用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

摘要

该协议描述了如何使用市售蛋白质成分在珠子表面产生肌动蛋白彗星。这种系统模仿细胞中发现的突起结构，并可用于以简化的方式检查力产生的生理机制。

摘要

许多细胞运动和形状变化以及某些类型的细胞内细菌和细胞器运动是由生物聚合物肌动蛋白驱动的，该肌动蛋白在细胞，细胞器或细菌表面形成动态网络。在此过程中力产生的生化和机械基础可以通过在惰性表面上以无细胞方式复制基于肌动蛋白的运动来研究，例如功能化并与一组受控组分一起孵育的珠子。在适当的条件下，弹性肌动蛋白网络在磁珠表面组装，并因网络生长产生的应力而破裂，形成推动磁珠前进的"肌动蛋白彗星"。然而，这样的实验需要纯化许多不同的肌动蛋白结合蛋白，通常使它们超出非专业人士的范围。本文详细介绍了使用市售试剂可重复获得肌动蛋白彗星和磁珠运动的方案。可以改变磁珠涂层、磁珠尺寸和运动性混合物，以观察对磁珠速度、轨迹和其他参数的影响。该测定可用于测试不同肌动蛋白结合蛋白的生化活性，并用于进行定量物理测量，以阐明肌动蛋白网络的活性物质特性。这将是社区的有用工具，无需肌动蛋白结合蛋白纯化方面的专业知识即可研究 体外 基于肌动蛋白的运动。

引言

细胞中的肌动蛋白聚合在空间和时间上通过严格调节细胞^{信号传导下游}的肌动蛋白丝成核来控制1。成核是通过肌动蛋白三聚体的形成发生的，然后新生细丝的两端自发聚合，尽管一端（倒刺端）比另一端（尖^端）更动态2。当成核和倒刺端聚合指向表面时，它们会产生足够的力（在皮纳米牛顿范围内）以推出细胞膜进行运动，并以ATP水解为能量源在细胞内移动微米大小的物体³。一些例子包括使用肌动蛋白彗星在细胞之间传播的单核细胞增生李斯特菌，以及线粒体，其中基于肌动蛋白彗星的运动对于有丝分裂期间的随机遗传很重要^4，5.内体和其他细胞内囊泡上的肌动蛋白彗星与供体膜的分离有关6，^7，8。

使用此处介绍的方法，绕过细胞肌动蛋白聚合的信号传导方面，并通过用支链肌动蛋白成核的激活剂涂覆在微米聚苯乙烯珠上产生肌动蛋白聚合，特别是人WASP蛋白VCA（也称为WA或^WCA）的活性结构域1。然后将包被的磁珠在含有肌动蛋白聚合所需成分的混合物中孵育，包括细胞中的主要肌动蛋白聚合成核剂Arp2 / 3复合物，其在磁珠表面被VCA激活以形成新的细丝作为子丝侧面的分支^1。肌动蛋白最初在磁珠周围均匀聚合，但随后自发地打破对称性，形成肌动蛋白彗星，推动磁珠向前，从而以受控方式重建细胞状突起网络和彗星。我们和其他人过去曾使用过类似的磁珠和其他涂层表面方法来研究肌动蛋白聚合^的生物化学和生物物理学9，^10，11，^12，但这些实验需要肌动蛋白结合蛋白的广泛专业知识。这里介绍的方案描述了如何完全使用市售（或即将上市）试剂稳健地创建肌动蛋白彗星和运动，使任何人都可以使用这种方法，包括在教授生物物理概念的教育环境中。主要特点包括温和可靠的移液的重要性，使用profilin复合单体作为肌动蛋白来源，以及使用高活性Apr2/3复合物活化剂作为磁珠包衣试剂的重要性。

方案

1. 缓冲液的制备

注意:所有缓冲液均使用超纯H₂O。它不一定是无菌的。用0.2μm注射器过滤器过滤步骤1.1-1.4中描述的所有溶液，根据使用情况等分试样每管500μL-2mL，并储存在-20°C。

1. 通过将 2 g BSA 称入 50 mL 锥形管中并用 H₂O 填充至 20 mL 标记来制备 10% BSA.混合直至 BSA 溶解（约 30 分钟），然后将体积补足至 20 mL。
   注意:使用高质量的BSA（见 材料表）。10% BSA 溶液用于磁珠制备和运动混合物。
2. 对于微球制备，制备 Xb 缓冲液（10 mM HEPES、0.1 M KCl、1 mM MgCl 2 和 0.1 mM CaCl 2，pH 7.5）作为 10x 溶液，并在使用前稀释（100 μL 10x Xb 储备溶液 + 900 μL H₂ O）。通过混合 100 μL 10x Xb 储备溶液 + 100 μL 10% BSA + 800 μL H₂O 来制备 Xb/1% BSA。
3. 制备G缓冲液（2mM Tris，0.2mM CaCl₂，0.2mM DTT，2mM ATP），这是用于稀释单体肌动蛋白（G-肌动蛋白）的缓冲液。调节至pH 7，而不是传统上使用的pH 8（见讨论）。
4. 准备运动缓冲液MB13（10 mM HEPES，1.5 mM ATP，3 mM DTT，1.5 mM MgCl₂，1 mM EGTA，50 mM KCl，1% BSA，pH 7.5）。对于某些应用，10x MB13 很有用。但是，准备不含BSA的10x MB13，因为它会导致pH调节过程中出现问题。从10x MB13重建1x MB13时，从10%储备溶液（在步骤1.1中制备）加入BSA。

2. 蛋白质溶液的制备

注意:所有混悬液均使用超纯 H₂O。它不一定是无菌的。将所有蛋白质放在冰上，并等分试样放入预冷的试管中。轻轻操作以免产生气泡，切勿涡旋蛋白质溶液。对于在-80°C下储存的库存，不需要在液氮中快速冷冻。调整等分试样大小以避免超过五个冻融循环，因为这似乎不会影响任何蛋白质的活性。工作等分试样可以在-20°C下储存数周。

1. 如下所述准备G-肌动蛋白（兔骨骼肌）溶液。
   1. 在4°C下脉冲离心肌动蛋白粉末（见 材料表）以收集管底部的固体。
   2. 按照制造商的说明添加 H₂O（未标记肌动蛋白在 100 μL 冷 H 2 O 中加入 1 mg 蛋白质，ATTO 标记的肌动蛋白在 100 μL 冷 H₂O 中加入 100 μg 蛋白质）。
   3. 让它在冰上放置至少 15 分钟。通过上下移液轻轻混合，让它在冰上至少再放置 15 分钟，然后再次混合。在4°C下脉冲离心以收集管底部的溶液，并重新混合。
   4. 根据用途制备 10-50 μL 等分试样的未标记肌动蛋白和 20 μL 等分试样的 ATTO 标记的肌动蛋白。将等分试样储存在-80°C。
   5. 为了解聚在冻干和冷冻过程中形成的肌动蛋白低聚物，在加有额外ATP和DTT的G缓冲液中稀释等分试样重悬肌动蛋白~8倍（例如，加入步骤2.1.4中的20μL重悬肌动蛋白溶液，加入134μLG缓冲液，0.32μL0.2mM ATP和0.16μL1M DTT）。对于荧光标记，添加约10%标记的肌动蛋白;例如，将 5 μL ATTO 标记的肌动蛋白添加到 40 μL 稀释的未标记肌动蛋白中。让它在冰上解聚，偶尔混合（移液）至少几天到一周，然后通过布拉德福德测定法测量蛋白质浓度，如步骤3中所述。
      注意:将稀释的未标记和荧光肌动蛋白保存在冷藏室或冰箱的冰上;切勿冷冻或加热。随着时间的推移，该制剂将继续解聚，如果处理得当，可以使用至少 6 个月。
2. 按照制造商的说明重悬Arp2 / 3复合物（猪脑）（参见 材料表）（20μg蛋白质在20μL冷H 2 O中），按照步骤_2.1中对肌动蛋白的描述在冰上进行脉冲离心，混合等的顺序。将重悬两管粉末产生的蛋白质溶液组合成更大的原液，用于可重复的实验。准备2μL等分试样并储存在-80°C。
3. 以比制造商说明中规定的浓度高4倍重悬profilin（人重组）（参见 材料表）（100μg蛋白质在25μL冷H 2 O中），在冰上按脉冲离心，混合等顺序在冰上与步骤_2.1中的肌动蛋白一样。在确定蛋白质浓度之前，将重悬两管粉末的蛋白质溶液合并，以获得更大的原液以进行可重复的实验。
   注意:放在冷藏室或冰箱的冰上;切勿冷冻或加热。如果处理得当，重悬的Profilin至少可以保存6个月至1年。
4. 按照制造商的说明重悬加帽蛋白（α1β2，人重组）（参见 材料表）（50μg蛋白质在50μL冷H 2 O中），按照步骤_2.1中对肌动蛋白的描述在冰上进行脉冲离心，混合等的顺序。在冰上冷却 50 μL 甘油，并向其中加入 50 μL 重悬的封端蛋白;轻轻混合。储存在-20°C。
   注意:该溶液不会冻结，活性稳定，因此如果处理得当，溶液可以作为单个等分试样保存数月甚至数年。小鼠重组帽蛋白是过去体 外 实验¹³中最常用的一种，将很快上市。
5. 按照制造商的说明重悬凝胶索林（人重组，His标记）（参见 材料表）（20μg蛋白质在20μL冷H 2 O中），按照步骤_2.1中对肌动蛋白的描述在冰上进行脉冲离心，混合等的顺序。每天的实验使用约2μL凝胶索林;因此，制备大等分试样（5-10μL）并储存在-80°C。
   注意:凝胶索林方案作为替代方案提供。建议使用封端蛋白代替凝胶索林，购买或纯化如¹³。
6. 重悬VCA（人WASP-VCA，GST-标记）（见 材料表）的浓度比制造商说明中规定的浓度高2倍（500μg蛋白质在250μL冷H 2 O中），在冰上按脉冲离心，混合等顺序与步骤_2.1中的肌动蛋白相同。制作10μL等分试样并储存在-80°C。
   注意:一旦SpVCA（人pVCA，链霉亲和素和His标记）商业化，或者如果蛋白质纯化¹⁴ 是可能的，建议使用SpVCA代替VCA。VCA不能在这里描述的条件下重复地给出彗星。

3. 蛋白质浓度的测量

1. 构建由两个重叠的BSA系列稀释液组成的布拉德福德标准曲线。
   注意:只要分光光度计不改变，标准曲线只需要每隔几个月（甚至更少频率）构建一次。
   1. 在微管架的第 1 行中，放置用于 BSA 稀释系列 #1 的管:四个 2 mL 管，然后是四个 1.5 mL 管。在机架的第 3 行中，放置用于 BSA 稀释系列 #2 的管，就像系列 #1 一样。在样品架的第 5 排，为每个待测样品放置一个 2 mL 管和两个 1.5 mL 管。在第 5 行中为空白添加单个 1.5 mL 管。
   2. 将布拉德福德试剂（参见 材料表）量入 1.5 mL 管中。
      1. 用Bradford试剂将15 mL锥形管填充到顶部，以便于在冰上移液（多余的将返回冰箱中的库存瓶中）。取 200 μL Bradford 试剂并将其弹出回锥形管中以润湿移液器吸头。由于溶液是粘稠的，请缓慢移液，使溶液完全进入和离开吸头，而不会产生气泡。
      2. 使用"预湿"吸头，将 200 μL Bradford 试剂缓慢移液到架子中每个 1.5 mL 管中（每个 BSA 稀释液四个，空白一个，每个待测样品两个）。首先这样做，让Bradford试剂在与蛋白质溶液混合之前彻底加热至室温。将 15 mL 锥形管的剩余内容物放回瓶中。
   3. 在 2 mL 管中测量出 H₂O。在架子的第 1 行中，向第一个试管中加入 1，990 μL H₂O，向其他三个试管中加入 900 μL。对于第 3 行，向第一个试管中加入 1，992.5 μL，向其他三个试管中加入 900 μL。向第 5 行中的每个样品管中加入 2，000 μL H₂O。
      注意:对于所有大于 1，000 μL 的体积，请使用 1，000 μL 移液器，但通过移液两次给药。在开始后续步骤之前准备好一切很重要，以避免蛋白质在H₂O中长时间高度稀释。
   4. 要制备 BSA 稀释系列 #1，请将 10 μL 校准的 2 mg/mL BSA（参见 材料表）与 1，990 μL H₂O 混合到管中，制成 10 μg/mL 溶液。由此，通过将 900 μL 每种溶液转移到下一个试管（含有 900 μL H 2 O）中进行三次连续稀释（5 μg/mL、_2.5μg/mL 和 1.25 μg/mL BSA）。
   5. 要制备 BSA 稀释系列 #2，请将 7.5 μL 校准的 2 mg/mL BSA 与 1，992.5 μL H₂O 混合到管中，制成 7.5 μg/mL 溶液。由此，通过将 900 μL 每种溶液转移到下一个试管（含有 900 μL H₂O）中进行三次连续稀释（3.75 μg/mL、1.875 μg/mL 和 0.9375 μg/mL BSA）。
   6. 混合并读取吸光度以生成标准曲线。向布拉德福德试剂管中加入 800 μL H₂O 用于空白，然后启动计时器。在不产生气泡的情况下尽可能高效地将每种BSA标准品的800 μL与制备的试管中的200 μLBradford试剂混合。将所有标准品与Bradford试剂混合（<5分钟）后，将每个标准品倒入一次性比色皿中，并在机器消隐后在分光光度计中读取600nm处的吸光度。
      注意:如果首先读取浓度最低的标准品，并且两次读取之间比色皿清空，则可以使用相同的比色皿读取整个系列。重做标准曲线，直到线性拟合的 R 值至少为 0.99。只有在掌握移液和温和混合后，才能继续读取样品。
2. 测量肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白的浓度
   1. 在含有 2，000 μL H 2 O 的 2 mL 管中（在步骤 3.1.3 中制备），轻轻混合以下内容:Arp2/3 复合物和细丝蛋白各₂μL、标记的 G-肌动蛋白 4 μL、凝胶索林和 VCA 各 5 μL 以及 8 μL 封端蛋白（人重组）。立即取 800 μL 溶液并与已制备的 Bradford 试剂混合，然后重复以使每个样品的两个读数在 5%-10% 以内。较大的差异表示重新悬挂或处理存在问题。与布拉德福德试剂混合后几分钟内读取。
      注意:如果使用另一天的标准曲线，则除了样品外，只需准备步骤3.1.6中的空白。
3. 使用标准曲线和稀释因子计算肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白的浓度。重做每个新悬浮液的测量。将通过Bradford测定 获得 的mg / mL读数转换为μM的分子量为:肌动蛋白43 kD，Arp2 / 3复合物224 kD，profilin 15 kD，凝胶索林95 kD，加帽蛋白68 kD（人重组）或63.5 kD（小鼠重组），VCA 43 kD和SpVCA 54 kD（单体分子量）。

4. 珠子的涂层

1. 将离心机预冷至4°C，并将搅拌干块（参见 材料表）设置为18°C。
2. 洗涤磁珠:将 50 μL Xb 缓冲液移液到 1.5 mL 微量离心管中，加入 9 μL 直径为 4.5 μm 的磁珠悬浮液或 2 μL 直径为 1 μm 的磁珠悬浮液（2.5 % w/v 悬浮液）（参见 材料表）。充分混合并在4°C下以20，000× g 离心样品10分钟。
   注意:两种磁珠尺寸的总磁珠表面积均为 3 cm²:
   
   通过使用球体体积和表面积的经典方程计算珠子的数量，然后计算它们的总表面得出。如果调整量以保持总表面积恒定在 3 cm²，则可以使用其他尺寸的珠子。
3. 涂覆磁珠:小心地除去上清液而不干扰磁珠，并通过轻轻移液将磁珠沉淀重悬于40μL的2μM SpVCA（或7μM VCA）的Xb缓冲液中。在18°C，1，000rpm下搅拌20分钟。
4. 洗涤包被的珠子:将混合物（20，000× g 在4°C下离心10分钟），并小心地除去上清液。将珠子重悬于50μL冷Xb / 1%BSA中，并在4°C下以20，000× g 离心10分钟。 除去上清液并重复洗涤步骤1x。
5. 将步骤 4.4 中的包被磁珠沉淀重悬于 120 μL 冷 Xb/1% BSA 中，用于两种尺寸的磁珠，以使磁珠表面积/μL 磁珠溶液的量相同。存放在冰箱或冷藏室的冰上。包被的珠子将持续正常运作至少几周。

5. 准备运动混合物和载玻片以供观察

注意:运动混合物的总体积为8.4μL，以使载玻片和18 mm x 18 mm盖玻片之间的间隙约为25 μm，因此不会挤压各种尺寸（直径最大为10 μm）的珠子。基本运动混合物约为 5 μM G-肌动蛋白（10% 标记的荧光肌动蛋白）与 5 μM 蛋白、50 nM Arp2/3 复合物和 25 nM 封端蛋白（或 240 nM gelsolin）。

1. 制备运动反应混合物。肌动蛋白（以及profilin）的确切量取决于步骤3.3中计算的浓度，但代表性反应如下。在冰上按以下顺序混合:3.2 μL MB13、1.5 μL 在 MB13 中稀释的 30 μM 蛋白、1 μL 在 MB13 中稀释的 0.21 μM 封端蛋白或在 MB13 中稀释至 2 μM 的凝胶索林、在 MB13 中稀释的 0.47 μM 的 1 μL Arp2/3 复合物、0.2 μL 珠悬浮液（使用前涡旋）， 和 1.5 μL 肌动蛋白在 30 μM 的 G 缓冲液中。充分但快速混合并启动计时器。
2. 在载玻片上发现整个运动反应混合物。用 18 mm x 18 mm 盖玻片盖住，并使用小画笔用熔化的 VALAP 密封盖玻片。VALAP是羊毛脂，石蜡和凡士林（见 材料表）的混合物，按重量计1:1:1，熔化并搅拌在一起。

6. 显微镜观察

1. 使用配备相衬和/或落射荧光显微镜（GFP立方体，参见材料表）的正置或倒置显微镜上的100倍物镜立即观察运动反应。观察在室温（23-25°C）下进行。
   1. 要获得整个磁珠群的平均位移速度，请通过扫描整个载玻片来记录一段时间内的相衬或荧光静止图像。手动测量彗星长度并绘制与时间的关系图。线性拟合的斜率是平均增长速度。
   2. 要评估单个磁珠的速度，请在相差显微镜中收集延时动画。根据磁珠速度和所需的分辨率，每 1-10 秒拍摄一次帧。使用任何图像处理程序的跟踪工具来获取磁珠速度和轨迹。

结果

在磁珠上可重复地创建肌动蛋白彗星的关键方面之一是轻柔而精确地移液精细的肌动蛋白结合蛋白。生成布拉德福德标准曲线是评估移液技能的好方法。 图1A，B 显示了标准曲线的试管，以及BSA的两种连续稀释液与Bradford试剂混合后的外观示例。注意渐变的蓝色色调（蛋白质浓度越高，溶液越蓝）。当在分光光度计中读取并绘制时，这些解决方案给出了如图 1C所示的标准曲线。为了练习仔细移液，应重复测定，直到线性相关因子为0.999，如图所示。

一旦通过Bradford测定 仔细 评估了商业重悬蛋白的浓度，就可以制备包被的珠子和运动混合物并将其混合在一起。 图2A 显示了彗星形成不同阶段的代表性图像:肌动蛋白云在混合SpVCA包被的磁珠和运动介质后几分钟内形成;云偏振发生在~5分钟，彗星产生在15-20分钟。用落射荧光和相差显微镜可见的肌动蛋白彗星（图2A）继续伸长数小时，但无法保持一致的速度，因此通常在1小时内评估磁珠运动性。另一方面，用VCA包被的磁珠需要30分钟才能获得明亮的肌动蛋白云（图2B），并且没有形成彗星，尽管对称性在1-2小时开始破裂（ 图2B中的箭头）并且云在过夜孵育后显示极化。

图3 显示了在存在封端蛋白的情况下评估磁珠速度的示例。由于所有珠子几乎同时打破对称性，因此在扫描载玻片并随时间拍摄整个彗星群的照片时，会执行"伪延时"记录（图3A）。彗星不解聚;因此，随时间测量的彗星长度的增加可用于计算位移速度（图3B）。凝胶索林可用于代替彗星形成的加帽蛋白，如果添加10倍以上的凝胶索林以补偿其加帽活性降低。在凝胶索林存在下形成的彗星在质量上是相同的，并且移动速度与具有封端蛋白的珠子大致相同（图3C）。封端活性是将聚合集中在磁珠表面的关键，当运动混合物中不包含封端蛋白和凝胶索林时，肌动蛋白云永远不会极化形成彗星，尽管在珠子周围形成明亮的肌动蛋白云（图3D）。珠子上的彗星可用于测量不同生化环境中基于肌动蛋白的力产生，方法是改变运动混合物并使用不同的显微操作技术观察运动结果，例如¹⁵。

图1:布拉德福德标准曲线 。 （A）如何设置用于制作布拉德福德标准曲线的管子的图片。未显示样品管。（B）两次重叠的BSA系列稀释液与Bradford试剂混合的图片。（C）在分光光度计中测量（B）所示溶液在600nm处的吸光度，并绘制为BSA溶液蛋白质浓度的函数。线性拟合用于计算样品浓度。线性拟合的相关因子 R 为 0.999。 请点击此处查看此图的大图。

图 2:SpVCA 涂层磁珠与 VCA 涂层磁珠上的彗星形成。 （A）随时间推移显示的代表性SpVCA包被的磁珠（每个图像中的不同磁珠）。指示从混合时刻开始的时间。肌动蛋白云立即形成，云偏振产生彗星，彗星继续拉长数小时。（B）随时间推移显示的具有代表性的VCA涂层珠子（每个图像中的不同磁珠）。需要超过1小时才能看到肌动蛋白云极化（箭头）的开始，即使长时间孵育也不会产生彗星。所有图像均为直径为4.5μm的磁珠，荧光肌动蛋白的落射荧光成像与（A）中15和20分钟时间点的相差可视化配对，比例尺= 5μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:彗星和珠子速度分析。 （A）和（C）在存在封端蛋白（CP）或凝胶索林的情况下，肌动蛋白云在反应的前20分钟内极化形成彗星，并且彗星随着时间的推移而伸长。为每个图像指示混合时间;每个图像都是一个不同的珠子。磁珠和制备之间存在一些差异，但在这里描述的标准条件下，磁珠平均以微米/亚微米/分钟的速度（0.2-1μm/min）移动。（B）显示彗星长度（整个珠子群）随时间变化的评估的代表性图表。线性相关的斜率对应于平均位移速度，在这种情况下为0.24μm/min。 （D）在没有封端活性（无封端蛋白或凝胶索林）的情况下，肌动蛋白云在珠子周围形成，但不形成彗星。所有图像均为直径为4.5μm的磁珠，荧光肌动蛋白的落射荧光成像，比例尺= 5μm。 请点击此处查看此图的大图。

讨论

此处详述的协议描述了如何使用市售蛋白质在磁珠表面获得肌动蛋白网络生长、彗星形成和磁珠运动。然而，有时彗星不能被重复观测到，或者在载玻片和盖玻片之间不均匀。以下讨论强调了协议中的一些关键点，并提出了一些可以调整的参数。要记住的一个因素是彗星的形成和磁珠速度受到温度的影响，远高于25°C或远低于23°C的温度会对彗星的形成产生负面影响，并提供不可重复的数据。强烈建议使用温控显微镜或在气候控制房间使用显微镜。虽然荧光标记的肌动蛋白通常包含在运动混合物中以通过荧光显微镜观察彗星，但一旦彗星的长度超过磁珠直径，它们也可以通过相衬显微镜看到为珠子旁边的深色涂片。相衬可视化更适合延时成像，因为即使通过旋转盘 ， 也有一些光毒性与荧光成像有关。由于磁珠会随着时间的推移而沉降，因此倒置显微镜产生的水平微珠漂移比正置显微镜少，更适合电影。使用熔融的VALAP密封载玻片很重要，因为指甲油等物质会干扰彗星的形成。大量的VALAP可以在烧杯中制成，然后舀出以重新填充更适合快速熔化的较小烧杯。VALAP在室温下可以保存多年。

另一个关键技术方面是细致的缓冲液和运动混合物制备。制备MB13时应小心，特别是在pH调节步骤中。MB13的pH值应用NaOH迅速调节至中性，以避免ATP水解，但不要太快，因为EGTA在pH值接近中性时溶解。EGTA是一种关键成分，因为它使与肌动蛋白结合的钙络合，在运动混合物中产生更活跃的镁形式¹⁶。MB13准备得太快或太慢都会产生次优彗星的形成，甚至根本没有。另一个关键点是在条件下玩耍时仔细跟踪运动混合物中的KCl浓度。例如，当在反应混合物中使用1x MB13并在MB13中稀释细丝蛋白，加帽蛋白和Arp2 / 3复合物时，由于G缓冲液稀释，运动反应中的最终KCl浓度约为40-50mM。该浓度在彗星测定中提供了最佳结果，任何超过 60 mM KCl 都会降低 Arp2/3 复合物成核活性。

在蛋白质方面，获得肌动蛋白彗星的一个关键技术方面是正确处理商业肌动蛋白结合蛋白，特别是微量的精确移液。Bradford标准曲线的线性是移液的良好测试，该曲线可用于蛋白质浓度的常规测量。事实上，当在彗星手术中使用重悬的商业蛋白时，始终验证蛋白浓度非常重要，因为重悬期间的批次变异性和用户错误会导致实际浓度和预期浓度之间的差异。有时蛋白质浓度的微小差异会导致彗星完全消失。

这里介绍的方法的另一个重要方面是使用蛋白络合的G-肌动蛋白作为聚合的燃料。历史上， 体外 体系使用预聚合的丝状肌动蛋白（F-actin）作为肌动蛋白来源:解聚在散装进料聚合表面^10，17上。这具有控制G-肌动蛋白水平的优点，但增加了一层复杂性，需要额外的成分来催化解聚。由于肌动蛋白网络的周转对于力的产生和运动不是必需的，而力的产生和运动是由磁珠表面的成核和聚合推动的，而肌动蛋白解聚因子如ADF/cofilin作用于远离表面的老化网络¹⁸，大多数基于肌动蛋白的运动的 体外 重建现在无需周转即可简单。然而， 使用 G-肌动蛋白有一些缺点.首先，当使用已经冻干的商业肌动蛋白时，存在低聚物。这里描述的解聚步骤对于获得可重复的结果非常重要。特别是，尽管G缓冲液传统上调节至pH 8，但较低的pH（例如pH 7）在本文描述的测定中似乎效果更好，可能是因为低pH增强了解聚¹⁹。使用G-肌动蛋白的另一个缺点是，一旦置于允许聚合的盐条件下，就会发生自发成核，并且F-肌动蛋白在块状和磁珠表面上形成。将G-肌动蛋白与profilin络合可抑制本体和尖端聚合中的自发成核，从而将成核和倒刺端聚合集中在表面²⁰。Profilin-G-actin在生理学上是相关的，因为细胞中的大部分肌动蛋白都以这种形式存在²¹。这里，使用1:1比例的profilin:actin;然而，较高的比率（例如3:1）更彻底地抑制了本体的聚合，尽管较高的比率也在一定程度上抑制了Arp2/3络合物和倒刺端伸长率^22，23。

封端活性也是彗星形成的关键，因为它确保通过表面激活的Arp2 / 3复合物^24，25的成核循环在表面插入新的肌动蛋白。如果没有封顶，肌动蛋白云不会破坏对称性形成彗星，因为表面的聚合不会产生足够的张力来打破云²⁶。过去，我们使用家庭纯化的重组小鼠加帽蛋白13，但为本文进行的测试表明，市售重组人加帽蛋白与市售的凝胶索林同样有效，尽管必须使用¹⁰倍以上的凝胶索林，并且对于某些应用，它可能不合适，因为它具有肌动蛋白切断活性以及加帽²⁷。

最后，该方法的稳健性在于使用非常活跃的Arp2 / 3复合物激活剂链霉亲和素-pVCA（SpVCA）²⁸。SpVCA 除了 Arp2/3 复合结合结构域外，还包括 WASP 的 profilin-G-actin 结合结构域（p 结构域），因为这被发现在 profilin-G-actin 条件下最有效²⁹。更重要的是，使用链霉亲和素标签，最初引入以允许通过生物素 - 链霉亲和素链接 进行 表面功能化，具有增加Arp2 / 3复合物活化的额外效果，可能是由于链霉亲和素是一种四聚体，因此聚集了激活剂，已知会增加Arp2 / 3复合物活性³⁰.商业生产的SpVCA目前正在开发中，很快就会上市。应该进一步注意的是，尽管通常使用40μL 2μM SpVCA涂覆3 cm² 的珠子表面，但其他涂层浓度（更高和更低）也有效，并且使用这些条件会产生不同的彗星生长速度和形态。事实上，当彗星没有形成或彗星大小在载玻片上不均匀时，应测试不同的涂层条件，以及运动混合物中不同的KCl和profilin浓度。运动混合物中肌动蛋白、Arp2/3复合物和封端蛋白的浓度也可以改变以优化彗星的形成，但在我们手中，改变这些比例往往会产生令人困惑的结果。

总而言之，这里描述的方法在磁珠表面产生肌动蛋白组装和运动性，但可以使用任何可以用SpVCA功能化的表面。在本文所述的吸附不起作用的情况下，链霉亲和素部分可用于在生物素化后将SpVCA附着到目标表面。这样形成的肌动蛋白结构，无论是彗星还是其他，都可用于测试肌动蛋白网络的不同生化和生物物理方面，并且特别适用于使用微量移液器，光学镊子和激光消融进行物理操作¹⁵，²⁶，^31，32。除了对研究界的用途外，这里描述的方法还适合作为本科生物物理学学生研究活性物质概念（如对称性破坏和自组织）的教学工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肌动蛋白、兔肌肉、Alexa Fluor 488 偶联物	Invitrogen （ThermoFisher Scientific）	A12373（最近停产）	该产品可以用 Hypermol 的 ATTO-488 肌动蛋白替代。
肌动蛋白，兔肌肉，ATTO-488	Hypermol	8153
肌动蛋白，兔骨骼肌	骨架	AKL99
Arp2/3 复合物	细胞骨架	RP01P
ATP Sigma		A7699
生物光谱仪，碱性	Eppendorf	035739
Bradford 试剂	Bio-Rad	500-0006
BSA，高质量	Sigma	A3059
BSA 标准品 2 mg/mL（穿孔）	Thermo Scientific	23209
加帽蛋白（a1b2，小鼠重组）	家庭纯化（参考文献 13）		该产品很快将从 Cytoskeleton 上市。
加帽蛋白（a1b2，人重组）	Hypermol	8322
Cube，GFP：U-MNIBA3 或 U-MWB2	Olympus	已停产	可以使用任何适用于所用显微镜的 GFP 立方体。
干块，搅拌：ThermoMixer C（冷冻）	Eppendorf	035963
**，带 SmartBlock，24 微管 2 mL	Eppendorf	035969
凝溶胶蛋白（人重组，His 标记）	细胞骨架	HPG6
羊毛脂	Sigma	49909
微量离心机 5427R + 转子	Eppendorf	934126
显微镜，正置：BX51	Olympus	已停产	任何配备相差光学元件的落射荧光正置显微镜都可以使用。
倒置显微镜：IX70	Olympus	停产	可以使用任何配备相差光学元件的落射荧光倒置显微镜。
石蜡	Sigma	76244
凡士林：凡士林	Sigma	16415
移液器Research Plus	Eppendorf		Gilson 移液器不适用于非常小体积（0.5 &微量;L 等）。
**10 µL		933954
**2.5 µL		933953	这两种尺寸是必不可少的，但建议使用高质量的移液器（例如完整的 Research Plus 套装）。
聚苯乙烯羧酸盐珠	Polysciences
**约 1 µM 直径		08226
**约 4.5 µm 直径		17140-5
Profilin 1（人重组，未标记）	细胞骨架	PR02
SpVCA（人 WASP pVCA 结构域，N 端 His 标签，C 端链霉亲和素标签）	家庭纯化（参考文献 14）		该产品将很快从 Cytoskeleton 上市。
VCA（人 WASP VCA 结构域，GST 标记）	细胞骨架	VCG03