通过组织的X射线激发发光化学成像实现植入物相关感染的高空间分辨率化学成像

摘要

本文介绍了一种利用X射线激发发光化学成像（XELCI）技术对植入性医疗器械周围化学信息进行高分辨率光学检测的实验方案。该新型成像技术由本实验室研发，可用于研究与植入物相关的感染生物化学过程。

摘要

与可植入医疗器械相关的微生物感染是导致骨折固定失败的主要问题。早期诊断此类感染可成功使用抗生素根除病原体，而无需承担二次手术的额外费用。本文中，我们描述了一种名为XELCI的技术，该技术具有高X射线分辨率、对植入物的特异性以及对化学物质浓度的高灵敏度，可用于无创成像靠近植入医疗器械表面的化学浓度变化。该技术通过在医疗器械表面涂覆具有化学报告功能的感应层实现。这种化学响应性表面由两层组成：底层为红色发光闪烁体层（Gd₂O₂S: Eu），上层为pH敏感层（含溴百里酚蓝或溴甲酚绿的水凝胶），用于监测。聚焦的X射线束照射植入物上的某一点，闪烁体产生的红光（峰值为620 nm和700 nm）穿过上层感应层，其光谱比会随pH值变化而改变。通过逐点扫描X射线束并测量穿过组织的光的光谱比，即可生成图像。此前，我们已利用该成像技术结合改良的可植入板式传感器，在股骨骨表面监测与植入物相关的感染。目前，我们正在研究胫骨髓内钉感染所引起的pH变化。在前期兔模型研究中采用了两种不同设计的髓内钉，结果表明XELCI技术不仅可用于监测骨表面的化学变化，还可用于监测骨内部的化学变化。因此，该技术实现了无创、高空间分辨率、低背景干扰的局部pH成像，为研究与植入物相关感染的生化过程提供了有力工具。

引言

在美国，每年约有200万例骨折固定装置被植入，其中5%至10%会导致与植入物相关的感染¹。由于生物膜具有异质性和耐药性，这些感染在后期阶段更难通过抗生素治疗^2,3。如果能早期诊断，可通过抗生素治疗和手术清创来控制感染，从而避免因在治疗部位更换硬件而产生的额外医疗费用和二次手术。常规X线摄影及其他先进的影像学技术常用于诊断骨科植入物相关感染、骨不连及相关并发症。尽管这些技术常用于获取骨科植入物周围骨组织和软组织的结构信息，但无法提供特定微环境中的生化信息。因此，我们开发了一种新型的X射线激发发光化学成像（XELCI）技术，可对植入部位的生化信息进行高分辨率、无创的成像。骨科植入物相关感染的诊断通常通过一种或多种方法联合进行。临床观察（如疼痛、肿胀、发红、伤口渗液等）提示感染的最初迹象。随后通过影像学和实验室检查，确认骨愈合进程受阻并鉴定致病微生物^4,5。核医学技术，如计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI），以及放射性核素方法，如单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET），已被用于更清晰地显示感染的植入物及其相关感染灶^6,

方案

本实验遵循克莱姆森大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物使用规程。实验按照克莱姆森大学生物安全委员会（IBC）和辐射安全委员会（RSC）的要求进行，并遵守相关指南和法规。

注意：完成 XELCI 扫描的流程图如下图 图5 所示，随后是成像步骤的详细分步说明。

1. 启动系统并获取平片X线影像

1. 打开PMT制冷器，通常需要约15分钟达到设定温度（例如4 °C）。在打开PMT之前，完成其余初始化步骤。
2. 启动成像系统控制软件。该控制软件将与电动x-y-z轴载物台通信并进行初始化。将载物台的x轴和y轴移动至所需的起始位置。
3. 将样品放置在可移动的x-y-z载物台上。通过升高或降低X射线源和/或载物台，调节样品高度（z轴），使放射发光装置位于聚毛细管聚焦光学元件下方5-5.5 cm处。同时，借助激光十字指示器（两个呈线状红色激光点的激光指示器，安装在X射线聚焦毛细管上，彼此成90°交叉，交叉点即为X射线聚焦位置）在x-y平面内对准样品位置。在开启X射线和PMT前，关闭激光器。
4. 锁紧成像舱前门上的按钮式安全联锁装置。开启X射线源电源。移除聚焦光学元件以获取样品的普通X射线平片。
5. 打开X射线控制软件，设置X射线功率（通过调节电压和....

结果

作为一项初步研究，我们在兔尸体胫骨扩髓后的髓内钉传感器上进行了成像¹⁴。该传感器具有三个不同的区域：参考区域、pH 8 区域（碱性 pH）和 pH 4 区域（酸性 pH）。参考区域为掺杂了闪烁体（Gd₂O₂S:Eu）颗粒的粗糙化环氧树脂膜。独特的酸性和碱性 pH 区域分别代表髓腔内感染和非感染状态（图 6A、B）¹⁴。

扫描完成后，在 MATLAB 中分别生成了 620 nm、700 nm 处的图像以及比值图像（图 7A-C）。颜色的变化反映了 pH 值的变化。由于溴百里酚蓝在碱性 pH 区域对发射光的吸收显著强于酸性 pH 区域，因此较低的 pH 区域在 620 nm 处呈现更亮的信号。700 nm 处的闪烁体发射作为光谱参.......

讨论

为了能够早期检测和研究与骨科植入物相关的感染，以避免骨髓炎及二次手术带来的并发症，我们引入了XELCI作为一种新型的功能性成像技术。该技术在通过组织进行pH监测方面，可与目前可用的技术相媲美。

在放置样品进行成像时，我们使用一个连接到聚毛细管聚焦光学系统的激光十字头，该系统带有两个以90°角相交的线状激光指示器，用于精确定位肘部正下方的位置。在开始扫描之前，应关闭这些激光，以避免除闪烁体产生的光之外的任何杂散光到达探测器。在距离方面，用户应在启动实验前测量聚焦光学系统尖端到样品顶部的距离，约为5–5.5 cm。此距离可通过手动升高X射线源或上下移动样品台来调节。对于活体动物或通过组织进行测量的情况，操作流程相同，但需将动物置于麻醉状态，并连接异氟烷气体管路以维持其持续睡眠。我们会定期监测其体温和脉搏，并添加额外的垫料和胶带以正确固定动物的解剖位置，尤其是角度；此时，我们将5–5.5 cm的焦距位置估算为植入物的深度，而非仅以皮肤表面顶部的距离为准。通常会先采集一张普通X射线图像或粗略扫描图像，以确认正确位置，之后再与在同一位置获取的化学XELCI图像进行叠加。对于未被组织覆盖的传感.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
90度弯头	由加利福尼亚州尔湾市帕克51号Hilltop技术实验室生产
溴甲酚绿	Sigma-Aldrich	45ZW10
溴百里酚蓝	Sigma	76-59-5
ElectraCOOL高级热电制冷板	美国佛蒙特州怀特河Pollock industries公司	TCP 50
乙醇	美国新罕布什尔州哈德逊市萨加莫尔公园路9号Beantown Chemical公司 邮编03051	64-17-5
掺铕氧化钆硫化物（Gd2O2S:Eu）颗粒-~8.0 µm	英国Stevenage市Phosphor Technologies公司	UKL63/N-R1
LabVIEW	美国德克萨斯州奥斯汀市National Instruments公司
电动线性垂直平台（Z轴用）	美国纽约州Smithtown市Motion Control公司	AT10-60
National Instruments c-DAQ 9171	美国德克萨斯州奥斯汀市National Instruments公司	NI cDAQ™-9171
一体式丙烯酸导光板	由加利福尼亚州尔湾市帕克51号Hilltop技术实验室生产
pH 4缓冲液	VWR BDH Chemicals公司	BDH5024
pH 8缓冲液	VWR BDH Chemicals公司	BDH5060
磷酸盐缓冲液	美国加利福尼亚州尔湾市MP Biomedicals公司	2810305
光电倍增管型号P25PC-16	英国萨里郡SensTech公司	型号P25PC-16
Staphylococcus aureus 亚种 aureus Rosenbach	美国弗吉尼亚州马纳萨斯市美国模式培养物集存库（ATCC）	ATCC 25923
胰蛋白胨大豆琼脂	美国加利福尼亚州霍利斯特市Teknova公司	T0520
胰蛋白胨大豆肉汤	美国马萨诸塞州伯灵顿市EMD Millipore公司	1005255000
X射线源-iMOXS	德国柏林科学仪器研究所（Institute for Scientific Instruments GmbH）
X、Y轴电动平台-行程30 cm × 15 cm × 6 cm	美国新泽西州纽顿市Thorlabs公司	LTS300和LTS150