同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

摘要

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中可诱导双链断裂位点处的D-环形成、D-环延伸以及产物生成。

摘要

DNA损伤，包括细胞周期S期和G2期发生的DNA双链断裂和链间交联，可通过同源重组（HR）进行修复。此外，HR也是复制叉停滞或崩塌后实现其救援的重要机制。这一复杂通路中众多可逆与不可逆步骤的调控有助于维持其保真性。通过对HR过程中形成的重组中间体进行物理分析，可揭示各种核蛋白因子及其相互作用分子对这些调控环节的作用特征。尽管已有成熟方法用于检测重组通路中的特定事件和中间产物，但长期以来，对该通路中两个关键步骤——D-loop形成及其延伸——的检测一直存在挑战，直至近期才取得突破。本文介绍了高效检测HR通路中若干关键事件的方法，即DNA双链断裂的产生、D-loop的形成、D-loop的延伸以及重组产物的生成 通过 断裂诱导复制（BIR）在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 描述了这些检测方法，它们能够以高灵敏度检测相应的重组中间体和产物，且不依赖于细胞的存活性。D-loop、D-loop延伸以及BIR产物的检测基于邻近连接技术。这些方法共同实现了在群体水平上对同源重组动力学的研究，从而可精确解析同源重组蛋白及其调控因子在通路关键步骤中的功能。

引言

同源重组（HR）是一种高保真性的DNA双链断裂（DSBs）、链间交联和单链DNA空隙修复机制，同时也是DNA损伤耐受的一种途径。与易错的DNA损伤修复/耐受途径（如非同源末端连接（NHEJ）和跨损伤合成）不同，HR利用完整且同源的双链DNA作为模板来指导修复过程。此外，HR通路中的许多关键中间产物具有可逆性，从而实现对各个通路步骤的精细调控。在细胞周期的S期、G2期和M期，HR与NHEJ竞争修复双端DSBs¹。此外，HR对于DNA复制过程至关重要，可用于修复与复制相关的DNA损伤，包括单链DNA空隙和单侧DSBs，并作为DNA损伤位点绕过的机制之一²。

同源重组（HR）途径中的一个关键中间体是置换环，即D-loop（图1）。在DNA末端切除后，该反应的核心重组酶Rad51会结合到断裂分子新生成的单链DNA（ssDNA）上，形成螺旋状丝状结构²。随后，Rad51执行同源性搜索，以识别合适的同源模板，通常为体细胞中的姐妹染色单体。当Rad51-ssDNA丝状体侵入一段同源双链DNA时，即形成D-loop，此时断裂链通过与供体链的互补链进行沃森-克里克碱基配对，导致供体双链中相对的另一条链被置换出来。随后，DNA聚合酶延伸断裂链的3'末端，填补DNA损伤过程中丢失的碱基，并通过合成....

方案

1. 生长前处理、DSB诱导及样品采集

注意：对于 Ade- 菌株，建议在所有培养基中添加 0.01% 腺嘌呤。

1. 在酵母蛋白胨葡萄糖腺嘌呤（YPDA）培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，2% 琼脂，0.001% 腺嘌呤）上划线接种适当的单倍体菌株（见表1），于30 °C培养2天。
2. 挑取单菌落接种至15 mL玻璃培养管中的5 mL YPDA液体培养基中，于30 °C振荡或旋转培养至菌液饱和，以保证充分通气。
3. DLC检测：在通风橱中，将补骨脂素溶解于50 mL锥形管中（锥形管用铝箔包裹），加入无水乙醇配制0.5 mg/mL三氧沙仑（trioxsalen）的5倍浓缩储存液，室温下持续振荡或颠倒过夜。用透明封口膜密封螺口盖以防止蒸发。每个50 mL锥形管中配制的5倍补骨脂素储存液不得超过7 mL，以确保补骨脂素充分溶解。
4. 次日，取5 mL过夜YPDA培养物接种至适当大小的三角瓶中的50–100 mL YEP-乳酸盐培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% w/w 乳酸钠，0.001% 腺嘌呤）中，初始OD₆₀₀约为0.03（出芽酵母最适生长条件为培养液体积不超过三角瓶容量的1/5）。
5. 于30 °C、220 rpm振荡培养约16小时。约16小时后测定菌液OD_600....

结果

DLC检测
DLC 检测由位点特异性 DSB 侵入单个供体所形成的新生和延伸的 D-loop图2）。补骨脂素交联可将断裂的链与供体在物理上连接起来 通过 D-loop 中的异源双链 DNA。在断裂处被切除的链上，通过一条长的互补寡核苷酸恢复限制性酶切位点，从而允许限制性内切酶切割，随后断裂链与邻近的供体序列连接，形成可被 qPCR 定量的嵌合产物。值得注意的是，DLC 信号依赖于补骨脂素交联、互补寡核苷酸、核心重组酶 Rad51 以及 Rad51 辅助因子 Rad52 和 Rad54。⁸. 删除DNA解旋酶/拓扑异构酶Sgs1-Top3-Rmi1、Mph1和Srs2会导致DLC信号增强。

图3展示了标准野生型菌株在DSB诱导后2小时的代表性结果，分别进行了三份平行实验，其中包含和不包含杂交寡核苷酸的处理。同时展示了缺少关键步骤——补骨脂素交联——的样本，该样.......

讨论

本研究中介绍的检测方法可用于检测新生和延伸的D环（DLC检测）、D环延伸（DLE检测）以及BIR产物的形成（无杂交寡核苷酸的DLE检测），这些方法基于邻近连接与定量PCR（qPCR）。此前，通过ChIP-qPCR检测远离DSB位点的Rad51结合已被用作Rad51介导的同源性搜索及D环形成的间接指标。然而，该ChIP-qPCR信号并不依赖于断裂位点与潜在供体之间的序列同源性，也不依赖于Rad51相关因子Rad54，因此更可能反映的是Rad51-ssDNA丝状体与dsDNA之间的瞬时结合，而非D环中间体^10,11。相比之下，DLC信号依赖于DSB的形成、Rad51、Rad52、Rad54以及被检测的DSB位点与供体位点之间的序列同源性⁸。此外，在缺失Mph1和Srs2解旋酶以及Sgs1-Top3-Rmi1解旋酶-拓扑异构酶复合物的情况下，DLC信号增强，这与先前报道一致，即这三个因子可在体外拆解由Rad51/Rad54形成的新生D环in vitro

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1. 预培养、DSB诱导及样品收集
设备
15 mL 和 50 mL 锥形管
15 mL 玻璃培养管
250 mL、500 mL 或 1 L 三角瓶
60 mm × 15 mm 平底光学透明培养皿			推荐：Corning，货号 430166；或 Genesee Scientific，货号 32-150G
配备 15 mL 和 50 mL 锥形管适配器的台式离心机
台式轨道摇床或管旋转仪/转盘
旋转仪
配备 365 nm 紫外灯管并置于轨道摇床上的紫外交联仪或紫外灯箱			推荐：Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker（Spectronics Corporation）或 Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK，货号 611110831
材料
60% w/w 乳酸钠（DL-型）糖浆	Sigma-Aldrich	L1375	用于培养基制备
琼脂	Fisher	BP1423500	用于培养基制备
蛋白胨（Bacto peptone）	BD Difco	211840	用于培养基制备
酵母提取物（Bacto yeast extract）	BD Difco	212750	用于培养基制备
D-(+)-葡萄糖	BD Difco	0155-17-4	用于培养基制备
补骨脂素（Trioxsalen）	Sigma-Aldrich	T6137	用于补骨脂素交联
2. 原生质球制备、裂解及限制性酶切位点恢复
耗材
1.5 mL 微量离心管
干浴器
液氮或干冰/乙醇
制冷微量离心机或普通微量离心机
材料
10X 限制性内切酶（CutSmart）缓冲液（500 mM 醋酸钾，200 mM Tris-醋酸盐，100 mM 醋酸镁，1 mg/mL BSA，pH 7.8–8.0）
Zymolyase 100T	US Biological	Z1004	用于原生质球制备
3. 限制性内切酶消化与分子内连接
耗材
水浴锅
材料
EcoRI-HF	New England Biolabs	R3101	DLC 检测中的限制性内切酶消化
HindIII-HF	New England Biolabs	R3104	DLE 检测中的限制性内切酶消化
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202	分子内连接
4. DNA 纯化
耗材
1.5 mL 和 2 mL 微量离心管
材料
苯酚/氯仿/异戊醇（P/C/IA），比例 25:24:1	Sigma-Aldrich	P2069	DNA 纯化
5. 补骨脂素交联逆转
耗材
PCR 仪/热循环仪
6. qPCR
耗材
Lightcycler 480	Roche	5015278001	作者使用的 qPCR 仪
Lightcycler 96	Roche	5815916001	作者使用的 qPCR 仪
材料
LightCycler 480 96 孔白色板	Roche	4729692001	qPCR 用 96 孔板
SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix	BioRad	1725271	作者使用的 qPCR 试剂盒
SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001	作者使用的 qPCR 试剂盒