒至细胞培养基中（见材料表），定容至 10 mL，振荡 10 秒。
    4. 将 PEI（1 mg/mL，见材料表）在水浴中加热至 65 °C，取 0.7 mL PEI 与 9.3 mL 细胞培养基混合，间歇振荡 10 秒。
      注意：不要剧烈振荡，否则产生的气泡可能影响转染效率。
    5. 将质粒溶液加入 PEI 溶液中，间歇振荡混合 10 秒，37 °C 孵育 15 分钟。
    6. 将上述混合液加入 280 mL 细胞培养基中，在 37 °C、130 rpm 条件下培养 5 天。
  2. 进行 RBD-ST 纯化。
    1. 在 25 °C、6,000 × g 条件下离心细胞 20 分钟，用移液器收集上清液。
    2. 用 2 mL Ni-NTA 琼脂糖（见材料表）装柱，并用 3× PBS 洗柱 3 次。
    3. 向细胞上清液中加入咪唑（见材料表），使终浓度为 20 mM，上样 2 次。
    4. 用含 20 mM 咪唑的 PBS 缓冲液洗涤 3 个柱体积（CV），并收集洗涤液。
    5. 用含咪唑浓度由低至高（例如 0.3 M、0.4 M、0.5 M）的 PBS 缓冲液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱 2 次，每次 3 个柱体积。
    6. 采用 SDS-PAGE21 鉴定不同浓度梯度中的 RBD-ST。

4. OMV-RBD 生物偶联与纯化

  1. 采用BCA法测定蛋白质浓度（参见 材料表).
    1. 将标准BSA蛋白溶液从2 mg/mL逐级稀释至0.0625 mg/mL，将纯化的OMV-SC和RBD-ST稀释10倍，然后按50:1（v/v）的比例混合BCA工作液A和B（试剂盒中提供）。
    2. 加入稀释的蛋白溶液（25 µL/孔），与BCA工作液（200 µL/孔）混合；37 °C孵育30分钟。
    3. 在562 nm处测定每孔的吸光度（OD），并根据标准曲线计算蛋白浓度22.
  2. 按照以下步骤对OMV-SC和RBD-ST进行生物偶联。
    1. 将OMV-SC与RBD-ST按40:1（w/w）的比例在PBS中混合。
    2. 在4 °C、15 rpm条件下垂直旋转过夜以混匀混合物。
      注意：不同抗原的反应比例可能不同。可根据抗原的特性尝试不同的反应比例。
  3. 验证反应效率。
    1. 制备10 µL的OMV-SC、RBD-ST及反应产物（步骤4.2）。加入2.5 µL的5x上样缓冲液（参见 材料表），在100 °C下加热样品5分钟。将样品加入凝胶孔中（每孔10 µL）。以60 V电泳20分钟，然后改为120 V电泳1小时。
    2. 将蛋白质从凝胶转移至PVDF印迹膜（参见 材料表在100 V电压下电泳70分钟。
    3. 将膜放入5%脱脂奶粉/TBST中，摇动孵育1小时。随后，用TBST洗涤3次，每次5分钟，摇动洗涤。
    4. 将膜放入 0.1% His-Tag 抗体/TBST 中（参见 材料表）振荡孵育1小时，随后用TBST缓冲液振荡洗涤3次，每次5分钟。
    5. 将膜放入0.02%抗小鼠IgG1抗体（HRP）/TBST中（参见 材料表）振荡孵育40分钟，随后用TBST缓冲液振荡洗涤3次，每次5分钟。
    6. 加入增强型化学发光溶液（参见 材料表）并曝光膜。
  4. 进行OMV-RBD的纯化。
    1. 将1 mL反应后的OMV-RBD溶液稀释至10 mL，然后在150,000 x g 4 °C 下孵育 2 小时。
    2. 使用移液器弃去上清液，并用10 mL PBS重悬沉淀物。将悬液在150,000 x g 4 °C 下孵育 2 小时。
    3. 弃去上清液，用1 mL PBS重悬沉淀。
      ​注意：如果抗原的溶解度低得多，可通过尺寸排阻色谱实现相同的分离效果19.

5. 表征

  1. 进行动态光散射（DLS）。
    1. 将样品稀释至 100 µg/mL 浓度，并向样品池中加入 1 mL 样品。
    2. 选择 "Size" 作为 "Measurement type"，"Protein" 作为 "Sample material"，"Water" 作为 "Dispersant"，"25 °C" 作为 "Temperature"，然后加载样品并自动测量23。
  2. 使用透射电子显微镜（TEM）拍摄图像。
    1. 将样品稀释至 100 µg/mL。取一个 200 目铜网，加入 20 µL 样品，静置吸附 10 分钟。
    2. 用滤纸吸去溶液，向支持膜上加入 20 µL 3% 醋酸铀酰溶液，染色 30 秒。
    3. 吸去醋酸铀酰溶液，在室温下自然干燥 1 小时。
    4. 将样品载入 TEM 系统（参见 Table of Materials），在 80 kV 下拍摄图像。

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结果

本方案的流程图见图1。该方案可作为利用OMVs作为疫苗平台的通用方法；只需根据抗原类型选择合适的表达系统即可。

图2 提供了一种可行的质粒设计策略。SC基因通过一个柔性连接子与ClyA基因相连，而ST则在RBD基因的5'端连接了一个用于纯化和验证的His标签基因。Western blot结果显示，随着OMV-SC的增加，反应逐渐趋于完全（图3A）。经过超速离心后，几乎所有未反应的RBD-ST均保留在上清液中。第二次超速离心并未比第一次带来显著的进一步提升（图3B）。

通过DLS测定颗粒尺寸分布（图4）。OMV-SC的Z平均水动力学直径为133 nm，而OMV-RBD为152.6 nm（表1）。这些差...

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讨论

为了构建一种"即插即用型"纳米颗粒疫苗平台，将SC融合的ClyA蛋白在BL21(DE3)菌株中进行表达，该菌株因其在蛋白表达方面的优势而成为重组蛋白生产中最广泛使用的模型之一24，从而可在细菌增殖过程中使足够数量的SC片段展示于OMVs表面。同时，制备了ST融合的目标抗原，用于抗原与OMVs之间的化学偶联。该实验方案的优势及未来应用前景主要体现在三个方面：第一，实现了不同抗原与生物纳米颗粒之间的"即插即用"系统，反应与纯化过程快速简便，在应对突发传染病等场景的疫苗开发中具有显著优势；第二，实现了抗原的高密度展示，为某些免疫原性较低的抗原提供了有效的疫苗设计策略；第三，OMVs与RBD（抗原蛋白）的分别表达有利于保持抗原的高活性，因为传统的原核表达系统缺乏特定辅因子、分子伴侣以及翻译后修饰等功能，可能导致蛋白失活或错误折叠。

在质粒构建过程中，选择ClyA作为与SC连接的靶标，主要是由于ClyA的C末端具有较为松散的桶状结构。研究表明，血红蛋白蛋白酶（Hbp）自转运蛋白能够展示来自Streptoc...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到重庆市自然科学基金重点项目（编号：cstc2020jcyj-zdxmX0027）和国家自然科学基金项目（编号：31670936，82041045）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氨苄青霉素钠Sangon BiotechA610028
自动细胞计数仪CountstarBioTech
BCA蛋白定量试剂盒cwbiocw0014s
ChemiDoc Touch成像系统Bio-rad
动态光散射仪MalvernZetasizer Nano S90
电泳装置CavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST缓冲液Sangon BiotechC520009
山羊抗小鼠IgG1多克隆抗体Abcamab97240
高速冷冻离心机BioridgeH2500R
His标签小鼠单克隆抗体Cell signaling technology2366s
咪唑Sangon BiotechA600277
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Sangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
脱脂奶粉Sangon BiotechA600669
OPM-293细胞培养基Opm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST质粒Wuhan genecreat biological techenology
磷酸盐缓冲液ZSGB-bioZLI-9061
线性聚乙烯亚胺Polysciences23966-1
预染蛋白MarkerThermo26616
pThioHisA ClyA-SC质粒Wuhan genecreat biological techenology
PVDF Western印迹膜Roche03010040001
Quixstand台式系统（100 kD中空纤维柱）GE healthcare
SDS-PAGE上样缓冲液（5x）BeyotimeP0015
氯化钠Sangon BiotechA100241
SuperSignal West Pico PLUS（增强型化学发光溶液）Thermo34577
悬浮仪Life TechnologyHula Mixer
透射电子显微镜HitachiHT7800
胰蛋白胨OxoidLP0042B
超速离心机Beckman coulterXPN-100
紫外分光光度计HitachiU-3900
酵母提取物Sangon BiotechA610961

参考文献

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