方法文章

活体显微镜研究小鼠肝脏中血小板-白细胞-内皮细胞相互作用

930 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64239

⸱

2022年10月6日

 ,  , 
1Center for Translational Research on Inflammatory Diseases, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

活体显微成像是一种强大的工具，能够揭示快速和/或连续过程的时间与空间关系。本文中，我们描述了一种实验性脓毒症（内毒素血症）小鼠模型中，在肝脏窦状隙内评估蛋白质-蛋白质相互作用以及血小板-中性粒细胞-内皮细胞相互作用的实验方案。

摘要

炎症与血栓形成是主要发生在微循环中的复杂过程。尽管标准组织学可揭示炎症和血栓形成的终末通路，但无法呈现这些过程在时间进程中的动态变化。活体显微成像（IVM）是一种利用活体动物成像技术，以获取生理过程时间动态信息的方法。 体内该方法在评估循环系统中细胞与蛋白质相互作用时尤为有效，因为此类相互作用通常依赖于快速且连续发生的事件。尽管体内显微成像技术（IVM）是一种极为强大的成像方法，能够观察复杂的生物学过程 体内在规划体内显微成像（IVM）研究时，有许多方法学因素需要重点考虑。本文概述了进行肝脏活体成像的流程，指出了其中的重要注意事项及可能遇到的潜在问题。因此，本文描述了利用IVM研究肝窦中血小板-白细胞-内皮细胞相互作用的方法，以探讨在不同急性肝损伤模型中各细胞成分的相对作用。

引言

炎症与血栓形成是主要发生在微循环中的复杂过程。本方案概述了用于肝脏微血管成像的手术准备工作 体内尽管标准组织学可能有助于了解炎症和血栓形成的终末通路，但它无法显示整个过程中发生的时间动态变化。此外，该方法在评估微血管循环中短暂的细胞与蛋白质相互作用时尤为强大，因其具备捕捉这些动态事件的能力， 通过 活体显微镜技术常用于观察生物系统中频繁发生的快速且连续的相互作用。本文描述了利用活体显微技术研究肝窦内血小板-白细胞-内皮细胞相互作用的方法，以探讨在不同急性肝损伤模型中各细胞成分的相对作用。

尽管该手术准备和成像方法有可能被应用于多种炎症和病理模型，本文重点介绍两种血管炎症模型：小鼠内毒素血症脓毒症模型和对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤模型。早在20世纪30年代，随着内毒素（脂多糖；LPS）的分离及其在脓毒症进展中关键分子作用的探索，注射内毒素以诱导小鼠脓毒症实验模型的研究即已开始1。尽管该模型存在一定局限性，因为LPS仅是革兰氏阴性菌的单一组分，但该方法已被广泛接受并普遍使用，且操作相对简便快捷。此外，该模型能够快速而准确地复制脓毒症的生理表现1。鉴于肠道内毒素吸收在肝病及炎症发生中的重要作用2，该模型是研究小鼠肝脏中血小板-白细胞-内皮细胞相互作用的理想模型。

除了脓毒症的LPS模型外，对乙酰氨基酚（APAP）过量也为研究肝脏中病理性细胞间相互作用提供了极佳的模型。APAP过量可导致急性肝衰竭，其特征为血小板减少症以及血小板在肝脏中的积聚，继而阻碍白细胞介导的肝脏修复过程3尽管该模型的手术准备和成像方法可针对多种生物学问题及不同的病理过程进行调整，但脂多糖（LPS）诱导的脓毒症模型和对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤模型均为研究血小板-白细胞-内皮细胞相互作用的优良模型 体内.

活体显微技术（IVM）相较于标准组织学技术具有一些固有优势。尽管标准组织学方法可用于研究完整或切片的组织样本，并观察蛋白质分布与组织结构，但这些方法存在局限性。这些技术流程本身需要进行组织处理，有可能导致活体系统中真实情况的扭曲或遮蔽。在组织学制备过程中必须对组织进行固定，这可能引入固定假象或增强自发荧光。固定还可能导致组织内部发生细胞级变化，而固定不当则可能引起组织降解。此外，组织学方法无法直接研究蛋白质或细胞相互作用的时间动态特征，因而可能遗漏短暂或罕见的相互作用事件。

相反，荧光活体显微镜技术能够避免许多传统组织学方法固有的复杂性和局限性。活体显微镜（IVM）无需固定步骤，从而避免了组织学制备过程中可能出现的人为假象或组织降解。该技术的设计使其能够在活体生物系统内对组织进行成像，因此无需进行组织分离和切片。此外，该方法可用于成像和研究短暂或罕见的生物学过程，而这些过程使用组织学方法可能难以甚至无法捕捉。这种IVM方法还可用于捕获和识别连续发生的生物学事件（例如，血小板或白细胞启动的相互作用，最终形成结合于血管内皮的血小板-白细胞聚集体）。最后，该方法可适配多种成像系统。根据研究需求和目标数据类型，在完成手术准备后，外置的肝脏可置于几乎任何所需的成像系统上进行观察。我们已成功将该方案应用于宽场荧光显微镜、转盘显微镜、配备共振扫描头的激光共聚焦显微镜以及双光子显微镜的成像。然而，没有理由认为该方法应局限于上述显微技术。

本方法论文概述了一种离体显微成像（IVM）技术的实验方案，该方案此前已被用于研究小鼠肝脏中血小板-白细胞-内皮细胞之间的相互作用。该方案已被用于比较血小板与内皮细胞在时间维度上的黏附行为，其中血小板可通过荧光标记的抗体进行标记，或通过基因改造实现内源性荧光4。该方案还被用于在内毒素血症所致肝炎模型中评估肝窦内血小板-白细胞-内皮细胞之间的瞬时相互作用，并实现P-选择素与重组蛋白的共定位分析。此外，该方案使得研究人员能够确定在标准组织学方法中观察到的中性粒细胞密度差异是否源于红细胞流速（作为体积流量的替代指标）的不同5。最后，该方法还被用于在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤模型中评估库普弗细胞在肝窦内对血小板的募集作用6。若仅依赖标准组织学方法，上述研究将难以实现。如前所述，本方案可适配于多种成像系统，只要进行恰当的手术准备、荧光抗体选择和成像参数设置，该方法在肝脏病理学研究中具有高度的可靠性和可重复性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验方案均经贝勒医学院机构动物护理和使用委员会及研究部门批准 & Michael E. DeBakey 退伍军人事务医疗中心发展委员会。所有实验均为终末性实验，实验结束时在手术麻醉深度下实施安乐死。参见 材料表 有关本方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息。

1. 抗体和染料的制备

  1. 抗体与染料的选择
    注意：可同时观察到的荧光颜色数量取决于具体的显微镜配置。在本实验所用系统中，可同时可视化四种不同波长的信号。
    1. 血管的可视化：
      1. 根据实验设计，使用内皮特异性抗体（例如 CD31）和/或在血浆中均匀分布的分子（例如葡聚糖或白蛋白）对血管系统进行标记。
        注意：本文描述使用 Texas Red 标记的葡聚糖（150 kDa；每只小鼠 250 µg）。该高分子量物质的优势在于其在急性炎症期间能够保留在血管腔内。使用抗体标记时需谨慎，避免选用可能干扰内皮功能的抗体。
    2. 血小板的可视化：
      1. 为识别血小板，可使用基因修饰小鼠（例如 R26R-EYFPf/f/PF4-Cre）或血小板特异性抗体（例如抗 GPIbβ 抗体）进行活体显微成像（IVM）。有关血小板荧光标记使用的详细信息，请参考先前发表的研究4。
        注意：本实验中使用 DyLight488 标记的抗 GPIbβ 抗体（X488；每只小鼠 6 µg）。使用抗体标记时需注意避免干扰血小板功能或黏附能力。
    3. 白细胞的可视化：
      1. 与血小板成像类似，可通过基因修饰小鼠（例如 LysM-EGFP 标记粒细胞）或白细胞特异性抗体（例如 Ly6G 抗体标记小鼠中性粒细胞）来可视化目标白细胞。按照本方案操作时，使用 Brilliant Violet 421（BV421）标记的抗 Ly6G 抗体（每只小鼠 3 µg）。在急性期（<6 小时）实验中，每只动物使用 3 µg 抗 Ly6G 抗体（克隆号 1A8）标记中性粒细胞。
        注意：使用抗 Ly6G 抗体（克隆号 1A8）时需注意，该抗体在至少 24 小时后和/或多次注射条件下已被用于耗竭中性粒细胞（0.05–1 mg 抗体/小鼠）7-9。此外，在某些但非所有情况下，抗 Ly6G（1A8）抗体在高剪切应力（而非低剪切应力）下可能影响中性粒细胞的黏附和跨内皮迁移能力9,10。因此，应根据具体情况谨慎选择抗体剂量。
    4. 其他蛋白的可视化：
      1. 根据成像系统可用的激光器及滤光片组/探测器数量，可增加更多波长以实现更多目标的同时识别，但需注意避免光谱重叠。
        注意：本方案描述使用 PerCP-eFluor 710 标记的抗 P-选择素抗体（每只小鼠 4 µg）对第四个目标 P-选择素（克隆号 Psel.KO2.3）进行成像。尽管本文大部分描述和图像均针对 LPS 诱导的急性肝损伤模型，但其他损伤模型也可能具有研究价值，并可能需要不同的标记策略。有关用于 APAP 诱导损伤模型的抗体描述，请参见讨论部分6。
  2. 去除防腐剂与灭菌
    注意：尽管市面上有可直接注射动物体内的商用抗体和染料，但其中大多数含有载体或防腐剂（例如叠氮化钠），可能对动物有害或引入混杂变量。含有载体或防腐剂的抗体和染料应通过透析去除杂质，透析缓冲液为不含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS-/-；或其他生理缓冲液）。
    1. 将 500 mL DPBS-/-（约为待透析抗体/染料体积的 1,000 倍）倒入带有磁力搅拌子的烧杯中。将一个 7,000 分子量截留值（MWCO）的透析夹置于浮筒上，并浸入透析缓冲液中至少 5 分钟以预处理膜。取出夹子后，用无绒纸巾擦干塑料边缘，避免接触透析膜。
    2. 使用 18–20 号针头通过四个端口之一将抗体/染料注入夹子内。将装有抗体/染料的夹子放入透析缓冲液中，将烧杯置于磁力搅拌器上，在 4 °C 下透析至少 1 小时。更换透析缓冲液。
    3. 重复步骤 1.2.2 的透析及缓冲液更换操作，至少再进行两次（共至少三次更换）。
    4. 取出夹子，用无绒纸巾擦干塑料边缘，避免接触透析膜。使用 18–20 号针头通过未使用的端口从夹子中吸取抗体/染料。
    5. 在组织培养超净台中，使用 0.2 µm 滤器对样品进行灭菌处理，然后用于动物实验。未使用部分应储存于无菌管中，置于 4 °C 保存。
  3. 对照设置
    1. 尽管每项实验所需的具体对照会因研究设计而异，但在分析实验结果时，必须包含适当的假手术对照组、溶剂处理组与非溶剂处理组，以及同型对照，以排除非特异性标记和生物学效应的影响。

2. 腹腔内内毒素注射

注意：为了在小鼠脓毒症实验模型中评估肝脏窦状隙中的血小板-中性粒细胞-内皮细胞相互作用，可采用内毒素注射方法。

  1. 称重小鼠以确定需注射的内毒素剂量（5 mg/kg；Escherichia coli 血清型 O111:B4；内毒素含量 1 × 106 EU/mg）。
    注意：内毒素的效价和效应具有物种和品系依赖性，且可能因批次不同而有所差异11。因此，为最大程度保证实验结果的一致性，应使用同一批次的内毒素进行实验12。
  2. 将用生理盐水（0.9% 氯化钠）稀释的内毒素抽入带有 27 G 针头的注射器中。用非优势手的拇指和食指抓住小鼠颈背部皮肤固定小鼠，另一只手牵拉尾巴以暴露腹部，并将尾巴夹在非优势手的小指与手掌之间。
  3. 用 70% 乙醇清洁腹部。将针头插入左下（或右下）腹部，注射内毒素。
    注意：应避免将针头插入过深，以防损伤器官而干扰实验结果（例如肠道、肠管、肾脏等损伤）。
  4. 在对照动物中执行步骤 2.1–2.3，使用生理盐水（或溶剂）代替内毒素。
    注意：对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤可采用类似上述方法，仅以 APAP 替代内毒素6。有关 APAP 诱导肝损伤模型的详细信息，请参见讨论部分。

3. 动物麻醉的诱导与维持以及安乐死

  1. 将动物置于外科麻醉水平，使用吸入式异氟烷维持麻醉。 通过 鼻锥或气管造口管。通过脚趾夹捏后观察动物是否移动来评估并调整麻醉深度。
  2. 所有实验结束时，在手术麻醉深度下通过放血处死动物，随后实施双侧气胸。

4. 颈静脉和气管插管

  1. 进行气管切开术以促进呼吸，并便于放置血管导管用于注射标记抗体/染料。
    注意：手术解剖显微镜或放大镜有助于导管插入。
  2. 剃除颈部和腹部的毛发，并清除多余毛发。将动物置于加热垫上，以维持体温在37 °C，并使用直肠探头监测核心体温。先用聚维酮碘擦拭颈部，再用70%乙醇消毒。
  3. 在颈部做一正中垂直切口，通过钝性分离暴露气管。
    1. 气管切开术
      1. 准备一根PE90气管切开导管，并插入21 G钝针（图1A).
        注意：在气管切开管末端增加一个约45°的斜面可能有助于将其插入气管。 alternatively，可使用18-20 G的外周静脉留置针替代PE90管。
      2. 切开皮肤和筋膜后，将唾液腺向两侧牵开。
      3. 使用钝性分离法分离胸骨舌骨肌，以更好地暴露气管。
        注意：操作时需小心避免损伤气管邻近的供血血管和颈动脉。
      4. 在气管腹侧/前侧的气管环之间做一个小的（约1-2 mm）横向切口（图1B).
        注意：使用Vannas剪刀将有助于进行正确的解剖。确保 仅 切开气管的前壁；完全横断气管将增加气管插管的难度，并可能损伤邻近的血管结构。
      5. 将气管造口导管插入孔中，确保导管尖端不超过气管隆突。
      6. 使用气管软骨环作为支撑，用4-0丝线在气管及气管套管周围打结，将气管套管固定于气管内图1C).
    2. 颈外静脉插管
      1. 准备颈静脉导管（图2) 使用PE50管（外径0.97 mm，内径0.58 mm），其中一端插入PE10管（外径0.61 mm，内径0.28 mm）图2 插图）并将22 G或23 G钝针插入另一端。使用粘合剂确保管路不会滑脱或漏液。连接一支装有无菌生理盐水的注射器，用于冲洗导管。
      2. 在牵开唾液腺后暴露颈外静脉（EJV）。采用钝性分离，将EJV从周围结缔组织中游离出来。图3A).
      3. 使用4-0丝线缝合结扎所见颈外静脉的头端，并在颈外静脉的尾端放置一个松散的结环（图3B）。用止血钳夹住每根缝线的末端，并轻轻牵拉两把止血钳使其相互远离，以帮助暴露颈外静脉。
        注意：最佳插管部位位于头侧的颈前静脉分支与尾侧的颈内静脉分支之间。为便于缝合线放置，取一段缝合线（约15 cm），对折后用一把镊子夹住弯曲端，从耳下静脉（EJV）下方穿过，同时用另一把镊子提起EJV，防止血管滚动。随后，将缝合线剪断，形成两条独立的线段。
      4. 使用Vannas剪刀在EJV前表面做一个小切口（约1 mm）。插入一个弯曲的30 G钝头针（针尖处插入经钝化处理的0.15 mm minutien针以增强钝头效果） 通过切口将导管插入EJV，并轻轻提起，以促进含有生理盐水的导管顺利进入EJV。
        注意：在将导管和接头插入小鼠并进行冲洗前，务必确保其中无任何气泡。空气栓塞可能对动物造成致命伤害。
      5. 当导管进入颈外静脉后，稍微松开尾侧的环，以允许导管进一步深入静脉。通过抽吸血液并冲洗导管以检查有无渗漏，确认导管位置图3C).
      6. 使用尾侧环线将导管固定于外颈静脉内。使用头侧缝线将导管固定于外颈静脉头端，以尽量减少意外脱管的发生。图 3D).
      7. 用4-0丝线缝合颈部皮肤切口。

5. 肝脏的游离

  1. 用聚维酮碘溶液擦拭腹部，随后使用70%乙醇进行消毒。
  2. 在上腹部皮肤处作一条长约1 cm的垂直切口，切口起点位于胸骨基底部。采用钝性分离法将皮肤与腹肌分开。电凝皮肤和肌肉的主要供血血管，以尽量减少后续操作中的出血（图4A）。
  3. 在皮肤及腹肌上作一条长约1–2 cm的横向切口，该切口与第5.2步中的纵向切口在可见肝脏顶部附近相交并将其平分；使用电凝工具辅助皮肤止血（图4B）。
    注意：腹部切口的大小对于肝脏成像效果至关重要。若切口过小，可能导致肝脏缺血，原因是肝动脉和/或门静脉受到过度牵拉或压迫；若切口过大，则可能使其他器官（如肠道）脱出，干扰成像过程。
  4. 取一块2英寸×2英寸的纱布，在其中心剪出一个直径约1 cm的圆孔，并用温生理盐水浸湿。将纱布放置于切口处，使圆孔中心对准切口位置。轻轻牵拉切口边缘，并对腹部施加轻微向上的压力，使肝脏自然外翻并平稳置于湿润纱布之上（图4C）。
  5. 将小鼠以俯卧位放置于成像托盘上，确保肝脏中心对准盖玻片（图4D）。
    注意：在对照动物中，肝脏应呈深褐色。本实验方案采用倒置式激光扫描共聚焦显微镜配合双向共振扫描头进行活体显微成像（IVM）。因此，使用3D打印机定制了专用的IVM托盘（图5）。3D打印所用的.stl文件已提供（补充文件1）；可根据实际需求进行适当调整。
  6. 将动物转移至倒置显微镜下进行成像。

6. 肝脏活体显微成像

注意：本方案使用配备双向共振头扫描器的激光共聚焦显微镜进行活体显微成像。为稳定共振头频率，成像前需至少提前30分钟开启系统。不同系统可能具有不同的性能。有关这些差异的讨论不在本文范围之内。具体设备的技术细节请咨询仪器供应商。

  1. 为维持手术麻醉平面，将动物连接至异氟烷输送系统。
    注意：根据实验方案，可能需要进行机械通气（相对于自主呼吸）。
  2. 在动物体表放置辐射加热垫，并利用直肠探针维持核心体温在 37 °C。
    注意：在本方案中，一块可环绕IVM载物盘的矩形泡沫材料用作隔热层和支撑垫，用于放置辐射加热垫（图4D）。
  3. 将物镜转盘设置为所需放大倍数，必要时添加浸油。按照本方案，使用60倍/数值孔径1.30的硅油物镜，并设置1倍光学变焦。
  4. 确定焦平面后，随机选取≥10个视野，避免靠近肝脏边缘的区域。
    注意：由于肝脏在异硫氰酸荧光素（FITC）通道中具有自发荧光，可使用落射荧光快速确定大致焦平面。
    1. 根据系统情况，使用FITC通道的落射荧光识别可见肝脏的边界，并记录（x,y）载物台坐标。
    2. 利用肝脏的（x,y）边界范围和随机数生成器确定随机（x,y）坐标。合格视野应满足以下条件：(a) 视野中存在分布均匀的血管；(b) ≥80% 的血管位于同一焦平面；(c) 距离任何肝脏边缘至少相隔一个视野（见 图6 示例）。若图像分析的重点是肝窦内血小板-白细胞-内皮细胞相互作用，则应排除含有直径≥15 µm血管的视野（小鼠窦状隙直径通常≤10 µm）。

7. 图像分析

注意：本文中所有图像均使用 ImageJ/FIJI 进行处理。FIJI（fiji.sc）是 ImageJ（imagej.nih.gov）的一个开源版本，通过使用额外的插件和宏，提供了更强大的功能13。

  1. 在 ImageJ/FIJI 中打开多通道、时间推移的文件。
    注意：根据平台不同，可能需要额外的程序或插件。ImageJ/FIJI 具有 Bio-Formats 导入器，可打开多种不同类型的文件，例如 Olympus 的 .oir 文件。此处，文件已转换为 .tif 格式，因为该格式使用更为广泛。
  2. 确保已设置正确的比例尺；检查元数据/属性中的像素/µm 比例和时间间隔。
  3. 使用不同的滤波器去除背景噪声（例如，本方案中使用半径为 2 像素的中值滤波器）。确保所有图像的处理方式相似，以尽量减少后期处理中的差异。由于本实验中比较的是计数和长度，而非平均荧光强度，因此应进行滤波以提高清晰度，并有助于识别和测量细胞-细胞相互作用。
    注意：滤波器的使用及其强度取决于目标物的大小以及图像中的信噪比。
  4. 由于不同视野间的血管密度存在异质性，需使用选择画笔工具测量每个视野中的总血管面积（图 7）。
    1. 右键单击椭圆选区工具，并选择选择画笔工具。
    2. 双击选择画笔工具图标以调整画笔大小。
    3. 沿血管轨迹描画以高亮/选中血管。若需删除选区的某部分，请使用[alt]-左键单击；若需添加选区部分，请使用[shift]-左键单击。
    4. 按[M]键测量所选区域。
      注意：若图像比例尺已正确设置，则输出单位应为 µm2，之后可转换为 mm2。
  5. 统计视野中血小板和白细胞的数量。若细胞在 30 秒内的移动距离小于<1 个细胞体直径，则视为已黏附的细胞。计算每 mm2 面积内的细胞数量（血小板和/或白细胞）。
  6. 为估算每条血管内的相对血流速度，可使用 ImageJ/FIJI 中的 MTrackJ 插件（imagescience.org/meijering/software/mtrackj）14，以前述方法5测量平均红细胞（RBC）速度作为替代指标。在葡聚糖通道中，将红细胞识别为圆形或盘状的填充缺损。保存轨迹以用于记录、异步分析和验证。
    注意：图 8 和 补充视频 S1 展示了该方法的示例。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

评估波形蛋白杆状结构域对白细胞黏附于炎症内皮细胞的影响
在脓毒症诱导的肝损伤炎症急性期，白细胞P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）会与内皮细胞和血小板上的P-选择素结合。然而，研究表明，重组人源波形蛋白杆状结构域（rhRod）可结合P-选择素，并阻断白细胞与内皮细胞及血小板的黏附。本实验方案在脓毒症小鼠模型中用于实时观察rhRod对肝脏中依赖PSGL-1的白细胞黏附的影响。研究发现，rhRod在肝窦内与P-选择素共定位，确实能够减少肝脏中的白细胞黏附5。

对乙酰氨基酚诱导的肝损伤中肝脏血小板的募集
血小板在肝脏中的积聚会加剧对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤。本实验方案用于评估几丁质酶3样蛋白1（Chi3l1）在肝窦内血小板募集过程中的作用。通过应用该方案，可在APAP诱导肝损伤的急性期可视化血小板的募集情况。研究发现，给予APAP后会导致肝脏中Chi3l1表达升高以及血小板积聚增加，而在Chi3l1-/-...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方法学论文旨在概述在稳态条件下以及给予内毒素或对乙酰氨基酚（APAP）后，稳定获取小鼠肝脏高分辨率活体成像图像和视频所需的必要步骤。尽管该实验方案已成功实现对肝脏中血小板-白细胞-内皮细胞相互作用数据的持续获取，但在采用此成像范式时，仍存在若干关键操作步骤需严格遵循，并需避免潜在的技术陷阱。成功实施本方案的关键包括：在抗体选择阶段进行充分而周密的规划，以避免干扰细胞/蛋白功能；采用规范的手术技术，以防止组织损伤并维持稳态下的血流动力学；在肝脏外置过程中谨慎操作，避免肝脏缺血或额外器官的外置；以及设置恰当的成像参数，以防止光毒性或染料引起的组织损伤。

通过练习，本方案可实现对肝脏微血管的高质量、可重复成像 体内 与现有的其他研究方法相比，本方法具有显著优势。尽管本文概述了两种肝脏病理学模型，即内毒素和对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤，但该实验方案的基础原理有望应用于多种其他损伤模型。此外，尽管文中已列出用于研究血小板-白细胞-内皮细胞相互作用的抗体和分析技术，但通过合理的规划和抗体选择，本方案亦可调整用于研究其他感兴趣的细胞或蛋白质。例如，在APAP诱导的损伤...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突需要披露。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。本内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院/普通医学科学研究所（NIH/NIGMS）GM-123261（FWL）和美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）HL139425（JC）资助。研究支持还由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）HL116524提供资金。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>手术用品
2" × 2" 无纺布海绵McKesson 医疗外科92242000用于肝脏分离
#4-0 带针编织丝线缝合线SOFSILKN/A4-0 软丝涂层编织黑色不可吸收缝线：C-1 切割针
#4-0 丝线编织缝合线（无针）EthiconN/A4-0黑色编织丝线，不可吸收
21 G 钝针（0.5 英寸）SAI Infusion TechnologiesB21-50用于连接气管造口管末端，以便与呼吸机相连。替代来源为 Instech。
23 G钝针（0.5英寸）SAI Infusion TechnologiesB23-50这用于血管导管，以便与注射器连接。替代来源为 Instech
解剖剪（尖头）Kent ScientificINS600393-G微型解剖剪；碳化钨刀片；直型；尖头；24毫米刀片长度；4 1/2英寸" 总长度
麦克弗森-范纳斯微型剪刀（Vannas）Kent ScientificINS600124这些工具可用于在气管和血管上创建开口
聚乙烯管 10InstechBTPE-10这用于制备导管的血管内部分。替代来源为BD Intramedic。
聚乙烯管 50InstechBTPE-50用于制备导管的血管外部分。  另一种来源是 BD Intramedic
聚乙烯管 90InstechBTPE-90用于制作气管造口管。  另一种来源是 BD Intramedic
USP级无菌生理盐水Coviden8881570121Hospira 0.0% 氯化钠注射液，USP
<强>显微镜耗材
异氟烷输送系统与呼吸机Kent ScientificSomnosuite组合式啮齿类动物呼吸机与挥发性麻醉给药系统
显微镜观察期间用于加热垫的泡沫隔层N/AN/A该间隔垫应采用高质量泡沫材料切割而成，需贴合肝脏显微镜托盘的周围，其具体高度尺寸取决于显微镜系统
配备共振头扫描器的激光共聚焦显微镜系统OlympusFV3000尽管我们描述的是使用配备共振扫描头的 Olympus FV3000，但本方案适用于大多数成像系统
肝脏显微镜载物盘N/AN/A肝脏显微镜载物台是为倒置显微镜设计的
<强>抗体 &及关联试剂
Brilliant Violet 421/抗小鼠 Ly6G 抗体BioLegend1276283 µg/小鼠。用于标记中性粒细胞
BV421/F4/80 抗体BioLegend1231320.75 mg/kg，用于标记库普弗细胞
不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液Gibco/ThermoFisher Scientific14190144用作透析液以去除抗体中的叠氮化钠
DyLight649/抗GPIbβ 抗体emfret AnalyticsX6493 µg/小鼠。用于标记血小板
DyLight488/抗小鼠GPIbβ 抗体emfret AnalyticsX4886 µg/小鼠。用于标记血小板
内毒素来自 大肠杆菌 血清型 O111:B4Sigma-AldrichL30245 mg/kg；内毒素的活性可能因批次而异。因此，为尽量减少因内毒素批次不同引起的实验差异，同一系列实验应使用同一生产批次的内毒素
PerCP-eFluor 710/抗小鼠 P-选择素抗体Invitrogen46-0626-824 µg/小鼠。用于标记P-selectin
Slide-a-Lyzer 7,000 截留分子量透析盒赛默飞世尔科技66370用于透析抗体以去除叠氮化钠
德克萨斯红标记的葡聚糖Sigma-AldrichT1287约 150 kDa；250 µg/小鼠
TRITC/牛血清白蛋白Sigma-AldrichA2289500 µg/小鼠。用生理盐水稀释至50 mg/mL（5%）的储备浓度。用于标记血管系统。在炎症期间，其较之高分子量葡聚糖更易渗入间质空间。

参考文献

  1. Deitch, E. A. Rodent models of intra-abdominal infection. Shock. 24, Suppl 1 19-23 (2005).
  2. Nolan, J. P. The role of intestinal endotoxin in liver injury: A long and evolving history. Hepatology. 52 (5), 1829-1835 (2010).
  3. Miyakawa, K., et al. Platelets and protease-activated receptor-4 contribute to acetaminophen-induced liver injury in mice. Blood. 126 (15), 1835-1843 (2015).
  4. Da, Q., Derry, P. J., Lam, F. W., Rumbaut, R. E. Fluorescent labeling of endogenous platelets for intravital microscopy: Effects on platelet function. Microcirculation. 25 (6), 12457(2018).
  5. Lam, F. W., et al. The vimentin rod domain blocks P-selectin-P-selectin glycoprotein ligand 1 interactions to attenuate leukocyte adhesion to inflamed endothelium. PLoS One. 15 (10), 0240164(2020).
  6. Shan, Z., et al. Chitinase 3-like-1 contributes to acetaminophen-induced liver injury by promoting hepatic platelet recruitment. eLife. 10, 68571(2021).
  7. Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (1), 64-70 (2008).
  8. Pollenus, E., et al. Limitations of neutrophil depletion by anti-Ly6G antibodies in two heterogenic immunological models. Immunology Letters. 212, 30-36 (2019).
  9. Wang, J. X., et al. Ly6G ligation blocks recruitment of neutrophils via a β2-integrin-dependent mechanism. Blood. 120 (7), 1489-1498 (2012).
  10. Cunin, P., et al. Differential attenuation of β2 integrin-dependent and -independent neutrophil migration by Ly6G ligation. Blood Advances. 3 (3), 256-267 (2019).
  11. Weary, M. E., Donohue, G., Pearson, F. C., Story, K. Relative potencies of four reference endotoxin standards as measured by the Limulus amoebocyte lysate and USP rabbit pyrogen tests. Applied and Environmental Microbiology. 40 (6), 1148-1151 (1980).
  12. Kiers, D., et al. Comparison of different lots of endotoxin and evaluation of in vivo potency over time in the experimental human endotoxemia model. Innate Immunity. 25 (1), 34-45 (2019).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  15. Sierro, F., et al. A liver capsular network of monocyte-derived macrophages restricts hepatic dissemination of intraperitoneal bacteria by neutrophil recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
  16. Guidotti, L. G., et al. Immunosurveillance of the liver by intravascular effector CD8+ T cells. Cell. 161 (3), 486-500 (2015).
  17. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Frontiers in Immunology. 10, 2988(2020).
  18. Reif, R., et al. In vivo imaging of systemic transport and elimination of xenobiotics and endogenous molecules in mice. Archives of Toxicology. 91 (3), 1335-1352 (2017).
  19. Sloboda, D. D., Brooks, S. V. Treatment with selectin blocking antibodies after lengthening contractions of mouse muscle blunts neutrophil accumulation but does not reduce damage. Physiological Reports. 4 (1), 12667(2016).
  20. Lam, F. W., Da, Q., Guillory, B., Cruz, M. A. Recombinant human vimentin binds to P-selectin and blocks neutrophil capture and rolling on platelets and endothelium. Journal of Immunology. 200 (5), 1718-1726 (2018).
  21. Mossanen, J. C., Tacke, F. Acetaminophen-induced acute liver injury in mice. Laboratory Animals. 49, 30-36 (2015).
  22. Guerrero Munoz, F., Fearon, Z. Sex related differences in acetaminophen toxicity in the mouse. Journal of Toxicology. Clinical Toxicology. 22 (2), 149-156 (1984).
  23. Larsen, A. K., et al. Autofluorescence in freshly isolated adult human liver sinusoidal cells. European Journal of Histochemistry. 65 (4), 3337(2021).
  24. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
  25. Jost, A. P., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

视频即将推出

相关文章