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使用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究提出了一种详细的程序，通过非天然氨基酸（UAA）掺入 使用 位点特异性标记对G蛋白偶联受体（GPCR）进行单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验。该协议为 smFRET 样品制备、实验和数据分析提供了分步指南。

Abstract

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细胞对外部信号做出反应的能力对于细胞发育、生长和存活至关重要。为了响应来自环境的信号，细胞必须能够识别和处理它。这项任务主要依靠膜受体的功能，膜受体的作用是将信号转化为细胞的生化语言。G蛋白偶联受体（GPCR）是人类最大的膜受体蛋白家族。在GPCR中，代谢性谷氨酸受体（mGluR）是一个独特的亚类，其功能是专性二聚体，并具有包含配体结合位点的大细胞外结构域。mGluR结构研究的最新进展提高了对其活化过程的理解。然而，在激活和调制过程中通过mGluR传播大规模构象变化知之甚少。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种在单蛋白水平上可视化和量化生物分子结构动力学的强大技术。为了可视化mGluR2活化的动态过程，开发了基于非天然氨基酸（UAA）掺入的荧光构象传感器，该传感器允许位点特异性蛋白质标记而不会干扰受体的天然结构。此处描述的协议解释了如何执行这些实验，包括新型UAA标记方法，样品制备以及smFRET数据采集和分析。这些策略是可推广的，可以扩展到研究各种膜蛋白的构象动力学。

Introduction

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跨质膜的信息传递在很大程度上取决于膜受体的功能1。配体与受体结合导致构象变化和受体活化。这个过程在本质上通常是变构的2.G蛋白偶联受体（GPCR）拥有800多个成员，是人类最大的膜受体家族3。由于其在几乎所有细胞过程中的作用，GPCR已成为治疗开发的重要靶标。在GPCR信号传导的典型模型中，激动剂激活导致受体的构象变化，随后通过在Gα的核苷酸结合口袋中将GDP交换为GTP来激活异源三聚体G蛋白复合物。活化的Gα-GTP和Gβγ亚基然后控制下游效应蛋白的活性并传播信号级联4，5。这种信号传导过程基本上取决于配体改变受体三维形状的能力。对配体如何实现这一目标的机制理解对于开发新疗法和设计合成受体和传感器至关重要。

代谢性谷氨酸受体（mGluRs）是C类GPCR家族的成员，对于谷氨酸的缓慢神经调节作用和调节神经元兴奋性很重要6，7。在所有GPCR中，C类GPCR在结构上是独一无二的，因为它们作为专性二聚体起作用。mGluR包含....

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Protocol

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该协议的整体工作流程如图 1 所示。

1. 样品室的准备

  1. 玻片和盖玻片清洁
    注意:这些步骤旨在清洁载玻片的表面以及盖玻片，并为氨基硅烷化做好准备。对表面束缚分子进行单分子荧光实验的一个关键要求是钝化表面。最可靠和可重复的钝化技术涉及将惰性聚合物链作为致密层共价附着到玻璃表面。聚乙二醇（PEG）是用于表面钝化的最有效聚合物16。使用PEG（聚乙二醇化）的钝化程序的详细信息如下所述:
    1. 用记号笔标记要在载玻片上钻的孔（相距~6毫米，远离边缘）。使用Dremel在载玻片上钻小孔（直径1毫米）。在钻孔过程中将滑块浸入水中。
    2. 用丙酮清洗载玻片以去除记号笔上的残留墨水。
    3. 从丙酮中取出并用水冲洗载玻片，然后在水中以高功率（700 W）微波5分钟。
    4. 用水清洁载玻片，然后将其放入玻璃染色罐中进行超声处理。将盖玻片放入不同的染色罐中。
    5. 在23°C的浴超声仪中用丙酮超声处理载玻片和盖玻片30分钟。
    6. 同时，清洁玻璃烧瓶以制备下一步中使用的氨基硅烷化溶液。用1M KOH填充烧瓶，超声处理烧瓶30分钟，用水彻底冲洗出KOH，然后在甲醇中再超声处理30分钟。将烧瓶留在甲醇中，直到氨基硅烷化步骤的时间。
    7. 同时，从冰箱（-20°....

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Results

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基于UAA的FRET传感器的表达和荧光标记
本文讨论了在mGluR2（548UAA）的CRD内插入和荧光标记UAA（AZP）的示例性结果11。如前所述，要将AZP插入mGluR2中，工程翻译机制的共表达是必要的，其中包括修饰的tRNA合成酶和互补tRNA（pIRE4-Azi），以及使用诱变创建的在位置548处含有琥珀色密码子的mGluR2（图2A，B）。通过铜催化的环加成反应（图2C）通过铜催化的环加成反应实现AZP的标记，并导致548UAA的有效质膜标记（图2D）。为了验证全长548UAA的翻译和二聚体受体的完整性，对表达用Cy5标记的548UAA的HEK293T细胞的细胞裂解物进行了SDS-PAGE电泳。观察到250KDa的单条带，这与全长二聚体mGluR2一致（图2E）。

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Discussion

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GPCR是在细胞膜上起作用以启动信号转导的蛋白质。许多GPCR由多个域组成，信令依赖于域之间的合作相互作用。为了调节这些膜受体的性质，必须了解多个结构域的动态行为。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种荧光技术，能够实时测量蛋白质构象和动力学11，32。这里描述了一种结合smFRET，单分子下拉（SiMPull）和全内反射荧光（TIRF）显微镜以直接可视化固定在钝化表面上的单个蛋白质的重排的方法5，11，33。FRET对距离高度敏感，并有效地用作纳米级标尺，适用于探测分子内变化（3-8 nm）。与传统的生物物理方法相比，smFRET特别适合在~10 ms的时间尺度上研究大构象动力学，并且需要小样品体积（每个实验约1 fmol）。此外，与构象动力学的集成测量（例如核磁共振（NMR）34.......

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Disclosures

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作者声明没有竞争利益。

Acknowledgements

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我们感谢Reza Vafabakhsh实验室成员的讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01GM140272（R.V.），西北大学Searle生命科学领导基金和芝加哥生物医学联盟的支持，并得到了芝加哥社区信托基金的Searle基金（对R.V.）的支持。B.W.L.得到了美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）培训补助金T32GM-008061的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
（+）-L-抗坏血酸钠Sigma Aldrich货号 # 11140-250G
4-叠氮基-L-苯丙氨酸Chem-Impex International货号 # 06162
548UAALiauw 等人，2021转染构建
乙酸Fisher 化学64-19-7
丙酮Fisher 化学67-64-1
Adobe Illustrator （2022）https://www.adobe.com/ RRID：SCR_010279软件、算法
氨基胍（盐酸盐）开曼化学81530
氨基硅烷Aldrich919-30-2
浴超声仪 2.8 LFisher Scientific超声波浴 2.8 L
生物素-PEGLaysan Bio Inc项目#生物素-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES 点击化学工具1237-500
硫酸铜 （II） SigmaAldrich货号 # 451657-10G
盖玻片VWR16004-306样品室
Cy3 炔烃点击化学工具TA117-5
Cy5 炔烃点击化学工具TA116-5
DDMAnatrace部件# D310 1 GM洗涤剂
DDM-CHS （10：1）Anatrace部件# D310-CH210 1 ML洗涤剂与胆醇
定义的胎牛血清Thermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635SemrockNotch 过滤器
DMEM康宁10-013-CV
EMCCDAndorDU-897U相机
ET542lpChroma长通发射滤光片
FF640-FDi01Semrock发射二向色滤光片
FLAG-tag 抗体GenscriptA01429
荧光珠Invitrogen T7279TetraSpeck 微球球形微球
载玻片Fisherfinest12-544-4样品室
谷氨酸Sigma Aldrich货号 # 6106-04-3
HEK 293TSigma Aldrich货号 # 12022001细胞系
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
图像分流器OptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
激光Oxxius4 线激光合路器
Lipofectamine 3000 转染试剂Thermo Fisher ScientificL3000015转染试剂
甲醇Fisher Chemical67-56-1
显微镜奥林巴斯OX83
Milli-Q 水Barnstead水去离子器
m-PEGLaysan Bio Inc项目# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635Semrock二向色镜
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091还原血清培养基
OptiMEM/还原血清培养基Thermo Fisher Scientific
OriginPro （2020b）https://www.originlab.com/RRID：SCR_014212数据分析和绘图软件
青霉素-链霉素Gibco15140-122
pIRE4-AziAddgene质粒 #105829 转染构建体
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐Sigma AldrichCat # P2636
原儿茶酸 （PCA）HWI 组99-50-3
smCamera （Version 1.0）http://ha.med.jhmi.edu/resources/相机软件
碳酸氢钠FisherBioReagents144-55-8
氢氧化钠 （NaOH）Sigma1310-73-2
针式过滤器Whatman UNIFLOCat#9914-2502液体过滤
TroloxSigma53188-07
体

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, ....

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