本文介绍了一种利用重水（deuterium oxide）和气相色谱-质谱联用技术（GCMS）分析总脂肪酸的经济型定量方法 从头合成 棕色脂肪组织中的脂质生成 体内.
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方法文章
定量测定 从头合成 利用重水研究棕色脂肪组织中的脂肪酸合成
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
脂肪酸合成是一条复杂且高度耗能的代谢通路，在调控全身代谢稳态及其他生理与病理过程中具有重要的功能作用。与其他关键代谢通路（如葡萄糖代谢）不同，脂肪酸合成功能通常未被常规评估，导致对代谢状态的解读不完整。此外，目前尚缺乏面向领域新手、公开可用的详细实验方案。本文介绍一种经济的定量方法，利用重水（deuterium oxide）结合气相色谱-质谱联用技术（GCMS），用于分析总脂肪酸 从头合成 棕色脂肪组织中的合成 体内该方法可独立于碳源来测量脂肪酸合酶产物的合成，几乎适用于任何小鼠模型中的任何组织以及任何外界干扰条件下的分析。本文提供了气相色谱-质谱联用（GCMS）的样品制备细节及后续计算方法。我们重点分析棕色脂肪，因其具有较高的 从头合成 脂肪酸合成及其在维持代谢稳态中的关键作用
引言
肥胖及相关代谢性疾病是一种危及当代及后代的全球性流行病1,2。尽管常被简化为能量摄入与消耗失衡的结果，但与肥胖相关的代谢紊乱实际上影响着大量由环境和内源性因素调控的代谢通路3。然而，在代谢紊乱动物模型中，仅有少数通路被常规检测。
例如，葡萄糖代谢通常通过葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验来测定，这可能得益于便携式葡萄糖监测仪使用的简便性4。全身体内葡萄糖和脂质氧化的相对速率也通常基于间接热量测定法测得的呼吸交换比进行估算5,6。然而，代谢的大多数其他方面并未被常规地进行功能性评估，这导致对代谢状态的解释不完整，并可能遗漏潜在的治疗选择。其中一个主要的代谢通路是新生脂质合成（de novo lipogenesis）。
从头脂质生成（de novo lipogenesis, DNL）是指由前体物质合成新的脂肪酸的过程。葡萄糖被认为是参与全身DNL的主要前体7，但其他前体如乙酸盐、果糖、乳酸和支链氨基酸也被证明在特定组织和....
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方案
所有实验均经辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物照护与使用委员会批准。
1. D2O的制备
注意：为避免实验误差，需为所有小鼠在整个实验期间准备充足的溶液或饮用水。
- 用于腹腔注射：制备0.9% w/v的生理盐水D2O，通过将每升D中溶解9 g NaCl2O. 通过无热原的过滤器过滤 0.2 µm 过滤除菌。
- 用于饮用2O-水：制备8% v/v D2将80 mL的D与O-富集水混合，作为饮用水使用2O 型血920 mL普通饮用水。普通饮用水可从小鼠饲养设施获取。通过无热原的滤器过滤 0.2 µm 过滤除菌。
2. 温度适应对棕色脂肪组织活性的调节
- 在开始温度适应前两周，将小鼠分笼饲养，每笼两只。将小鼠的饮水更换为水瓶供水，使其适应，并将所有笼盒维持在 22 °C 环境中。
- 在开始温度适应前一周，设置小鼠环境培养箱的相应温度：30 °C 用于热中性环境，22 °C 用于室温，18 °C 用于冷暴露。
- 在温度适应开始时，更换为无环境富集的新....
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结果
根据 D2在步骤1所述的O剂量下，我们通常发现体内水的富集度范围为2.5%至6%，且体内水中的氘基线富集水平在1小时内迅速达到，并在整个研究期间保持稳定。 通过 8% 富集饮用水（图1）。连续稳态的体水富集是第6步计算中所采用的假设，因此我们建议在新的实验模型中对体水富集的动力学进行实验验证。
我们发现，其数量 从头合成 在室温下，相对于热中性条件下的棕色脂肪组织（BAT），合成脂肪酸的含量增加图2）。在热中性环境和室温下饲养3天后，小鼠棕色脂肪组织（BAT）中棕榈酸盐的同位素异构体质量分布2O 给药在室温下显示出更高的 M1 和 M2 氘代富集度图 2A）。这种低温富集现象不仅发生在棕榈酸盐中，也广泛存在于棕色脂肪组织（BAT）中的多种脂肪酸中。图2B）。在室温下，.......
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讨论
理解复杂代谢通路之间的平衡与相互作用是揭示代谢相关疾病生物学基础不可或缺的一步。本文展示了一种无创且低成本的方法，用于检测代谢变化 从头合成 脂肪酸合成。该方法改编自先前已发表的方法，这些方法开发了用于估算的计算方式 从头合成 基于脂肪酸氘富集率的合成通量31 以及利用氘代丙酮交换法测定D的相对百分比2体液中的氧39近年来，我们采用此处所述方法，研究了脂肪组织库、脑、肝脏及肿瘤中多种脂肪酸合成的变化。9,22,40该方案包含若干关键步骤和可调整的环节，这些环节涉及整体实验设计以及本方法所采用的分析方法和计算方式。计算的替代方法 从头合成 稳定同位素示踪剂用于脂肪酸合成的研究也广泛应用，其中包括由Hellerstein等人开发的替代性质量同位素异构体分布分析（MIDA）方法。
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披露
作者无任何披露事项。
致谢
我们感谢Sanchez-Gurmaches和Wallace实验室成员的宝贵讨论。本工作获得了美国心脏协会（18CDA34080527授予JSG，19POST34380545授予RM）、美国国立卫生研究院（NIH R21OD031907授予JSG）、辛辛那提儿童医院医疗中心（CCHMC）董事会奖、CCHMC儿科基因组学中心奖以及CCHMC孟德尔基因组学中心的资助。 & 治疗学奖。本工作部分由辛辛那提消化系统疾病研究中心核心设施 NIH P30 DK078392 项目资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。RT 和 MW 获都柏林大学学院 Ad Astra 博士后奖学金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4 mL 玻璃小瓶 | Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| 0.2 µm 滤膜 | Olympus Plastic | 25-244 | |
| 26G 带针头注射器 | BD | 309597 | |
| 丙酮 | Merck | 34850 | |
| 乙腈 | Merck | 900667 | |
| 带隔垫的蓝色 GC 螺口盖 | Agilent | 5190-1599 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 氯仿 | Sigma | 366927 | |
| 重水 | Sigma | 151882 | |
| 二叔丁基-4-甲基苯酚 (BHT) Select FAME 气相色谱柱 | Merck | B1378 | |
| 二叔丁基-4-甲基苯酚 (BHT) Select FAME 气相色谱柱 | Agilent | CP7419 | |
| EDTA 采血管 | Sarstedt | 411395105 | |
| 乙醇 | Merck | 51976 | |
| 十六碳烯-d31 酸 | Larodan | 71-1631 | |
| 正己烷 | Merck | 34859 | |
| 甲醇 | Merck | 34860 | |
| 微量离心管 | Olympus Plastic | 24-282 | |
| 小鼠环境控制舱 | Caron | Caron 7001-33 | |
| 氯化钾 | Fisher Bioreagents | BP366-500 | |
| 磷酸钾 | MP Biomedicals | 194727 | |
| SafeLock 微量离心管 | Eppendorf | 30120086 | |
| 螺口棕色 GC 小瓶 | Agilent | 5182-0716 | |
| 氯化钠 | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| 氢氧化钠 | Merck | S5881 | |
| 磷酸氢二钠 | Fisher Bioreagents | BP332-500 | |
| 硫酸钠 | Merck | 239313 | |
| 硫酸 | Merck | 258105 | |
| 小瓶内插管 | Agilent | 5183-2088 |
参考文献
- The Lancet, Diabetes Endocrinology. Childhood obesity: a growing pandemic. The Lancet. Diabetes & Endocrinology. 10 (1), 1(2022).
- Gonzalez-Muniesa, P., et al. Obesity. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17034(2017).
- Müller, T. D., Blüher, M.....
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重印与许可
