小鼠脂肪源性间充质干细胞向老龄小鼠卵母细胞的线粒体转移

摘要

本文介绍了从小鼠脂肪来源的间充质干细胞中分离线粒体，随后将线粒体转移至老龄小鼠卵母细胞中，以提高卵母细胞质量。

摘要

由于卵母细胞的数量和质量随年龄增长而下降，35岁以上女性的生育能力已显著降低。目前维持卵母细胞质量的分子机制尚不明确，因此提高35岁以上女性的出生率仍存在困难。卵母细胞所含的线粒体数量超过体内任何其他类型的细胞，任何线粒体功能障碍都可能导致卵母细胞质量下降。20世纪90年代，卵母细胞胞质移植在人类生殖领域取得了显著成功，但也引发了伦理争议。自体线粒体移植有望成为提高因年龄增长而导致质量下降的卵母细胞质量的一种有效技术。在本研究中，我们采用来自老龄小鼠的脂肪来源干细胞作为线粒体供体，以提高老龄小鼠卵母细胞的质量。自体线粒体移植技术的进一步发展将为高龄女性不孕症提供一种新的有效治疗手段。

引言

影响女性生育能力的重要因素之一是卵母细胞老化；卵母细胞质量下降是高龄女性不孕的主要原因。然而，卵母细胞老化的根本原因以及调控卵母细胞质量的分子机制仍不明确。先前的研究表明，线粒体的数量和质量均参与卵母细胞的质量控制及胚胎发育^1,2,3。线粒体在数量和质量上的减少与衰老密切相关³。

为改善衰老卵母细胞中线粒体的功能，人们已进行了多种尝试，包括线粒体营养补充和线粒体移植。众所周知且有效的线粒体营养补充剂包括辅酶Q10（CoQ10）、α-硫辛酸（α-LA）和白藜芦醇（RSV）⁴。研究表明，补充CoQ10不仅可改善与年龄相关的卵母细胞数量和质量下降，还能促进卵母细胞的正常发育和排卵⁵。α-LA可延缓与衰老相关的卵母细胞质量下降以及多囊卵巢综合征（PCOS）患者的代谢表型恶化^6,7。白藜芦醇可减少衰老小鼠中异常纺锤体和染色体排列异常的卵母细胞数量，同时以剂量依赖的方式影响胚胎发育⁸。然而，由于线粒体营养补充剂在临床上的效果尚未达到预期水平，仍需探索其他有效的治疗方法。

线粒体转移的首次尝试于1997年进行。将年轻供体卵母细胞的细胞质转移至年老受体卵母细胞中，可改善年老患者的卵母细胞质量，并成功产下健康婴儿⁹，这正是该技术应用的理论基础。然而，同种异体卵母细胞细胞质转移由于两个主要原因而无法应用于临床实践：一是遗传异质性问题，二是由供体线粒体移植引发的监管问题。先前的研究表明，自体细胞线粒体移植可提高年老小鼠的卵母细胞质量、胚胎发育能力及生育力¹⁰，且不存在伦理问题或遗传异质性问题，从而解决了将供体卵母细胞细胞质转移至受体卵母细胞所带来的一些问题^10,11。

同时，自体细胞线粒体转移在改善卵母细胞质量方面的效果优于以往对线粒体进行营养补充的方法¹¹。因此，自体细胞线粒体移植是该技术临床应用的合适选择¹²。脂肪来源的干细胞（ADSCs）可通过微创技术获取，易于分离和培养，是再生医学理想的"种子"细胞。ADSCs富含线粒体，且其线粒体功能不随年龄增长而衰退，表明ADSCs是优质的线粒体来源^13,14。 在本实验方案中，我们介绍了一种将小鼠脂肪来源的间充质干细胞的线粒体转移至老龄小鼠卵母细胞以提高卵母细胞质量的方法。该模型对人类ADSC自体线粒体转移技术具有重要参考价值。

方案

所有描述的动物实验均经苏州大学附属第三医院动物研究伦理委员会批准。所有操作均遵循适当的动物护理和使用机构及国家指南。有关本方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参见材料表。

1. 老年小鼠脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）的分离与鉴定

1. 在戊巴比妥钠麻醉下通过颈椎脱位处死老龄小鼠（10月龄，平均三只），并在分离脂肪组织前将其浸入75%酒精中5分钟。
   注意：在75%酒精中浸泡5分钟可有效减少原代细胞的污染。
2. 在双侧腹股沟皮肤上做2 cm切口，暴露皮下脂肪，用镊子分离皮下脂肪。使用无菌眼科剪刀收集小鼠双侧腹股沟脂肪（避免剪切皮下组织）。将脂肪组织置于预冷的15 mL无菌离心管中，并立即运送至细胞培养实验室。
3. 将脂肪组织转移至6孔板中，用含100 U/mL青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次。去除脂肪组织下方的血管、脂肪筋膜及结缔组织，并将其切成约0.5 cm × 0.5 cm × 0.5 cm的小块。
   注意：在分离脂肪干细胞时，常伴有血管内皮细胞的污染。从脂肪组织中去除血管可减少血管内皮细胞的污染。
4. 将剪碎的脂肪组织转移至等体积的I型胶原酶溶液（I型胶原酶终浓度为0.1%），在37 °C下消化30分钟。
5. 加入等体积的完全培养基（含10%胎牛血清的DMEM F-12培养基）以中和I型胶原酶，于600 × g离心10分钟，弃去上清液及脂肪组织。
6. 用完全培养基重悬细胞沉淀，通过40 µm细胞滤器过滤去除未消化的组织，再于600 × g离心5分钟。
7. 用5 mL完全培养基重悬细胞，使用1 mL移液器轻柔吹打数次以形成单细胞悬液。取少量细胞悬液置于血细胞计数板上，在显微镜下检查，确认仅存在单个细胞而无细胞团块。将单细胞悬液接种至25 cm²细胞培养瓶中，在37 °C、5% CO₂培养箱中培养。
8. 48小时后更换培养基，之后每2–3天更换一次培养基。
9. 培养7–10天后，当细胞融合度达到80%–90%时进行传代。吸除完全培养基，用2 mL PBS洗涤细胞，随后加入2 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA进行细胞消化^15,16。
10. 加入成脂诱导培养基培养14天，诱导ADSC分化为脂肪细胞；将ADSC接种于2%明胶包被的24孔板中，加入成骨诱导培养基培养28天，诱导其向成骨细胞分化；对于神经分化，使用神经诱导培养基培养ADSC，随后通过免疫荧光检测神经元特异性烯醇化酶和神经丝中等多肽¹⁵。
    1. 室温下用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，随后用含0.5% Triton X-100的PBS处理15分钟以通透细胞。
    2. 用含3% BSA的PBS封闭后，将细胞与一抗（见材料表）在封闭液中4 °C孵育过夜。
    3. 加入二抗孵育45分钟，再用DAPI染色10分钟，最后在荧光显微镜下观察细胞。
11. 用0.05%胰蛋白酶/EDTA收集单细胞ADSC悬液，室温下600 × g离心5分钟，弃上清后用PBS重悬并调整细胞密度至1 × 10⁶/mL。将细胞悬液分装至1.5 mL微量离心管中（每管100 µL），加入FITC标记的兔抗小鼠CD29、CD90、CD34和HLA-DR单克隆抗体（抗体浓度为0.5 µg/mL）。对照组加入等体积的兔IgG FITC抗体，冰上孵育30分钟，用PBS洗涤去除未结合抗体，通过流式细胞术检测ADSC表面标志物¹³。

2. 从脂肪干细胞中分离线粒体

注意：所有线粒体分离操作必须在冰上进行。

1. 当ADSCs生长至90%密度时，用2 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA消化细胞，在600 × g条件下离心5分钟，收集并计数细胞，每次提取取1 × 10⁷个细胞。
2. 用2 mL无菌PBS洗涤细胞后，将细胞重悬于2 mL线粒体提取缓冲液中（缓冲液配制：0.1 M Tris-MOPS溶液10 mL，0.1 M EGTA/Tris溶液1 mL，1 M蔗糖溶液20 mL，加蒸馏水定容至100 mL，调节pH至7.4），并加入1×蛋白酶抑制剂混合物，冰上孵育5分钟。
3. 使用玻璃匀浆器（2.0 mL）匀浆细胞20–30次，通过台盼蓝染色检测匀浆程度。
   注：染色细胞比例应约为80%。过度匀浆会破坏线粒体结构。
4. 将细胞匀浆液在600 × g条件下离心15分钟，将上清液转移至新的预冷1.5 mL微量离心管中，并重复操作一次。
5. 将上清液在7,500 × g条件下离心15分钟，弃去上清液。用约100 µL预冷的线粒体注射缓冲液（225 mM甘露醇、75 mM蔗糖、10 mM KCl、10 mM Tris-HCl和5 mM KH₂PO₄，pH 7.2）洗涤线粒体沉淀并重悬，蛋白浓度为1–5 mg/mL（总蛋白浓度）。将线粒体悬液置于冰上运输。
6. 通过JC-1流式细胞术分析和Western blot（VDAC1、β-actin和Lamin B）分析分离线粒体的功能与纯度¹³。
   1. 将分离的线粒体分为三组：二甲基亚砜（DMSO）组、JC-1染色组以及经30分钟羰基氰化间氯苯腙（CCCP）预处理后再进行JC-1染色组。
   2. 在7,500 × g条件下离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于缓冲液中。
   3. 通过流式细胞术检测JC-1单体（FITC通道）和聚集体（PE通道）的荧光强度。通过测定PE通道与FITC通道平均荧光强度的比值，评估分离线粒体的膜电位。
      ​注：上述步骤需在避光条件下进行。

3. 卵巢超数排卵

1. 对10月龄雌性C57BL/6小鼠进行腹腔注射10 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）以诱导超数排卵。48小时后，腹腔注射10 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
2. 在注射hCG后13小时，用显微镊撕开肿胀的输卵管，释放出卵丘复合体。在37 °C条件下，使用含透明质酸酶（0.3 mg/mL）的M2培养基溶解卵丘细胞。
   ​注意：溶解时间应少于5分钟。尽量缩短卵丘复合体暴露于透明质酸酶的时间，因为长时间暴露可能损害卵母细胞的发育潜能。

4. 线粒体转移联合卵胞浆内单精子注射（ICSI）

1. 将无尾精子放入线粒体裂解液中。通过超声处理剪切获得无尾精子¹⁷将无尾精子置于线粒体裂解液中，使50 µL裂解液中含有100个精子。
   注意：由于线粒体悬液略带黏性且不稳定 体外在30分钟内完成注射，一旦显微注射针堵塞，应立即更换。显微注射针的最佳内径为5 µm。
2. 使用显微注射仪在倒置显微镜（200倍）下将约2 pL线粒体呼吸缓冲液或含精子的线粒体悬液注入卵母细胞中（参见 材料表30分钟内按照Hiramoto所述、Mehlmann和Kline描述的方案进行^10,18.
   注意：注入的线粒体悬液占卵母细胞总体积的1%-3%。需控制细胞质中线粒体悬液的体积（1%-3%），以确保注射的一致性。
3. 注射后，将受精卵置于M2培养基中平衡15分钟，然后将存活的受精卵转移至M16培养基中培养。
4. 观察存活的可育卵子，检查其平滑的形态、原核形成以及第二极体的释放¹⁹每天上午9:00和下午6:00观察、拍照并计数胚胎，持续4天。最后收集囊胚并冻存于-80 °C冰箱中，用于ATP和mtDNA拷贝数测定，以评估线粒体移植的数量及改善效果。
   1. 制备标准质粒（用于绝对定量的质粒，方法如前所述）¹³)，用于根据 1 × 10 的拷贝数确定线粒体拷贝数⁷, 1 × 10⁶, 1 × 10⁵, 1 × 10⁴, 1 × 10³, 1 × 10²，以及 1 × 10¹将胚胎转移至灭菌管中，加入20 µL裂解缓冲液以释放线粒体DNA。随后，在55 °C下灭活裂解液中的蛋白酶20分钟，再于95 °C下灭活10分钟。
   2. 使用以下体系通过荧光定量PCR测定mtDNA拷贝数：5 µL PCR混合液，0.5 µL B6引物-正向，0.5 µL B6引物-反向，2 µL裂解产物，2 µL ddH₂O₂O. 按照以下PCR条件进行：第一阶段，95 °C 预变性3 min；第二阶段，95 °C 变性30 s，58 °C 退火30 s，72 °C 延伸30 s；循环40次。

结果

在本实验方案中，我们从小鼠脂肪组织中分离并鉴定了脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）（图1）。为获得分离的线粒体，需使用玻璃匀浆器破坏细胞膜（图2A）。关键是要获得均匀的线粒体组分，避免出现大块聚集体，以防止微注射管堵塞。首先使用200 µL，然后使用10 µL移液器吸头轻柔重悬匀浆液；最后需用29 G针头缓慢吸取两到三次，以获得可用于注射的线粒体组分（图2B）。采用线粒体膜电位荧光探针进行标记，以确认所提取的线粒体具有活性（图2C）。通过JC-1流式细胞术和Western blot分析线粒体的纯度和功能（图2D、E）。

为缩短显微注射时间，预先将去尾精子置于线粒体组分中，并在注射过程中将线粒体组分从冷冻状态逐渐平衡至室温

讨论

卵母细胞所含的线粒体数量超过体内任何其他类型的细胞，其线粒体DNA拷贝数约为1-5 × 10⁵。线粒体对卵母细胞的成熟、受精以及胚胎发育至关重要，因此任何线粒体功能障碍都可能导致卵母细胞质量下降。线粒体数量和质量的减少与生理性衰老密切相关。本实验方案介绍了一种简单的方法，从老龄小鼠的脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）中分离线粒体，并将其转移至老龄小鼠的卵母细胞中，以尝试改善老化卵母细胞的质量。

自1997年科学家完成世界上首例卵母细胞胞质移植实验，并成功改善高龄患者的卵母细胞质量以来，线粒体移植技术便受到广泛关注。然而，异体线粒体移植存在伦理、法律问题，以及线粒体遗传异质性可能带来的长期健康风险。近年来，由于卵原干细胞的发现，自体卵原干细胞线粒体移植受到更多关注；但卵原干细胞的获取需采用高度侵入性方法，且难以培养和纯化，限制了其应用²⁰。脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）可通过微创技术获取，易于分离和培养²¹，是再生医学理想的"种子"细胞。更重要的是...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	Gibco	25300054	细胞培养
4% 多聚甲醛	beyotime	P0099	免疫荧光
40 μm 细胞筛	Corning	352340	ADSC 分离
成脂诱导剂	Cyagen	HUXXC-90031	多向分化
茜素红染色液	Sigma	A5533	多向分化
抗 CD29 抗体	BD Biosciences	558741	流式分析
抗 CD34 抗体	BD Biosciences	560942	流式分析
抗 CD90 抗体	BD Biosciences	553016	流式分析
抗 HLA-DR 抗体	BD Biosciences	555560	流式分析
β-actin	Abcam	ab-8226	线粒体功能检测
BSA	Sigma	V900933	免疫荧光
CCCP	Solarbio	C6700	线粒体 JC-1 流式分析
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711	qPCR
I 型胶原酶	Sigma	SCR103	ADSC 分离
DAPI	Invitrogen	D1306	免疫荧光
DMEM-F12	Gibco	11320033	细胞培养
DMSO	Sigma	276855	线粒体 JC-1 流式分析
EGTA	Sigma	324626	线粒体分离
FBS	Gibco	10100147	细胞培养
流式细胞仪	BD Biosciences	FACSCanto™ II	ADSC 特性鉴定
荧光显微镜	leica	DM2500	免疫荧光
明胶	Sigma	48722	多向分化
玻璃匀浆管	Sangon	F519062	线粒体分离
hCG	Aibei	M2520	卵巢超数排卵
透明质酸酶	Sigma	H1115000	卵巢超数排卵
倒置显微镜	Olympus	IMT-2	显微注射
线粒体分离染色试剂盒	Sigma	CS0760	线粒体 JC-1 流式分析
JC-1	Sigma	T4069	线粒体功能检测
KCl	Sigma	P5405	线粒体转移
KH2PO4	Sigma	P5655	线粒体转移
LaminB	Abcam	ab-16048	线粒体功能检测
M16 培养基	Sigma	M7292	胚胎细胞培养
M2 培养基	Sigma	M7167	胚胎细胞培养
甘露醇	Sigma	M9546	线粒体转移
显微注射仪	Olympus+ eppendorf	IX73	线粒体转移
MitoTracker 红色染料	Invitrogen	M22425	线粒体染色
MOPS	Sigma	M1442	线粒体分离
神经丝中等链多肽 (NFM)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16143	多向分化
成神经诱导剂	Gibco	A1647801	多向分化
神经元特异性烯醇化酶 (NSE)	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	多向分化
油红 O	Sangon	E607319	成脂分化
油红 O 溶液	Sigma	O1516	多向分化
成骨诱导剂	Cyagen	HUXXC-90021	多向分化
PBS (磷酸盐缓冲液)	Hyclone	SH30256.LS	细胞培养
青霉素和链霉素	Hyclone	SV30010	细胞培养
PMSG	Aibei	M2620	卵巢超数排卵
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8340	线粒体分离
蔗糖	Sigma	V900116	线粒体分离
Tris	Sigma	648314	线粒体分离
Tris-HCl	Sigma	108319	线粒体转移
Triton X-100	beyotime	P0096	免疫荧光
VDAC	Abcam	ab-14734	线粒体功能检测