使用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学

Summary

本研究提出了一种详细的程序，通过非天然氨基酸（UAA）掺入 使用 位点特异性标记对G蛋白偶联受体（GPCR）进行单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验。该协议为 smFRET 样品制备、实验和数据分析提供了分步指南。

Abstract

细胞对外部信号做出反应的能力对于细胞发育、生长和存活至关重要。为了响应来自环境的信号，细胞必须能够识别和处理它。这项任务主要依靠膜受体的功能，膜受体的作用是将信号转化为细胞的生化语言。G蛋白偶联受体（GPCR）是人类最大的膜受体蛋白家族。在GPCR中，代谢性谷氨酸受体（mGluR）是一个独特的亚类，其功能是专性二聚体，并具有包含配体结合位点的大细胞外结构域。mGluR结构研究的最新进展提高了对其活化过程的理解。然而，在激活和调制过程中通过mGluR传播大规模构象变化知之甚少。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种在单蛋白水平上可视化和量化生物分子结构动力学的强大技术。为了可视化mGluR2活化的动态过程，开发了基于非天然氨基酸（UAA）掺入的荧光构象传感器，该传感器允许位点特异性蛋白质标记而不会干扰受体的天然结构。此处描述的协议解释了如何执行这些实验，包括新型UAA标记方法，样品制备以及smFRET数据采集和分析。这些策略是可推广的，可以扩展到研究各种膜蛋白的构象动力学。

Introduction

跨质膜的信息传递在很大程度上取决于膜受体的功能¹。配体与受体结合导致构象变化和受体活化。这个过程在本质上通常是变构的².G蛋白偶联受体（GPCR）拥有800多个成员，是人类最大的膜受体家族³。由于其在几乎所有细胞过程中的作用，GPCR已成为治疗开发的重要靶标。在GPCR信号传导的典型模型中，激动剂激活导致受体的构象变化，随后通过在G_α的核苷酸结合口袋中将GDP交换为GTP来激活异源三聚体G蛋白复合物。活化的G_α-GTP和G_βγ亚基然后控制下游效应蛋白的活性并传播信号级联^4，5。这种信号传导过程基本上取决于配体改变受体三维形状的能力。对配体如何实现这一目标的机制理解对于开发新疗法和设计合成受体和传感器至关重要。

代谢性谷氨酸受体（mGluRs）是C类GPCR家族的成员，对于谷氨酸的缓慢神经调节作用和调节神经元^{兴奋性很重要}6^，7。在所有GPCR中，C类GPCR在结构上是独一无二的，因为它们作为专性二聚体起作用。mGluR包含三个结构域:金星捕蝇器（VFT）结构域，富含半胱氨酸的结构域（CRD）和跨膜结构域（TMD）⁸。活化过程中的构象变化是复杂的，涉及在12 nm距离上传播的局部和全局构象耦合，以及二聚体的协同性。中间构象、状态的时间顺序和状态之间的转换速率是未知的。通过实时跟踪单个受体的构象，可以识别瞬时中间状态和激活过程中构象变化的序列。这可以通过应用单分子荧光共振能量转移⁹，¹⁰（smFRET）来实现^，就像最近应用于可视化mGluR2¹¹活化过程中构象变化的传播一样。FRET实验的一个关键步骤是通过将供体和受体荧光团插入目标蛋白质的位点特异性插入来生成FRET传感器。采用非天然氨基酸（UAA）掺入策略12，^13，14，¹⁵，^以克服典型的位点特异性荧光标记技术的局限性^，该技术需要创建无半胱氨酸突变体或插入大型基因编码标签。这允许观察到基本的致密变构接头的构象重排，该接头连接了mGluR2的配体结合和信号结构域。在该协议中，提供了在mGluR2上进行smFRET实验的分步指南，包括使用UAA对mGluR2进行位点特异性标记以使用铜催化叠氮化物环化反应附着荧光团的方法。此外，该协议描述了直接捕获膜蛋白和数据分析的方法。此处概述的方案也适用于研究其他膜蛋白的构象动力学。

Protocol

该协议的整体工作流程如图 1 所示。

1. 样品室的准备

1. 玻片和盖玻片清洁
   注意:这些步骤旨在清洁载玻片的表面以及盖玻片，并为氨基硅烷化做好准备。对表面束缚分子进行单分子荧光实验的一个关键要求是钝化表面。最可靠和可重复的钝化技术涉及将惰性聚合物链作为致密层共价附着到玻璃表面。聚乙二醇（PEG）是用于表面钝化的最有效聚合物¹⁶。使用PEG（聚乙二醇化）的钝化程序的详细信息如下所述:
   1. 用记号笔标记要在载玻片上钻的孔（相距~6毫米，远离边缘）。使用Dremel在载玻片上钻小孔（直径1毫米）。在钻孔过程中将滑块浸入水中。
   2. 用丙酮清洗载玻片以去除记号笔上的残留墨水。
   3. 从丙酮中取出并用水冲洗载玻片，然后在水中以高功率（700 W）微波5分钟。
   4. 用水清洁载玻片，然后将其放入玻璃染色罐中进行超声处理。将盖玻片放入不同的染色罐中。
   5. 在23°C的浴超声仪中用丙酮超声处理载玻片和盖玻片30分钟。
   6. 同时，清洁玻璃烧瓶以制备下一步中使用的氨基硅烷化溶液。用1M KOH填充烧瓶，超声处理烧瓶30分钟，用水彻底冲洗出KOH，然后在甲醇中再超声处理30分钟。将烧瓶留在甲醇中，直到氨基硅烷化步骤的时间。
   7. 同时，从冰箱（-20°C）中取出氨基硅烷，mPEG和生物素-PEG，并让它们在黑暗中达到室温（RT）。
   8. 将载玻片和盖玻片罐中的丙酮丢弃在适当的化学废物容器中，用水彻底冲洗，然后在5M KOH中超声处理载玻片30分钟。
   9. 用水冲洗载玻片和盖玻片，然后在甲醇中超声处理2分钟（重复两次）。将罐子装满甲醇，直到氨基硅烷化步骤。
      注意:在本研究中，除非另有说明，否则使用去离子水。使用在23°C下工作的浴超声仪。
2. 氨基硅烷化
   注意:此步骤旨在将氨基硅烷共价连接到干净的载玻片和盖玻片表面。功能化的mPEG和生物素-PEG将在下一步中共价结合到该表面。
   1. 在干净的烧瓶中制备氨基硅烷化混合物（步骤1.6）。通过混合甲醇（150 mL）、乙酸（7.5 mL，使用玻璃移液管）和氨基硅烷（2.5 mL）制备溶液。
   2. 在化学通风橱中轻轻混合溶液，然后将其倒入载玻片和盖玻片罐中。盖玻片使用 50 mL，载玻片使用 100 mL。确保载玻片和盖玻片完全浸入溶液中。
   3. 孵育10分钟，然后将罐子超声处理1分钟（超声处理去除表面的杂质），再孵育10分钟。
   4. 将氨基硅烷化溶液丢弃在废物收集容器中。向罐子中加入甲醇，盖上盖子的罐子，用手轻轻摇晃。处理甲醇，并在罐子里装满水。
   5. 将氨基硅烷瓶放回冰箱（-20°C）。
3. 聚乙二醇化
   注意:这些步骤描述了聚乙二醇化过程。
   1. 在氨基硅烷化过程中，制备聚乙二醇化缓冲液。称取 84 毫克碳酸氢钠 （NaHCO₃），并将其加入 10 mL 水 （10 mM） 中。此外，称量mPEG和生物素-PEG并将它们放在一边。对于六张载玻片和盖玻片，使用96毫克mPEG和1.2-2.4毫克生物素-PEG。
      注意:重要的是不要添加太多的生物素-PEG，因为它会增加背景斑点的数量。在应用于载玻片之前不要溶解PEG混合物。
   2. 用水冲洗载玻片，用温和的空气吹干，然后将它们放入加湿的组装盒中。
      注意:使用清洁的航空公司至关重要。避免使用压缩罐装空气，这会在玻璃上留下残留物。
   3. 将聚乙二醇化缓冲液加入PEG粉末混合物中，轻轻上下移液多次以使其溶解。每张载玻片加入 55 μL 聚乙二醇化缓冲液（对于 6 张玻片，加入 330 μL 聚乙二醇化缓冲液）。
   4. 在23°C下以9，600× g 离心1分钟以沉淀未溶解的颗粒。收集上清液以在下一步中使用。
      注意:由于NHS组的存在，生物素-PEG水解迅速。快速完成混合和离心步骤非常重要。
   5. 将 60 μL 聚乙二醇化溶液涂在每张载玻片上，然后将盖玻片放在顶部，使聚乙二醇化溶液夹在载玻片和盖玻片之间。
      注意:避免在载玻片和盖玻片之间引入气泡，因为这会降低钝化效率。通过用移液管吸头调整盖玻片和载玻片来去除任何气泡。
   6. 将载玻片放在平坦而黑暗的抽屉中。载玻片可以存放过夜;然而，孵育4-6小时导致最佳钝化。
      注意:必须记住哪一面是聚乙二醇化的。
   7. 储存前标记非聚乙二醇化的一面。孵育后，轻轻拆卸并用水彻底冲洗载玻片和盖玻片
   8. 通过吹风擦干载玻片和盖玻片。将载玻片和盖玻片放在无菌管（50 mL）中，聚乙二醇化表面彼此背对。储存在-20°C直至实验当天。
      注意:最好在准备后 4 周内使用载玻片和盖玻片。聚乙二醇化表面应彼此背对。将聚乙二醇化玻片和盖玻片存放在真空密封袋中可以延长其保质期。

2. mGluR2表达，掺入非天然氨基酸，荧光标记和提取

注意:本协议概述了表达含有UAA 4-叠氮基-L-苯丙氨酸（AZP）的mGluR2的细胞的制备，试剂和处理。该程序适用于在18毫米玻璃盖玻片上生长的HEK293T细胞。该过程可以根据需要扩大规模。

1. 播种
   注意:将HEK293T细胞维持在补充有10%（v / v）胎牛血清，100单位·mL⁻¹ 青霉素链霉素和15mM HEPES缓冲液（补充文件1）（pH 7.4）的DMEM中，在37°C下，在5%CO₂下。
   1. 用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代细胞。将HEK293T细胞接种在聚-L/D-赖氨酸（PLL/PDL）玻璃盖玻片上，使其在转染期间达到≥80%汇合度。
2. 转染
   1. 在0.1M NaOH中制备40 mM的AZP储备溶液。
   2. 制备补充 AZP 的培养基用于生长细胞和 mGluR2 表达。使用40 mM AZP储备溶液补充标准培养基（+FBS，笔/链球菌，15 mM HEPES）。将最终AZP浓度降至0.6 mM。加入1 M HEPES溶液（添加40 mM AZP储备溶液体积的一半）。例如，要制备 10 mL AZP 补充培养基，请混合 9.775 mL 标准培养基、150 μL 40 mM AZP 储备溶液和 75 μL 1 M HEPES 溶液。
   3. 使用注射器过滤器（0.2μm，PES）过滤（灭菌）培养基。
   4. 转染前，将标准培养基更换为含有AZP补充培养基的培养基。
      注:更换介质时注意不要使细胞干燥。
   5. 按照制造商手册用转染试剂（材料表）转染细胞。使用总共 2 μg DNA（1000 ng tRNA/合成酶 + 1000 ng 含琥珀色密码子的蛋白质质粒）在 18 mm 盖玻片上转染 HEK293T 细胞。有关所用成分的浓度和体积，请参阅 表1 。
   6. 转染后24小时更换培养基至新鲜的AZP补充培养基，并让细胞再生长24小时。
3. 用炔烃菁染料标记
   1. 标记前20分钟，用温热（37°C）记录缓冲液（RB）（补充文件1）洗涤盖玻片两次，并将它们移动到没有AZP（+ FBS，笔/链球菌，15mM HEPES）的温热（37°C）标准培养基中。
   2. 制备含有Cy3-炔烃，Cy5-炔烃，BTTES，硫酸铜（II）（CuSO4），（+）L-抗坏血酸钠和氨基胍的标记溶液。
   3. 按照制作和添加溶液的顺序（表2）:
      1. 准备 50 mM BTTES。
      2. 准备100 mM氨基胍。
      3. 准备100mM抗坏血酸钠。
      4. 准备 655.5 μL RB。
      5. 将 Cy3/Cy5 炔烃染料（DMSO 储备液中的 10 mM）添加到 RB 中。
         注意:将氨基胍添加到RB中。
      6. 准备 20 mM 铜_4.
      7. 在新管中混合CuSO4和BTTES（溶液将变成蓝色）。
      8. 将CuSO4和BTTES混合物添加到RB（2.3.3.6）中。
      9. 加入钠抗坏血酸。
      10. 按照下面 表 2 中给出的体积进行 18 mm 盖玻片。
   4. 彻底混合溶液，在标记细胞之前在冰上和黑暗中孵育10分钟。
   5. 在将标签溶液添加到盖玻片之前，取出培养基并用RB洗涤。加入标记溶液，并在黑暗条件下在37°C孵育15分钟。
   6. 注意:为了改善标记，在10分钟后加入谷氨酸（终浓度~0.5mM）并再孵育5分钟。铜对细胞毒性很大，标记反应在 体内不应持续超过15分钟。新鲜准备所有组件。最后加入抗坏血酸钠。制备时将反应保持在 4°C。然而，在加入标记溶液后，细胞应储存在培养箱内的37°C。
4. 收获细胞并提取蛋白质（细胞裂解）
   1. 取出标记溶液，用RB洗涤含有mGluR2转染细胞的盖玻片（18mm）。
   2. 使用移液管将细胞从盖玻片上洗掉并重悬于RB（1 mL）中。
      注意:在此之后，尽可能减少样品暴露在光线下。
   3. 通过在4°C下以1，000× g 旋转5分钟来沉淀细胞并除去上清液。将细胞沉淀重悬于80-130μL裂解液中。
      注意:细胞沉淀应该是肉眼可见的。裂解体积取决于标记和洗涤过程中损失的样品量。
   4. 通过移液轻轻混合以分解沉淀。用箔纸包裹，并在4°C下放在摇杆上0.5-1小时以裂解细胞。
   5. 通过在20，000× g 和4°C下离心20分钟来沉淀不溶性级分。将上清液转移到新鲜的冷管（含有目标荧光标记蛋白质的裂解蛋白）中，并将其储存在冰上进行实验。

3. 单分子流动室组装与功能化

1. 从冰箱中取出载玻片和盖玻片，让它们在黑暗中在室温下加热（~30分钟）。
2. 使用双面胶带组装腔室，方法是在载玻片和盖玻片之间夹上双面胶带。确保聚乙二醇化表面形成流动室的内部。
3. 使用移液器吸头，按压盖玻片以确保胶带与盖玻片和载玻片完全接触;注意不要打破盖玻片。将环氧树脂涂在幻灯片的边缘。
   注意: 不要添加太多，以免环氧树脂填充钻孔。
4. 将盖玻片面朝下的流动室放在加湿的暗盒中，让环氧树脂干燥（~30分钟）。
   注意:通过钻孔添加T50缓冲液（补充文件1），以防止环氧树脂在干燥期间覆盖孔（10-15μL）。
5. 通过向每个泳道缓慢施用 ~40 μL，用 500 nM Neutravidin（在 T50 中稀释）孵育每个腔室泳道。
6. 在室温下在潮湿的暗盒内孵育2分钟。每泳道用 ~100 μL T50 缓冲液洗涤。
7. 用 20 nM 生物素化抗体¹¹ 孵育每个腔室泳道。抗体的选择取决于蛋白质上的标签。
   注意:如果一抗未生物素化，则首先与生物素化的二抗孵育30分钟，然后与一抗孵育。
8. 在室温下在潮湿的暗箱内孵育30分钟。每泳道用 ~200 μL T50 洗涤。
   注意:确保通道在制备过程中永远不会变干。

4. 单分子缓冲液

1. 特洛克斯缓冲液
   注意:Trolox 缓冲液是制作成像缓冲液的起始缓冲液。缓冲液的组分取决于实验，并且可能因感兴趣的蛋白质而异。此处描述的方案中使用的缓冲液包括盐（NaCl，KCl，CaCl₂，MgCl₂），缓冲剂（HEPES）和Trolox（pH ~7.35）。
   1. 将 9-10 mg Trolox 溶解在 10 mL 单分子记录缓冲液中（SRB， 补充文件 1）
      注意:Trolox 使缓冲液呈微酸性。在此阶段使用氢氧化钠（NaOH）溶液10M（pH 7.35）调节pH值。在卓乐完全溶解后进行精细的pH调节;然而，此时增加pH值会增加Trolox的溶解度。
   2. 使用台式摇杆在室温下混合溶液4-8小时（用铝箔包裹）以完全溶解Trolox。
   3. 检查pH值并根据需要进行调整。
   4. 确保 Trolox 完全溶解。用注射器过滤器对溶液进行灭菌并储存在4°C。
      注意:缓冲液应在老化2-10天后使用。Trolox有助于抑制眨眼，通常用于单分子研究¹⁷。防眨眼特性来自 Trolox¹⁸ 的氧化衍生物;因此，建议将其在室温下保持至少几个小时以使其成熟。此外，新鲜Trolox溶液的紫外线辐射加速了氧化过程，可用于加速Trolox缓冲液¹⁸的"老化"。
2. 成像缓冲液配方:混合 Trolox 缓冲液 + 洗涤剂（~2 倍洗涤剂的 CMC 值）+ 4 mM 原儿茶酸 （PCA）。
   注意:洗涤剂浓度保持在CMC附近，因为高洗涤剂浓度可能导致蛋白质变性增加。例如，以下混合物可以使用955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + 胆固醇 （W%， 10:1） + 40 μL 100 mM PCA 储备溶液。在这里，PCA作为一种抗氧化剂，以前用于smFRET研究¹⁹。DDM是非离子的，通常用于溶解膜蛋白²⁰，^21，并已用于单分子研究。DDM是良好的首选洗涤剂;但是，我们建议测试多种洗涤剂并确保结果一致。

5. 显微镜设置和smFRET数据采集

1. 打开电脑和显微镜。打开激光器进行预热（Cy3 激发为 532 nm，Cy5 激发为 640 nm）。
   注意:这里使用了配备100倍TIRF物镜（N.A. 1.49）、图像分配器和EMCCD相机的倒置显微镜。该装置配备了一个四线激光组合器、一个二向色镜、一个长通发射滤光片、一个发射二向色滤光片和一个陷波滤光片。
2. 打开 EMCCD 相机并打开相机软件。等待20分钟，使相机达到-69°C并稳定下来。
3. 将样品室安装在显微镜载物台上。逐渐加入蛋白质样品，以达到每个视场~400个分子（步骤2.4.5）。用 100 μL 成像缓冲液清洗腔室。
4. 调整增益、采集速率和激光功率，以便在供体和受体通道中检测到单分子荧光信号。如果需要，调整样品室内蛋白质的浓度。
   注意:视野中有超过 400 个分子，区分单个分子变得更加困难，背景噪声也会更高。
5. 激发供体并获得时间轨迹，直到视野中至少80%的供体分子被光漂白。
6. 在影片的最后，打开640nm激光直接激发受体，直到部分受体分子光漂白，有利于单分子从多聚体判别。
7. 移动到不同的视野并重复上述步骤，以每个条件收集至少三部电影（技术重复）。
   注意:在选择新的感兴趣区域（ROI）并进行聚焦以最大程度地减少光漂白时使用尽可能低的激光功率。注意采集过程中的载物台漂移。如果在移动到新的ROI后观察到明显的漂移，请等待3分钟，然后再开始采集。

6. 数据分析

1. 供体和受体通道对齐（电影映射）
   1. 在供体和受体通道中记录荧光珠图像。
   2. 使用磁珠数据生成映射文件，以关联来自每个分子^22，23的供体和受体荧光。
      注意:来自单个分子的发射信号由图像分配器内的发射二向色滤光片分成供体和受体信号。供体和受体图像并排投影在相机上。为了准确地将两个区域之间单个分子的供体和受体强度联系起来，通常使用荧光珠样品生成映射文件。使用此映射文件，在供体和受体通道中检测到的所有分子都相互映射。然后，分析生成时间轨迹，即每个分子随时间推移的供体和受体强度。
2. 单分子FRET迹线的选择（颗粒拾取）
   注意:使用 MATLAB 检查并选择单个粒子迹线进行下游分析。确切的选择标准取决于系统。这里概述了关于什么构成优质颗粒的一般准则。所有自定义修改的代码都可以在 GitHub （https://github.com/vafabakhsh-lab） 上找到。
   1. 选择迹线（供体+受体）的总强度随时间稳定的迹线。选择供体和受体强度具有反相关变化的迹线。
   2. 选择显示一步光漂白的供体和受体分子。选择长度为 >5 s 的迹线。
      注意:漂白后每个通道中的背景应为零。跟踪不应具有许多闪烁事件;这将增加分析的难度。
   3. 使用等式E = （I A− 0.088 × I D）/（I D + [I_A− 0.088 × I D]）²⁴，^25，26计算FRET效率^，其中I _D和I_A分别是原始供体和受体强度。
      注意:使用使用532 nm激光激发的仅供体标记样品²⁶来确定供体发射到受体通道中的泄漏。泄漏校正系数 0.088 可能因所使用的过滤器组而异。重要的是要注意，FRET效率到绝对距离的定量和稳健转换需要校正供体和受体强度的多种因素，并且在²⁷之前已经进行了广泛的讨论。
3. 通过隐马尔可夫建模（HMM）识别构象状态
   1. 在 MATLAB 中执行 vbFRET²⁸ 程序，并为给定条件导入选定的跟踪。设置要执行的潜在状态和迭代数的约束。
      注意:根据代表性结果的原始数据，假设构象传感器占据多达四个离散的FRET状态;因此，指定了一至四个国家的范围。以前确定拟合的改进在迭代 >25 次时可以忽略不计;因此，使用了25次迭代来拟合代表性数据。
   2. 分析 smFRET 迹线并导出理想化的迹线和分析会话。将理想化的迹线保存到单独的文件夹中，以便进行下游分析。
      注意:用于从理想化迹线中提取状态转换和停留时间数据的程序在先前发表的工作²⁹中可用。
   3. 使用 MATLAB 程序，提取状态转换并将其绘制为热图，其中 X 坐标表示开始构象，Y 坐标表示结束构象。
      注意:转换定义为此处讨论的代表性结果中FRET值>0.1的变化。跃迁阈值取决于感兴趣的蛋白质所占据的假设构象状态（将跃迁阈值设置为小于最接近的FRET状态之间的差异），以及实验设置允许的分辨率。检查多种条件的热图可以识别传感器转换并因此占据的最常见构象状态。代表性结果确定了四种FRET状态（FRET=0.31、0.51、0.71和0.89）。
   4. 使用 MATLAB 程序，提取每个已识别构象状态的停留时间。指定一系列FRET值，描述数据采集过程中的每个状态和时间分辨率。FRET范围被相邻的FRET状态平均划分。导出给定处理条件下的停留时间。
      注意:在大多数情况下，停留时间数据可以通过单个指数衰减函数很好地估计。该分析可以在数据分析和绘图软件中执行。
4. smFRET种群直方图的高斯拟合以量化状态占用率
   1. 将感兴趣条件的总体FRET直方图导入数据分析和绘图软件，以进行多个峰拟合分析。
   2. 指示存在的峰数（基于HMM分析的四个峰或状态）。拟合使用定义为 的多个高斯分布³⁰ 进行，其中 A 是峰面积，xc 是峰心，w 是每个峰的峰宽。
   3. 将拟合参数约束为 A > 0、 xc = FRET ± 0.02 和 0.1 ≤w≤ 0.24。单个群体FRET直方图的四个FRET峰同时拟合。对所有条件的管接头应用定义的约束。
   4. 将占用状态（百分比）计算为感兴趣的峰值面积除以总面积，定义为所有峰值的总和。

Results

基于UAA的FRET传感器的表达和荧光标记
本文讨论了在mGluR2（548UAA）的CRD内插入和荧光标记UAA（AZP）的示例性结果¹¹。如前所述，要将AZP插入mGluR2中，工程翻译机制的共表达是必要的，其中包括修饰的tRNA合成酶和互补tRNA（pIRE4-Azi），以及使用诱变创建的在位置548处含有琥珀色密码子的mGluR2（图2A，B）。通过铜催化的环加成反应（图2C）通过铜催化的环加成反应实现AZP的标记，并导致548UAA的有效质膜标记（图2D）。为了验证全长548UAA的翻译和二聚体受体的完整性，对表达用Cy5标记的548UAA的HEK293T细胞的细胞裂解物进行了SDS-PAGE电泳。观察到250KDa的单条带，这与全长二聚体mGluR2一致（图2E）。

Discussion

GPCR是在细胞膜上起作用以启动信号转导的蛋白质。许多GPCR由多个域组成，信令依赖于域之间的合作相互作用。为了调节这些膜受体的性质，必须了解多个结构域的动态行为。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种荧光技术，能够实时测量蛋白质构象和动力学^11，32。这里^{描述了一种}结合smFRET，单分子下拉（SiMPull）和全内反射荧光（TIRF）显微镜以直接可视化固定在钝化表面上的单个蛋白质的重排的方法5，^11，33。FRET对距离高度敏感，并有效地用作纳米级标尺，适用于探测分子内变化（3-8 nm）。与传统的生物物理方法相比，smFRET特别适合在~10 ms的时间尺度上研究大构象动力学，并且需要小样品体积（每个实验约1 fmol）。此外，与构象动力学的集成测量（例如核磁共振（NMR）³⁴...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
（+）-L-抗坏血酸钠	Sigma Aldrich	货号 # 11140-250G
4-叠氮基-L-苯丙氨酸	Chem-Impex International	货号 # 06162
548UAA	Liauw 等人，2021		转染构建
乙酸	Fisher 化学	64-19-7
丙酮	Fisher 化学	67-64-1
Adobe Illustrator （2022）		https://www.adobe.com/ RRID：SCR_010279	软件、算法
氨基胍（盐酸盐）	开曼化学	81530
氨基硅烷	Aldrich	919-30-2
浴超声仪 2.8 L	Fisher Scientific		超声波浴 2.8 L
生物素-PEG	Laysan Bio Inc	项目#生物素-PEG-SVA-5000-100mg
	BTTES 点击化学工具	1237-500
硫酸铜 （II） Sigma	Aldrich	货号 # 451657-10G
盖玻片	VWR	16004-306	样品室
Cy3 炔烃	点击化学工具	TA117-5
Cy5 炔烃	点击化学工具	TA116-5
DDM	Anatrace	部件# D310 1 GM	洗涤剂
DDM-CHS （10：1）	Anatrace	部件# D310-CH210 1 ML	洗涤剂与胆醇
定义的胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	SH30070.03
Di01-R405/488/561/635	Semrock		Notch 过滤器
DMEM	康宁	10-013-CV
EMCCD	Andor	DU-897U	相机
ET542lp	Chroma		长通发射滤光片
FF640-FDi01	Semrock		发射二向色滤光片
FLAG-tag 抗体	Genscript	A01429
荧光珠	Invitrogen T7279	TetraSpeck 微球	球形微球
载玻片	Fisherfinest	12-544-4	样品室
谷氨酸	Sigma Aldrich	货号 # 6106-04-3
HEK 293T	Sigma Aldrich	货号 # 12022001	细胞系
HEPES	FisherBioReagents	7365-45-9
图像分流器	OptoSplit II
KOH	Fluka	1310-58-3
激光	Oxxius		4 线激光合路器
Lipofectamine 3000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	L3000015	转染试剂
甲醇	Fisher Chemical	67-56-1
显微镜	奥林巴斯	OX83
Milli-Q 水	Barnstead		水去离子器
m-PEG	Laysan Bio Inc	项目# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635	Semrock		二向色镜
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	51985091	还原血清培养基
OptiMEM/还原血清培养基	Thermo Fisher Scientific
OriginPro （2020b）	https://www.originlab.com/	RRID：SCR_014212	数据分析和绘图软件
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
pIRE4-Azi	Addgene	质粒 #	105829 转染构建体
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma Aldrich	Cat # P2636
原儿茶酸 （PCA）	HWI 组	99-50-3
smCamera （Version 1.0）	http://ha.med.jhmi.edu/resources/		相机软件
碳酸氢钠	FisherBioReagents	144-55-8
氢氧化钠 （NaOH）	Sigma	1310-73-2
针式过滤器	Whatman UNIFLO	Cat#9914-2502	液体过滤
Trolox	Sigma	53188-07