活体显微镜研究小鼠肝脏中血小板-白细胞-内皮细胞相互作用

摘要

活体显微成像是一种强大的工具，能够揭示快速和/或连续过程的时间与空间关系。本文中，我们描述了一种实验性脓毒症（内毒素血症）小鼠模型中，在肝脏窦状隙内评估蛋白质-蛋白质相互作用以及血小板-中性粒细胞-内皮细胞相互作用的实验方案。

摘要

炎症与血栓形成是主要发生在微循环中的复杂过程。尽管标准组织学可揭示炎症和血栓形成的终末通路，但无法呈现这些过程在时间进程中的动态变化。活体显微成像（IVM）是一种利用活体动物成像技术，以获取生理过程时间动态信息的方法。 体内该方法在评估循环系统中细胞与蛋白质相互作用时尤为有效，因为此类相互作用通常依赖于快速且连续发生的事件。尽管体内显微成像技术（IVM）是一种极为强大的成像方法，能够观察复杂的生物学过程 体内在规划体内显微成像（IVM）研究时，有许多方法学因素需要重点考虑。本文概述了进行肝脏活体成像的流程，指出了其中的重要注意事项及可能遇到的潜在问题。因此，本文描述了利用IVM研究肝窦中血小板-白细胞-内皮细胞相互作用的方法，以探讨在不同急性肝损伤模型中各细胞成分的相对作用。

引言

炎症与血栓形成是主要发生在微循环中的复杂过程。本方案概述了用于肝脏微血管成像的手术准备工作 体内尽管标准组织学可能有助于了解炎症和血栓形成的终末通路，但它无法显示整个过程中发生的时间动态变化。此外，该方法在评估微血管循环中短暂的细胞与蛋白质相互作用时尤为强大，因其具备捕捉这些动态事件的能力， 通过 活体显微镜技术常用于观察生物系统中频繁发生的快速且连续的相互作用。本文描述了利用活体显微技术研究肝窦内血小板-白细胞-内皮细胞相互作用的方法，以探讨在不同急性肝损伤模型中各细胞成分的相对作用。

尽管该手术准备和成像方法有可能被应用于多种炎症和病理模型，本文重点介绍两种血管炎症模型：小鼠内毒素血症脓毒症模型和对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤模型。早在20世纪30年代，随着内毒素（脂多糖；LPS）的分离及其在脓毒症进展中关键分子作用的探索，注射内毒素以诱导小鼠脓毒症实验模型的研究即已开始¹。尽管该模型存在一定局限性，因为LPS仅是革兰氏阴性菌的单一组分，但该方法已被广泛接受并普遍使用，且操作相对简便快捷。此外，该模型能够快速而准确地复制脓毒症的生理表现¹。鉴于肠道内毒素吸收在肝病及炎症发生中的重要作用²，该模型是研究小鼠肝脏中血小板-白细胞-内皮细胞相互作用的理....

方案

所有动物实验方案均经贝勒医学院机构动物护理和使用委员会及研究部门批准 & Michael E. DeBakey 退伍军人事务医疗中心发展委员会。所有实验均为终末性实验，实验结束时在手术麻醉深度下实施安乐死。参见 材料表 有关本方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息。

1. 抗体和染料的制备

1. 抗体与染料的选择
   注意：可同时观察到的荧光颜色数量取决于具体的显微镜配置。在本实验所用系统中，可同时可视化四种不同波长的信号。
   1. 血管的可视化：
      1. 根据实验设计，使用内皮特异性抗体（例如 CD31）和/或在血浆中均匀分布的分子（例如葡聚糖或白蛋白）对血管系统进行标记。
         注意：本文描述使用 Texas Red 标记的葡聚糖（150 kDa；每只小鼠 250 µg）。该高分子量物质的优势在于其在急性炎症期间能够保留在血管腔内。使用抗体标记时需谨慎，避免选用可能干扰内皮功能的抗体。
   2. 血小板的可视化：
      1. 为识别血小板，可使用基因修饰小鼠（例如 R26R-EYFP^f/f/PF4-Cre）或血小板特异性抗体（例如抗 GPIbβ 抗体）进行活体显微成像（IVM）。有关血小板荧光标记使用的详细信息，请参考先前发表的研究

结果

评估波形蛋白杆状结构域对白细胞黏附于炎症内皮细胞的影响
在脓毒症诱导的肝损伤炎症急性期，白细胞P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）会与内皮细胞和血小板上的P-选择素结合。然而，研究表明，重组人源波形蛋白杆状结构域（rhRod）可结合P-选择素，并阻断白细胞与内皮细胞及血小板的黏附。本实验方案在脓毒症小鼠模型中用于实时观察rhRod对肝脏中依赖PSGL-1的白细胞黏附的影响。研究发现，rhRod在肝窦内与P-选择素共定位，确实能够减少肝脏中的白细胞黏附⁵。

对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中肝脏血小板的募集
血小板在肝脏中的积聚会加剧对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤。本实验方案用于评估几丁质酶3样蛋白1（Chi3l1）在肝窦内血小板募集过程中的作用。通过应用该方案，可在APAP诱导肝损伤的急性期可视化血小板的募集情况。研究发现，给予APAP后会导致肝脏中Chi3l1表达升高以及血小板积聚增加，而在Chi3l1^-/-.......

讨论

本方法学论文旨在概述在稳态条件下以及给予内毒素或对乙酰氨基酚（APAP）后，稳定获取小鼠肝脏高分辨率活体成像图像和视频所需的必要步骤。尽管该实验方案已成功实现对肝脏中血小板-白细胞-内皮细胞相互作用数据的持续获取，但在采用此成像范式时，仍存在若干关键操作步骤需严格遵循，并需避免潜在的技术陷阱。成功实施本方案的关键包括：在抗体选择阶段进行充分而周密的规划，以避免干扰细胞/蛋白功能；采用规范的手术技术，以防止组织损伤并维持稳态下的血流动力学；在肝脏外置过程中谨慎操作，避免肝脏缺血或额外器官的外置；以及设置恰当的成像参数，以防止光毒性或染料引起的组织损伤。

通过练习，本方案可实现对肝脏微血管的高质量、可重复成像 体内 与现有的其他研究方法相比，本方法具有显著优势。尽管本文概述了两种肝脏病理学模型，即内毒素和对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤，但该实验方案的基础原理有望应用于多种其他损伤模型。此外，尽管文中已列出用于研究血小板-白细胞-内皮细胞相互作用的抗体和分析技术，但通过合理的规划和抗体选择，本方案亦可调整用于研究其他感兴趣的细胞或蛋白质。例如，在APAP诱导的损伤.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>手术用品
2" × 2" 无纺布海绵	McKesson 医疗外科	92242000	用于肝脏分离
#4-0 带针编织丝线缝合线	SOFSILK	N/A	4-0 软丝涂层编织黑色不可吸收缝线：C-1 切割针
#4-0 丝线编织缝合线（无针）	Ethicon	N/A	4-0黑色编织丝线，不可吸收
21 G 钝针（0.5 英寸）	SAI Infusion Technologies	B21-50	用于连接气管造口管末端，以便与呼吸机相连。替代来源为 Instech。
23 G钝针（0.5英寸）	SAI Infusion Technologies	B23-50	这用于血管导管，以便与注射器连接。替代来源为 Instech
解剖剪（尖头）	Kent Scientific	INS600393-G	微型解剖剪；碳化钨刀片；直型；尖头；24毫米刀片长度；4 1/2英寸" 总长度
麦克弗森-范纳斯微型剪刀（Vannas）	Kent Scientific	INS600124	这些工具可用于在气管和血管上创建开口
聚乙烯管 10	Instech	BTPE-10	这用于制备导管的血管内部分。替代来源为BD Intramedic。
聚乙烯管 50	Instech	BTPE-50	用于制备导管的血管外部分。  另一种来源是 BD Intramedic
聚乙烯管 90	Instech	BTPE-90	用于制作气管造口管。  另一种来源是 BD Intramedic
USP级无菌生理盐水	Coviden	8881570121	Hospira 0.0% 氯化钠注射液，USP
<强>显微镜耗材
异氟烷输送系统与呼吸机	Kent Scientific	Somnosuite	组合式啮齿类动物呼吸机与挥发性麻醉给药系统
显微镜观察期间用于加热垫的泡沫隔层	N/A	N/A	该间隔垫应采用高质量泡沫材料切割而成，需贴合肝脏显微镜托盘的周围，其具体高度尺寸取决于显微镜系统
配备共振头扫描器的激光共聚焦显微镜系统	Olympus	FV3000	尽管我们描述的是使用配备共振扫描头的 Olympus FV3000，但本方案适用于大多数成像系统
肝脏显微镜载物盘	N/A	N/A	肝脏显微镜载物台是为倒置显微镜设计的
<强>抗体 &及关联试剂
Brilliant Violet 421/抗小鼠 Ly6G 抗体	BioLegend	127628	3 µg/小鼠。用于标记中性粒细胞
BV421/F4/80 抗体	BioLegend	123132	0.75 mg/kg，用于标记库普弗细胞
不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液	Gibco/ThermoFisher Scientific	14190144	用作透析液以去除抗体中的叠氮化钠
DyLight649/抗GPIbβ 抗体	emfret Analytics	X649	3 µg/小鼠。用于标记血小板
DyLight488/抗小鼠GPIbβ 抗体	emfret Analytics	X488	6 µg/小鼠。用于标记血小板
内毒素来自 大肠杆菌 血清型 O111:B4	Sigma-Aldrich	L3024	5 mg/kg；内毒素的活性可能因批次而异。因此，为尽量减少因内毒素批次不同引起的实验差异，同一系列实验应使用同一生产批次的内毒素
PerCP-eFluor 710/抗小鼠 P-选择素抗体	Invitrogen	46-0626-82	4 µg/小鼠。用于标记P-selectin
Slide-a-Lyzer 7,000 截留分子量透析盒	赛默飞世尔科技	66370	用于透析抗体以去除叠氮化钠
德克萨斯红标记的葡聚糖	Sigma-Aldrich	T1287	约 150 kDa；250 µg/小鼠
TRITC/牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A2289	500 µg/小鼠。用生理盐水稀释至50 mg/mL（5%）的储备浓度。用于标记血管系统。在炎症期间，其较之高分子量葡聚糖更易渗入间质空间。