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利用单分子FRET可视化膜受体的构象动力学

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DOI：

10.3791/64254

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2022年8月17日

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

本文内容

摘要

本研究介绍了一种利用位点特异性标记技术在G蛋白偶联受体（GPCRs）上开展单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验的详细操作流程 通过 非天然氨基酸（UAA）整合。本方案提供了单分子FRET样品制备、实验操作及数据分析的逐步指导。

摘要

细胞对外部信号作出响应的能力对于细胞的发育、生长和存活至关重要。为了响应环境中的信号，细胞必须能够识别并处理该信号。这一任务主要依赖于膜受体的功能，其作用是将信号转化为细胞内的生化语言。G蛋白偶联受体（GPCRs）是人类中最大的膜受体蛋白家族。在GPCRs中，代谢型谷氨酸受体（mGluRs）是一个独特的亚类，以强制性二聚体形式发挥作用，并具有一个包含配体结合位点的大型胞外结构域。近年来对mGluRs的结构研究取得了进展，加深了对其激活过程的理解。然而，mGluRs在激活和调节过程中大规模构象变化的传播机制仍不清楚。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种强大的技术，可用于在单个蛋白质水平上可视化并量化生物分子的结构动态。为了可视化mGluR2激活的动态过程，研究人员开发了基于非天然氨基酸（UAA）插入的荧光构象传感器，实现了对蛋白质的位点特异性标记，同时不干扰受体的天然结构。本文所述方案详细说明了如何开展这些实验，包括新型UAA标记方法、样品制备以及smFRET数据的采集与分析。这些策略具有普适性，可推广应用于研究多种膜蛋白的构象动态。

引言

信息在质膜上的传递在很大程度上依赖于膜受体的功能1。配体与受体结合后会引起受体的构象变化并使其激活。这一过程通常具有变构特性2。G蛋白偶联受体（GPCRs）是人类中最大的膜受体家族，包含超过800个成员3。由于GPCRs几乎参与所有细胞过程，已成为治疗药物开发的重要靶点。在经典的GPCR信号转导模型中，激动剂激活导致受体发生构象变化，进而通过Gα亚基的核苷酸结合口袋中GDP被GTP取代，从而激活异源三聚体G蛋白复合物。via。随后，活化的Gα-GTP和Gβγ亚基调控下游效应蛋白的活性，推动信号级联反应的进行4,5。该信号转导过程本质上依赖于配体改变受体三维结构的能力。深入理解配体实现这一作用的分子机制，对于开发新型治疗药物以及设计合成受体和传感器至关重要。

代谢型谷氨酸受体（mGluRs）属于C类G蛋白偶联受体家族，在介导谷氨酸的慢速神经调制效应以及调节神经元兴奋性方面具有重要作用6,7在所有G蛋白偶联受体（GPCRs）中，C类GPCRs在结构上具有独特性，因其以强制性二聚体形式发挥功能。代谢型谷氨酸受体（mGluRs）包含三个结构域：捕蝇草（Venus flytrap, VFT）结构域、富含半胱氨酸结构域（cysteine-rich domain, CRD）和跨膜结构域（transmembrane domain, TMD）。8激活过程中的构象变化十分复杂，涉及局部与全局构象的耦合，其传播距离可达12 nm，同时还包括二聚体间的协同效应。目前，中间构象状态、各状态的时间顺序以及状态间转换速率仍不清楚。通过实时追踪单个受体的构象变化，可以识别激活过程中短暂存在的中间态以及构象变化的序列。这一目标可通过单分子荧光共振能量转移技术实现。9,10 单分子FRET（smFRET），近期已应用于可视化mGluR2激活过程中构象变化的传播11FRET实验中的一个关键步骤是通过在目标蛋白中特定位点插入供体和受体荧光团，从而构建FRET传感器。本研究采用了非天然氨基酸（UAA）插入策略12,13,14,15 克服典型位点特异性荧光标记技术的局限性，这些局限性包括需要构建无半胱氨酸突变体或插入较大的遗传编码标签。该方法使得mGluR2中连接配体结合域与信号传导域的关键紧凑型别构连接区的构象重排得以被观察。本方案提供了在mGluR2上进行单分子FRET实验的逐步操作指南，包括利用非天然氨基酸（UAA）实现mGluR2位点特异性标记，并通过铜催化的叠氮-炔环加成反应连接荧光团的方法。此外，本方案还描述了膜蛋白的直接捕获及数据分析方法。此处所述方案亦适用于研究其他膜蛋白的构象动力学。

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方案

该实验方案的整体工作流程见图1。

1. 样品室的准备

  1. 载玻片和盖玻片清洗
    注意：这些步骤旨在清洁载玻片和盖玻片的表面，为后续的氨基硅烷化处理做准备。在表面固定分子上进行单分子荧光实验时，一个关键要求是表面必须经过钝化处理。最可靠且可重复的钝化技术是将惰性聚合物链以高密度共价连接到玻璃表面。聚乙二醇（PEG）是用于表面钝化最有效的聚合物16使用聚乙二醇（PEG化）进行钝化的具体步骤如下所述：
    1. 用记号笔在载玻片上标记钻孔位置（孔间距约6 mm，且远离边缘）。使用Dremel在玻璃载玻片上钻出小孔（直径1 mm）。钻孔过程中将载玻片浸入水中。
    2. 用丙酮清洗载玻片，以去除记号笔的残留墨迹。
    3. 从丙酮中取出载玻片，用水冲洗，然后在水中以高功率（700 W）微波加热5分钟。
    4. 用水清洁载玻片，然后放入玻璃染色缸中进行超声处理。将盖玻片放入另一个染色缸中。
    5. 将载玻片和盖玻片在丙酮中于浴式超声波清洗器中超声处理30分钟 23 °C.
    6. 同时，清洗一个玻璃烧瓶，用于配制下一步所需的氨基硅烷化溶液。向烧瓶中加入1 M KOH，超声处理30分钟，用去离子水彻底冲洗干净，再在甲醇中超声处理30分钟。随后将烧瓶浸泡于甲醇中，直至进行氨基硅烷化步骤时使用。
    7. 与此同时，从冷冻柜（−20 °C）并在避光条件下使其恢复至室温（RT）。
    8. 将载玻片和盖玻片罐中的丙酮倒入指定的化学废液容器中，用水彻底冲洗，然后将载玻片在5 M KOH溶液中超声处理30分钟。
    9. 用清水冲洗载玻片和盖玻片，然后在甲醇中超声处理2分钟（重复两次）。将载玻片和盖玻片保留在盛有甲醇的容器中，直至进行氨基硅烷化步骤。
      注意：本研究中，除非另有说明，均使用去离子水。使用工作在 23 °C 被使用。
  2. 氨基硅烷化
    注意：此步骤旨在将氨基硅烷共价连接到洁净的载玻片和盖玻片表面。在下一步中，功能化的mPEG和生物素-PEG将共价结合到该表面。
    1. 在洁净的烧瓶中配制氨基硅烷化混合液（步骤 1.6）。将甲醇（150 mL）、乙酸（7.5 mL，使用玻璃移液管）和氨基硅烷（2.5 mL）混合，制备该溶液。
    2. 在通风橱中轻轻混合溶液，然后将其倒入载玻片和盖玻片的容器中。盖玻片使用50 mL，载玻片使用100 mL。确保载玻片和盖玻片完全浸没在溶液中。
    3. 孵育10分钟，然后对容器超声处理1分钟（超声可去除表面杂质），再孵育10分钟。
    4. 将氨基硅烷化溶液弃置至废液收集容器中。向罐中加入甲醇，盖上盖子，手动轻轻摇晃。弃去甲醇，再向罐中注满水。
    5. 将氨基硅烷试剂瓶放回冷冻柜（−20 °C).
  3. 聚乙二醇化
    注意：这些步骤描述了聚乙二醇化（PEGylation）操作流程。
    1. 在氨基硅烷化过程中，配制聚乙二醇化缓冲液。称取84 mg碳酸氢钠（NaHCO₃）3）并加入10 mL 水中（10 mM）。此外，称取mPEG和生物素-PEG并分别备用。对于六张载玻片和盖玻片，使用96 mg mPEG和1.2–2.4 mg 生物素-PEG。
      注意：切勿加入过多的生物素-PEG，否则会增加背景斑点的数量。在将 PEG 混合物施加到载玻片之前，切勿提前溶解。
    2. 用清水冲洗载玻片，以轻柔气流吹干，然后放入加湿的孵育盒中。
      注意：必须使用洁净的气路。避免使用压缩罐装空气，因其可能在玻璃表面留下残留物。
    3. 将聚乙二醇化缓冲液加入聚乙二醇粉末混合物中，轻轻反复吹打数次以溶解。加入 55 µL 每张载玻片加入适量的聚乙二醇化缓冲液（六张载玻片共需添加） 330 µL 的聚乙二醇化缓冲液）。
    4. 在 9,600 x g 23℃下持续1分钟 °C 沉淀未溶解的颗粒，收集上清液用于下一步操作。
      注意：由于 NHS 基团的存在，Biotin-PEG 会迅速水解。因此，混合与离心步骤必须迅速完成。
    5. 应用 60 µL 向每张载玻片上加入PEG化溶液，然后盖上盖玻片，使PEG化溶液夹在载玻片与盖玻片之间。
      注意：避免在载玻片与盖玻片之间产生气泡，否则会降低钝化效率。可用移液器吸头调整盖玻片和载玻片的位置以去除气泡。
    6. 将载玻片置于平坦、避光的抽屉中。载玻片可过夜保存；然而，孵育4–6小时可实现最佳的钝化效果。
      注意：必须记住哪一侧是聚乙二醇化的。
    7. 在储存前标记非聚乙二醇化的一侧。孵育后，轻轻拆卸载玻片和盖玻片，并用清水彻底冲洗。
    8. 用吹气法将载玻片和盖玻片干燥。将载玻片和盖玻片放入无菌管（50 mL）中保存，确保聚乙二醇化表面相对朝外。储存于 −20 °C 直至实验当天。
      注意：最好在制备后4周内使用载玻片和盖玻片。聚乙二醇化（PEGylated）表面应彼此背对放置。将聚乙二醇化载玻片和盖玻片存放在真空密封袋中可延长其保质期。

2. 含非天然氨基酸的mGluR2表达、荧光标记及提取

注意：本方案概述了表达含非天然氨基酸4-叠氮-L-苯丙氨酸（AZP）的mGluR2所需细胞的制备、试剂及处理步骤。该操作适用于生长在18 mm玻璃盖玻片上的HEK293T细胞。可根据需要按比例放大实验规模。

  1. 接种
    注意：将 HEK293T 细胞培养于添加有 10% (v/v) 胎牛血清、100 单位·mL−1 青霉素-链霉素和15 mM HEPES缓冲液（补充文件 1)（pH 7.4）于 37 °C 低于 5% CO₂2.
    1. 用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化细胞。将HEK293T细胞接种于多聚-L-赖氨酸/多聚-D-赖氨酸（PLL/PDL）包被的玻璃盖玻片上，使其在转染时达到≥80%的融合度。
  2. 转染
    1. 在 0.1 M NaOH 中配制 40 mM AZP 储存液。
    2. 制备含AZP的培养基用于细胞培养和mGluR2表达。在标准培养基（含FBS、青霉素/链霉素、15 mM HEPES）中加入40 mM AZP储备液，使AZP终浓度为0.6 mM。同时加入1 M HEPES溶液（加入体积为所加40 mM AZP储备液体积的一半）。例如，配制10 mL含AZP培养基时，混合9.775 mL标准培养基、 150 µL 40 mM AZP 储存液 75 µL 1 M HEPES 溶液
    3. 使用注射器滤器对培养基进行过滤（除菌）0.2 µm，PES）。
    4. 转染前，将标准培养基更换为含有AZP的培养基。
      注意：更换培养基时切勿使细胞干燥。
    5. 使用转染试剂对细胞进行转染（材料清单）按照制造商说明书操作。使用总共 2 µg DNA（1000 ng tRNA/合成酶 + 1000 ng 含琥珀密码子的蛋白质质粒）。参见 表1 用于组分的浓度和体积。
    6. 转染后24 h更换为新鲜的含AZP培养基，继续培养细胞24 h。
  3. 使用炔烃氰基染料进行标记
    1. 标记前20 min，用温热（37 °C)记录缓冲液（RB）(补充文件 1）两次，然后将其转移至温暖（37 °C标准培养基，不含AZP（含FBS、青霉素/链霉素、15 mM HEPES）。
    2. 配制含有 Cy3-炔烃、Cy5-炔烃、BTTES、硫酸铜（CuSO4）、L-抗坏血酸钠（+）和氨基胍的标记溶液。
    3. 按照配制和添加溶液的顺序进行操作（表 2):
      1. 配制 50 mM BTTES。
      2. 配制 100 mM 氨基胍。
      3. 配制 100 mM Na-抗坏血酸。
      4. 准备 655.5 µL 的RB。
      5. 向 RB 中加入 Cy3/Cy5 炔烃染料（DMSO 配制的 10 mM 储存液）。
        注意： 向RB中加入氨基胍。
      6. 制备 20 mM CuSO₄ 溶液4.
      7. 将CuSO4和BTTES混合于新试管中（溶液将变为蓝色）。
      8. 将 CuSO4 和 BTTES 混合物加入 RB（2.3.3.6.）中
      9. 加入Na-Ascorbate。
      10. 按照给定的体积进行操作 表2 适用于18 mm盖玻片下方。
    4. 将溶液充分混匀，置于冰上避光孵育10分钟，然后再进行细胞标记。
    5. 在将标记溶液加入盖玻片前，移除培养基并用 RB 洗涤。加入标记溶液，在 15 min 内孵育 37 °C 在黑暗条件下。
    6. 注意：为提高标记效果，可在10分钟后加入谷氨酸（终浓度约0.5 mM），并继续孵育5分钟。铜对细胞毒性很强，标记反应时间不应超过15分钟。 体内. 所有组分均需新鲜配制。最后加入 Na-抗坏血酸。保持反应在 4°C 准备过程中可暂存于室温。然而，一旦加入标记溶液，细胞须储存于 37 °C 在培养箱内。
  4. 收集细胞并提取蛋白质（细胞裂解）
    1. 移除标记溶液，用RB缓冲液洗涤含有转染mGluR2细胞的盖玻片（18 mm）两次。
    2. 用移液器将细胞从盖玻片上冲洗下来，并重悬于1 mL RB缓冲液中。
      注意：从此步骤开始，应尽可能避免样品暴露于光线下。
    3. 通过以 1,000 x g 离心使细胞沉淀 g 在 4 °C 5 分钟，弃上清液。将细胞沉淀重悬于 80-130 µL 裂解液的
      注意：细胞沉淀应能用肉眼观察到。裂解液体积取决于标记和洗涤过程中损失的样品量。
    4. 用移液器轻轻吹打混匀，以充分重悬沉淀。用铝箔包裹后置于摇床上 4 °C 孵育 0.5–1 小时以裂解细胞。
    5. 通过20,000 x g离心沉淀不溶性组分 g 和 4 °C 孵育20分钟。将上清液转移至预冷的新离心管中（含有目标荧光标记蛋白的裂解蛋白），并置于冰上保存，用于后续实验。

3. 单分子流动室的组装与功能化

  1. 从冷冻箱中取出载玻片和盖玻片，置于室温下避光回温约30分钟。
  2. 使用双面胶带组装流动池：将双面胶带条带夹在载玻片与盖玻片之间形成三明治结构。确保PEG修饰面朝内，构成流动池的内表面。
  3. 用移液器吸头轻压盖玻片，确保双面胶带与盖玻片和载玻片均完全贴合；注意避免压碎盖玻片。在载玻片边缘涂抹环氧树脂。
    注意：添加的环氧树脂量不宜过多，以免堵塞钻孔。
  4. 将流动池盖玻片朝下放置于加湿避光盒中，使环氧树脂固化（约30分钟）。
    注意：在固化期间，通过钻孔加入T50缓冲液（补充文件1），防止环氧树脂封堵孔洞（每孔10–15 µL）。
  5. 向每个流动池通道中缓慢加入约40 µL含500 nM Neutravidin（用T50缓冲液稀释）的溶液，进行孵育。
  6. 在加湿避光盒中室温孵育2分钟，随后每通道用约100 µL T50缓冲液洗涤。
  7. 向每个流动池通道中加入20 nM生物素化抗体11。抗体的选择取决于目标蛋白的标签类型。
    注意：若一抗未标记生物素，应先与生物素化二抗孵育30分钟，再加入一抗进行孵育。
  8. 在加湿避光盒中室温孵育30分钟，每通道用约200 µL T50缓冲液洗涤。
    注意：在制备过程中，确保各通道始终保持湿润，不得干燥。

4. 单分子缓冲液

  1. Trolox 缓冲液
    注意：Trolox 缓冲液是配制成像缓冲液的起始缓冲液。该缓冲液的组分取决于实验条件，可能根据目标蛋白的不同而有所变化。本方案中使用的缓冲液包含盐类（NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2）、缓冲剂（HEPES）和 Trolox（pH ~7.35）。
    1. 将 9–10 mg Trolox 溶解于 10 mL 单分子记录缓冲液（SRB，补充文件 1）中。
      注意：Trolox 会使缓冲液略呈酸性。在此阶段使用 10 M 氢氧化钠（NaOH）溶液调节 pH 至 7.35。在 Trolox 完全溶解后将进行精细 pH 调整；但在此时提高 pH 有助于增加 Trolox 的溶解度。
    2. 在室温下使用台式摇床混合溶液 4–8 小时（用铝箔包裹），以充分溶解 Trolox。
    3. 检查 pH 值，必要时进行调整。
    4. 确保 Trolox 完全溶解。用注射器滤器过滤灭菌后，于 4 °C 保存。
      注意：该缓冲液应在配制后放置 2–10 天使用。Trolox 有助于抑制荧光闪烁，常用于单分子研究17。其抗闪烁特性来源于 Trolox 的氧化衍生物18；因此建议在室温下放置至少数小时使其“成熟”。此外，对新鲜的 Trolox 溶液进行紫外照射可加速氧化过程，从而加快 Trolox 缓冲液的“老化”过程18。
  2. 成像缓冲液配方：将 Trolox 缓冲液 + 去垢剂（约为该去垢剂临界胶束浓度 CMC 的 2 倍）+ 4 mM 原儿茶酸（PCA）混合。
    注意：去垢剂浓度应接近 CMC，因为过高浓度可能导致蛋白变性增加。例如，可使用以下混合物：955 µL Trolox 缓冲液 + 5 µL 10% DDM + 胆固醇（质量百分比 W%，10:1）+ 40 µL 100 mM PCA 储备液。其中，PCA 作为抗氧化剂，此前已在单分子荧光共振能量转移（smFRET）研究中使用19。DDM 为非离子型去垢剂，常用于溶解膜蛋白20,21，并已广泛应用于单分子研究。DDM 是一种良好的首选去垢剂；但我们建议测试多种去垢剂，并确保实验结果具有一致性。

5. 显微镜设置与单分子FRET数据采集

  1. 打开计算机和显微镜。开启激光器预热（532 nm 激光用于激发 Cy3，640 nm 激光用于激发 Cy5）。
    注意：本实验使用配备 100 倍 TIRF 物镜（数值孔径 1.49）、图像分光器和 EMCCD 相机的倒置显微镜。系统包含四线激光合束器、二向色镜、长通发射滤光片、发射二向色滤光片和陷波滤光片。
  2. 启动 EMCCD 相机并打开相机软件。等待 20 分钟，使相机温度降至 −69 °C 并稳定。
  3. 将样品室安装到显微镜载物台上。逐步加入蛋白样品，使每个视野中约有 400 个分子（见步骤 2.4.5）。用 100 µL 成像缓冲液冲洗样品室。
  4. 调节增益、采集速率和激光功率，使供体和受体通道均能检测到单分子荧光信号。如有需要，调整样品室内蛋白的浓度。
    注意：若每个视野中分子数量超过 400 个，将更难区分单个分子，且背景噪声会更高。
  5. 激发供体并采集时间轨迹，直至视野中至少 80% 的供体分子发生光漂白。
  6. 在视频采集结束时，开启 640 nm 激光直接激发受体，直至部分受体分子发生光漂白，以帮助区分单体与多聚体。
  7. 移动至另一个视野，重复上述步骤，每种条件下至少采集三个视频（技术重复）。
    注意：在选择新的感兴趣区域（ROI）和调焦时，应使用尽可能低的激光功率，以最小化光漂白。采集过程中注意载物台漂移。若在移动至新 ROI 后观察到明显漂移，应在开始采集前等待 3 分钟。

6. 数据分析

  1. 供体与受体通道校准（电影映射）
    1. 在供体和受体通道中记录荧光微球的图像。
    2. 使用微珠数据生成映射文件，以关联每条分子的供体和受体荧光信号22,23.
      注意：单个分子的发射信号被图像分光器内部的发射二向色滤光片分为供体和受体信号，供体与受体图像并排投射到相机上。为了准确关联两个区域中单个分子的供体和受体强度，通常使用荧光微珠样品生成映射文件。利用该映射文件，将供体和受体通道中检测到的所有分子相互对应。随后分析生成每条分子的时间轨迹，即随时间变化的供体和受体强度。
  2. 单分子FRET轨迹的选择（颗粒挑选）
    注意：使用 MATLAB 检查并筛选单个粒子轨迹，以供后续分析。具体筛选标准取决于实验系统。此处概述了构成高质量粒子的一般准则。所有自定义修改的代码均可在 GitHub 上获取（https://github.com/vafabakhsh-lab）。
    1. 选择随时间变化总荧光强度（供体 + 受体）保持稳定的轨迹。选择供体与受体荧光强度呈反相关变化的轨迹。
    2. 选择显示单步光漂白的供体和受体分子。选择相应的荧光轨迹 >5 秒长。
      注意：漂白后每个通道的背景应降至零。轨迹中不应出现大量闪烁事件，否则会增加分析难度。
    3. 使用公式 E = (IA− 0.088 × ID)/(ID + [IA− 0.088 × ID])24,25,26，其中我D 我A 分别为原始供体和受体荧光强度。
      注意：使用532 nm激光激发仅标记供体的样品，以测定供体发射光渗漏至受体通道的程度。26. 泄漏校正因子0.088可能因所用滤光片组的不同而在不同实验装置中有所差异。需要强调的是，将FRET效率定量且可靠地转换为绝对距离，必须对供体和受体荧光强度进行多种因素的校正，该问题此前已有广泛讨论27.
  3. 通过隐马尔可夫模型（HMM）识别构象状态
    1. 执行 vbFRET28 在 MATLAB 中编写程序，并导入给定条件下选定的轨迹数据。设置潜在状态数量及迭代次数的约束条件。
      注意：根据代表性结果的原始数据，推测构象传感器可能存在多达四种离散的FRET状态；因此，设定状态范围为一至四种。先前分析表明，拟合效果的改善随状态数增加而趋于微小 >25 次迭代；因此，采用 25 次迭代对代表性数据进行拟合。
    2. 分析单分子FRET轨迹，并导出理想化轨迹和分析会话。将理想化轨迹保存至单独的文件夹，用于后续分析。
      注意：用于从理想化轨迹中提取状态转换和停留时间数据的程序已在先前发表的研究中提供29.
    3. 使用 MATLAB 程序提取状态转换，并将其绘制为热图，其中 X 轴坐标表示起始构象，Y 轴坐标表示终止构象。
      注意：转换定义为FRET值的变化 >在本文讨论的代表性结果中，该阈值为0.1。状态转换的阈值取决于目标蛋白所假设占据的构象态（设置转换阈值应小于最邻近FRET态之间的差异），以及实验装置所允许的分辨率。通过比较多种条件下的热图，可识别传感器经历的最常见构象态，从而确定其占据的构象态。在代表性结果中鉴定出四种FRET态（FRET = 0.31、0.51、0.71 和 0.89）。
    4. 使用 MATLAB 程序提取每种已识别构象状态的停留时间。设定用于界定每种状态的 FRET 值范围以及数据采集过程中的时间分辨率。FRET 范围由相邻的 FRET 状态等分。导出特定处理条件下的停留时间。
      注意：在大多数情况下，停留时间数据可通过单指数衰减函数进行良好拟合。该分析可在数据分析与绘图软件中完成。
  4. 通过高斯拟合单分子FRET群体直方图以量化状态占据率
    1. 将感兴趣条件下的群体FRET直方图导入数据分析与绘图软件，进行多峰拟合分析。
    2. 标明存在的峰数量（基于HMM分析的四个峰或状态）。拟合采用多个高斯分布进行30 定义为 figure-protocol-1，其中 A 是峰面积， xc 是峰中心，且 w 是每个峰的峰宽。
    3. 约束拟合参数为 A > 0, xc = 荧光共振能量转移 ± 0.02 和 0.1 ≤w≤ 0.24。对单个群体FRET直方图中的四个FRET峰进行同步拟合，并对所有条件的拟合应用已定义的约束。
    4. 将目标峰面积除以总面积（定义为所有峰面积之和），计算占据状态（百分比）。

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结果

基于非天然氨基酸的FRET传感器的表达与荧光标记
本文讨论了在mGluR2（548UAA）的CRD结构域中插入非天然氨基酸（AZP）并进行荧光标记的代表性结果11。如前所述，为将AZP插入mGluR2，需共表达经改造的翻译系统，该系统包括修饰的tRNA合成酶及其互补tRNA（pIRE4-Azi），同时共表达通过定点突变在第548位引入琥珀密码子的mGluR2（图2A、B）。AZP可通过铜催化的环加成反应被氰基染料标记（图2C），从而实现548UAA在细胞质膜上的有效标记（图2D）。为验证548UAA全长蛋白的翻译以及二聚体受体的完整性，对表达经Cy5标记的548UAA的HEK293T细胞裂解液进行了SDS-PAGE 电泳分析。结果显示在250 kDa处出现单一蛋白条带，与全长二聚体mGluR2的位置一致（

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讨论

G蛋白偶联受体（GPCRs）是一类位于细胞膜上、可启动信号转导的蛋白质。许多GPCRs由多个结构域组成，其信号传导依赖于这些结构域之间的协同相互作用。为了调控这类膜受体的性质，理解其多个结构域的动态行为至关重要。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种荧光技术，能够实时检测蛋白质的构象及其动态变化11,32。本文描述了一种结合smFRET、单分子下拉（SiMPull）和全内反射荧光（TIRF）显微镜的方法，用于直接观察固定在钝化表面上的单个蛋白质的重排过程5,11,33。FRET对距离高度敏感，可作为一种适用于探测分子内变化（3–8 nm）的纳米级标尺。与传统的生物物理方法相比，smFRET特别适用于在约10 ms时间尺度上研究大尺度的构象动态，并且所需样品体积小（每次实验约1 fmol）。此外，与核磁共振（NMR）

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢 Reza Vafabakhsh 实验室成员的讨论。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 R01GM140272（资助给 R.V.）、西北大学生命科学 Searle 领导力基金，以及芝加哥生物医学联盟在芝加哥社区信托 Searle 基金支持下（资助给 R.V.）提供资助。B.W.L. 受美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）培训项目 T32GM-008061 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(+)-L-抗坏血酸钠Sigma AldrichCat # 11140-250G
4-叠氮-L-苯丙氨酸Chem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw 等，2021转染质粒
乙酸Fisher Chemical64-19-7
丙酮Fisher Chemical67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279软件，算法
氨基胍（盐酸盐）Cayman Chemical81530
氨基硅烷Aldrich919-30-2
2.8 L 超声清洗机Fisher Scientific2.8 L 超声水浴
生物素-PEGLaysan Bio IncItem# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTESClick Chemistry Tools1237-500
硫酸铜（II）Sigma AldrichCat # 451657-10G
盖玻片VWR16004-306样品腔室
Cy3 炔烃Click Chemistry ToolsTA117-5
Cy5 炔烃Click Chemistry ToolsTA116-5
DDMAnatracePart# D310 1 GM去垢剂
DDM-CHS (10:1)AnatracePart# D310-CH210 1 ML含胆固醇去垢剂
定义型胎牛血清Thermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635Semrock陷波滤光片
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDAndorDU-897U相机
ET542lpChroma长通发射滤光片
FF640-FDi01Semrock发射二向色滤光片
FLAG标签抗体GenscriptA01429
荧光微球Invitrogen T7279TetraSpeck 微球球形微珠
载玻片Fisherfinest12-544-4样品腔室
谷氨酸Sigma AldrichCat # 6106-04-3
HEK 293TSigma AldrichCat # 12022001细胞系
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
图像分光器OptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
激光器Oxxius四线激光合束器
Lipofectamine 3000 转染试剂Thermo Fisher ScientificL3000015转染试剂
甲醇Fisher Chemical67-56-1
显微镜OlympusOlympus IX83
Milli-Q 水Barnstead去离子水装置
m-PEGLaysan Bio IncItem# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635Semrock二向色镜
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091低血清培养基
OptiMEM/低血清培养基Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212数据分析与绘图软件
青霉素-链霉素Gibco15140-122
pIRE4-AziAddgene质粒 # 105829转染质粒
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐Sigma AldrichCat # P2636
原儿茶酸（PCA）HWI group99-50-3
smCamera (版本 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/相机软件
碳酸氢钠FisherBioReagents144-55-8
氢氧化钠（NaOH）Sigma1310-73-2
注射器滤器Whatman UNIFLOCat#9914-2502液体过滤
TroloxSigma53188-07

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