开发和测试在 体外 抑制 Src 激酶活性的甲基化纳米结构二肽用于抗癌应用

Summary

这里介绍的是一种设计和测试二肽的方案，这些二肽可以使用脱细胞和细胞测定法抑制 Src 激酶活性，用于抗癌应用。此处配制的肽 （W-R_CH3、W_{CH3-R CH3} 和 W-R_（CH3）2） 抑制 Src 激酶，IC₅₀ 值分别为 510 nM、916 nM 和 1 μM。

Abstract

在这里，为了开发一种新的抗癌治疗方法，设计了七种含有甲基化色氨酸和/或甲基化精氨酸的二肽，并使用 Fmoc 固相肽合成产生。Src 酪氨酸激酶的过表达与不同癌症的发展有关。含有非天然氨基酸的二肽，如甲基化精氨酸 （R_CH3）、二甲基化精氨酸 （R_（CH3）2） 和/或甲基化色氨酸 （W_CH3） 残基，早先已被证明可以抑制 Src 激酶。在本研究中，使用脱细胞测定法测试了三种这样的二肽 W-R_CH3、W_{CH3-R CH3} 和 W-R_（CH3）2，发现其 IC₅₀ 值（发生 50% 抑制的浓度）分别为 510 nM、916 nM 和 1 μM。这些值与先前研究中合成的环状五纳米 W-R 肽 （[W-R]₅-[W-R]₉） 获得的值相当。然而，二肽的未甲基化版本对 Src 激酶没有显示出任何抑制活性。所有这些二肽 （50 μM） 在与三种不同的癌细胞系（包括白血病 （CCRF-CEM）、乳腺癌 （MDA-MB-231） 和卵巢腺癌 （SK-OV-3） 细胞系）孵育长达 72 小时后未显示出任何细胞毒性，表明肽通过细胞膜的通透性有限。因此，需要进一步研究以提高这些肽在抗癌应用中的通透性，例如通过使用肽载体或额外的肽功能化。总之，本研究提供了一种合成和测试抑制 Src 激酶活性的肽的方案，因此具有有希望的抗癌能力，如使用脱细胞和细胞测定所证明的那样。

Introduction

癌症是由正常细胞的异常生长引起的，是世界上最致命的疾病之一。这些异常细胞通过称为转移的过程扩散到身体的不同器官。最常见的癌症形式是乳腺癌，2020 年有 226 万人患上乳腺癌。此外，2020 年约有 180 万人死于肺癌¹。根据世界卫生组织的数据，2020 年约有 1000 万人死于癌症²。癌细胞与正常细胞的不同之处在于它们过表达某些酶，例如蛋白酪氨酸激酶 （PTK）。美国国家癌症研究所将激酶定义为能够磷酸化其他蛋白质或糖的酶³。了解激酶的调节功能可以促进有效抗癌药物的设计。例如，PTK 催化其他蛋白质或糖的磷酸化，因此，ATP 通过磷酸基团的缺失转化为 ADP。总共 80% 的癌基因和原癌基因编码 PTKs⁴。Src 激酶是一个非受体酪氨酸激酶家族，包括 Lck、Fyn、Hck、Blk、Yes 和 Yrk，它们在癌细胞中过表达，尤其是在乳腺癌中 ^5,6。Src 酪氨酸激酶与有丝分裂发生、分化、T 细胞活化和细胞转化有关。Src 有助于减少癌细胞粘附，因此有助于癌细胞侵袭和转移。Src 激酶有五个不同的结构域，从 N 端到 C 端排序为:脂肪酸结构域、Src 同源 3 结构域 （SH3）、Src 同源 2 结构域 （SH2）、酪氨酸激酶结构域 （SH1） 和 C 端调节结构域⁷。

图 1:Src 激酶中的靶结构域，包括 SH3 结构域、SH2 结构域、激酶结构域 （SH1） 和短的 C 末端调节片段。请单击此处查看此图的较大版本。

激酶结构域 SH1 在设计 Src 激酶抑制剂时最常靶向，因为它包含两个 ATP 和底物结合的保守位点（图 1）。如果激酶结构域的氨基酸序列已知，则底物也可以用作靶标，以设计模拟底物与 Src 激酶⁸ 结合的化合物。此外，其他站点（如 SH3 和 SH2 域）可以用作目标。与其他化疗药物相比，激酶抑制剂表现出更低的毒性和更高的疗效⁹。截至 2021 年 9 月，有 73 种小分子可作为激酶抑制剂获得 FDA¹⁰ 批准。伊马替尼是选择性抑制酪氨酸激酶活性的抗癌药物的一个例子;然而，由于激酶结构域¹¹ 中出现点突变，一些患者对药物产生耐药性。阿斯利康发布了萨拉替尼，这是一种抑制酪氨酸激酶 Src 家族的药物，IC₅₀ 值（发生 50% 抑制的浓度）为 2.7 nM，但在 2 期试验中被打了折扣¹²。截至 2020 年初，美国 FDA 批准的 52 种 PTK 抑制剂中¹³，只有 28 种靶受体 PTK，11 种阻断非受体 PTK，11 种抑制蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，2 种阻断 MEK_1/2¹³。对肿瘤学研究兴趣的日益浓厚将继续推动激酶抑制剂作为潜在抗癌药物的发现。然而，到目前为止，500 种蛋白激酶中只有 50 种被靶向治疗;因此，预计在不久的将来将研究更多的激酶用于药物开发¹⁴。此外，需要发现激酶抑制剂，以探索尚未确定的导致癌症的激酶突变。

因此，本研究旨在开发可用作 Src 家族抑制剂的肽，并靶向 ATP 结合位点，因为它能够作为不同激酶之间的保守位点。为此，合成了一系列含有甲基化色氨酸和/或甲基化精氨酸的二肽，并测试了它们抑制 Src 激酶的协同能力。色氨酸的吲哚环模拟 ATP 的腺嘌呤，并与 ATP 竞争结合到 ATP 结合位点。此外，配体中的甲基化精氨酸竞争 Src 的 SH3 结构域。研究人员表明，含有去甲基化精氨酸的多肽会抑制 SH3 结构域，这可能是由于 SH3 结合基序（即 PXXP）上的特定保守序列，该序列与配体 N 端含有 2 到 3 个 Arg 残基或配体 C 端含有 1 到 2 个 Arg 残基的配体具有结合亲和力^15，16,17.Arg 的胍基与 SH3 结构域的保守 Asp-99 残基结合^18,19，^而 Arg 的剩余部分与酶的保守 Trp-118 结合，NMR 分析和几个 SH3 结构域的晶体结构证实了这一点¹⁹。在这里，提出了一种合成 7 种甲基化二肽并测试它们对 Src 激酶的抑制能力的方案。此外，还检查了这些肽在体外杀死几种癌细胞系的能力。

Protocol

1. 多肽的合成

注意:W-R 的合成被描述为一个代表性示例（图 2）。

1. 称取 566 mg （0.3 mmol） H-Arg（Pbf）-2-氯三苯基树脂，并按照 Mandal 等人²⁰ 使用的程序将其添加到肽合成容器中（参见材料表）。使用成熟的固相肽合成 （SPPS） 策略进行肽合成²¹.
   注:含有非天然氨基酸的甲基化或二甲基化二肽组装在溜冰场酰胺树脂（负载量为 0.3 mmol/g）上，而含有天然氨基酸的二肽组装在连接了第一个氨基酸的树脂上，例如 H-Arg（Pbf）-2-氯三苯基树脂（负载量为 0.3 mmol/g）。重要的是，溜冰场酰胺树脂可产生一种封端有 C 端 NH₂ 的肽。
2. 在与肽容器相连的氮气压力下，在 5 mL N，N-二甲基甲酰胺 （DMF） 中将干燥树脂膨胀 1 小时。
   注:在通风橱中执行整个合成过程。在整个实验过程中需要佩戴护目镜、手套和实验服。计时器对于跟踪化学试剂添加步骤之间也是必不可少的。
3. 在整个合成过程中，使用与肽合成容器相连的氮气压力去除多余的 DMF。
4. 称取 473.9 mg Fmoc-trp（Boc）-OH （0.9 mmol） 和 341 mg 2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐 （HBTU） （0.9 mmol） 作为偶联试剂。将粉末加入试管中，并将其溶解在 5 mL 的干燥 DMF 中。
5. 将 313.4 μL （1.8 mmol） N，N-二异丙基乙胺 （DIPEA） 作为活化剂加入试管中（步骤 1.4），然后摇动试管混合。
6. 将试管的内容物加入树脂中，并在室温下在氮气下反应 1 小时。然后，使用氮气压力排空多余的 DMF，并用 DMF 洗涤树脂 3 次。
7. 在氮气下使用 5 mL 20% 哌啶的 DMF （v/v） 溶液 20 分钟脱保护 N 末端 Fmoc。用 DMF （3 x 5 mL） 洗涤树脂 3 次。
8. 加入 5 mL 二氯甲烷 （DCM） 干燥树脂，在氮气下保持 5 分钟，然后使用氮气压力排空 DCM。在氮气下加入 5 mL 甲醇 5 分钟，以增加树脂的干燥度。
9. 加入 10 mL 新鲜制备的 TFA/硫代苯甲醚/二硫苏糖醇/苯甲醚 （90:3:5:2 v/v/w/v） 的裂解混合物 2.5 小时，以脱去所有侧链并从树脂中裂解二肽。
   注意:需要将裂解混合物添加到玻璃量筒中，因为 TFA 是酸性的且危险的;使用时要小心。
10. 2.5 小时后，使用氮气压力将反应溶液从肽容器中排入圆底烧瓶中。将 250 mL 冷二乙醚 （Et₂O） 加入到含有粗肽的圆底烧瓶中，以沉淀肽。
11. 使用锥形漏斗中的滤纸过滤沉淀的肽，该漏斗的一侧臂与水相连（因此由于水压而发生过滤），并收集沉淀物（肽）以完全去除乙醚。粗肽在 10 分钟内沉淀。
12. 使用梯度系统在反相高效液相色谱 （HPLC） 柱上纯化粗肽（参见 材料表）。使用含 0.1% TFA 的 0%-100% 乙腈梯度在含 0.1% TFA 的水溶液中，以 1 mL/min 的流速处理 30-60 分钟。

图 2:W-R 的固相肽合成。 缩写:HBTU = 2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐;DIPEA = N，N-二异丙基乙胺;TFA = 三氟乙酸;DMF = 二甲基甲酰胺。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 合成肽的细胞毒性测定

1. 将 2,000 个细胞/孔的 SK-OV-3 细胞、5,000 个细胞/孔的 MDA-MB-231 细胞或 5 ×^{10 个 6} 个细胞/孔的 CCRF-CEM 细胞（总体积为 100 μL/孔）接种到 96 孔微孔板中。将细胞在 37 °C 的 5% CO₂、95% 空气的潮湿气氛中孵育，直到它们达到 75%-80% 汇合。
   注:RPMI-16 培养基用于培养 CCRF-CEM 细胞，是 MDA-MB-231 和 SK-OV-3 细胞系的 Eagle 最低必需培养基 （EMEM）。两种培养基均补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素，溶于 0.9% NaCl）。在开始实验之前，将所有培养基和补充剂置于 37 °C 水浴中 30 分钟。实验应在生物安全罩中进行，戴手套和穿实验服。
2. 使用移液管吸出培养基，并将 100 μL 的 50 μM 肽或 10 μM 阿霉素 （Dox） 用作阳性对照，一式三份加入含有三种不同类型癌细胞的孔中，接种在 96 孔板中。将板放回培养箱中 72 小时（在步骤 2.1 中提到的相同条件下）。
3. 72 小时后，将 20 μL 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑 （MTS） 添加到 96 孔板中。用铝箔包裹板，并在潮湿的环境中于 37 °C 下孵育板 1-4 小时。
   注:MTS 是一种用于可视化活细胞（未处理或经肽处理）的染料，因为只有活细胞将 MTS 四唑转化为可以在 490 nm 处测量的有色甲臜染料。
4. 在酶标仪上测量甲臜产物在 490 nm （A₄₉₀） 处的吸光度（参见 材料表）。包括与 MTS 混合的培养基作为实验的空白。单独使用水（因为肽是水溶性的）和 0.1 N HCl（因为 W_CH3 需要 HCl 溶解）作为阴性对照。
5. 使用以下公式（方程式 1）使用电子表格程序测量细胞存活的百分比（参见 材料表）。该程序与 Mandal 等人²⁰ 使用的程序相同。
   方程 （1）

3. c-Src 激酶活性测定

注:根据 Chhikara 等人的程序，使用商业检测试剂盒（参见 材料表）一式三份进行 Src 激酶活性测定²²。单独使用 W_CH3 和 R_CH3 作为对照，以比较单独甲基化氨基酸对激酶以及与另一种甲基化或未甲基化氨基酸的影响。

1. 在 384 孔低体积黑色非结合表面圆底微孔板中，将 2.5 μL 反应混合物加入激酶缓冲液中含有 0.7 nM His_6-Src 激酶结构域，这是检测试剂盒的一部分，加入 2.5 μL 溶解在 10% DMSO（4 倍靶标浓度）中的预稀释肽中。按照制造商的方案，使用微孔板振荡器 （5 rpm） 在室温下孵育 10 分钟。
   注:反应混合物由激酶缓冲液（200 mM HEPES，pH 7.5）、MgCl₂ （16 mM）、DMSO （4%）、EGTA （8 mM）、2-巯基乙醇 （43 mM） 和 Brij-35 （0.04%） 组成。本实验激酶反应的最佳底物是 （AEEEIYGEFEAKKKK）。
2. 向板中加入 5 μL ATP/底物 （40 μM/600 μM） 混合物，并在室温下在微孔板振荡器上孵育 30 分钟。
3. 同时，将含有 8 nM ADP 示踪剂和 10 μg/mL 染料偶联的 ADP² 抗体（参见 材料表）的 1x ADP 检测混合物制备到终止剂中，并从试剂盒中检测缓冲液 B （1x）。通过加入 10 μL 的 1x ADP 检测混合物终止激酶反应（步骤 3.2），并在室温下孵育 1 小时。
4. 使用酶标仪测量荧光强度，激发波长为 580 nm，发射波长为 630 nm，谱带宽度为 10 nm。根据方程 （2），从仪器获得相对荧光单位 （RFU），以获得酶抑制的百分比。
   方程式 （2）
5. 计算公司网站²³ 上列出的 IC₅₀ 值。

Results

W-R_CH3、W_{CH3-R CH3}、W-R_（CH3）2、_WCH3-R、W_{CH3-R（CH3）2} 和对照 W-R 肽采用 Fmoc 固相肽合成合成（图 3），纯度分别为 95%、98.7%、99%、100%、100% 和 99.5%。使用 ESI-MS 确认这些二肽的化学结构。这些二肽的 m/z 值分别为 374.1624、388.1949、388.1794、374.1815、402.2022 和 361.1457。

图 3...

Discussion

这里制造和测试的用于抑制 Src 激酶并随后杀死癌细胞的肽含有甲基化色氨酸和/或甲基化精氨酸，它们是非天然氨基酸。添加乙醚时形成白色沉淀是合成这些肽的关键步骤。然而，并非所有合成肽都能形成沉淀物;因此，即使没有形成沉淀物，也可以通过使用液相色谱-质谱法 （LC-MS） 测定所需质量来确认肽合成成功。肽质量可以进一步用于预测肽的 ¹H-NMR 波谱。已知非天然氨基酸比天然氨基酸更稳定且更耐蛋白酶²⁵ 的蛋白水解降解，因此可以更好地抑制 Src 激酶活性。此外，非天然甲基化氨基酸，如甲基化丙氨酸（即 α-氨基异丁酸）具有抗癌和抗菌活性²⁶。精氨酸氨基酸的胍基有五个氢键供体，可以通过添加甲基来去除。这将改变氨基酸的结构，导致其结合相互作用和功能发生变化。

含色氨酸的二肽，如 H-L-Trp-L-Arg-OH （W-R），具有不同的应用。例如，WR 二肽已显示出作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ （PPARγ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	10708984001	肽合成
用于固相合成的 Aldrich 熔块滤纸漏斗	Sigma-Aldrich	Z283304	肽合成容器
Alexa594 示踪剂	Bell Brook Labs， Madison， WI	3013
苯甲醚	Sigma-Aldrich	8014520500
CellTiter 96 AQueous One 解决方案 细胞增殖检测试剂	Promega	G3582	细胞增殖测定（MTS 试剂）
二氯甲烷，99.9%，超干	Fishersci	AC326850025
Fmoc-ADMA（Pbf）-OH	Sigma-Aldrich	8521070001
Fmoc-Arg（Me，Pbf）-OH	Sigma-Aldrich	8521050001
Fmoc-Arg（Pbf）-OH	Sigma-Aldrich	8520670025
Fmoc-Trp（Boc）-OH	Sigma-Aldrich	47561-25G-F
HPLC C18 色谱柱	岛津 （RP-HPLC 系统）		水/乙腈梯度
IRDye QC-1 淬灭剂	Bell Brook Labs， Madison， WI	3013
酶标仪 SpectraMax M2e	分子器件
Microsoft Excel	Microsoft		电子表格软件
N，N-二异丙基乙胺 （DIPEA）	Sigma-Aldrich	496219
N，N-二甲基甲酰胺，无水，99.8%	Fishersci	AA43997M1
哌啶 20%	Sigma-Aldrich	80645
溜冰场酰胺树脂（100-200 目）	Sigma-Aldrich	8550010025
硫代苯甲醚	Sigma-Aldrich	92358
Transcreener ADP2 FI 检测	Bell Brook Labs，麦迪逊，威斯康	3013	c-Src 激酶活性检测试剂盒