微型计算机断层扫描（µCT）是一种非破坏性成像工具，在临床前研究中对评估骨结构具有重要作用，然而目前在分析骨愈合骨痂的µCT操作流程方面尚缺乏统一共识。本研究提供了一套逐步实施的µCT实验方案，可用于监测骨折愈合过程。
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摘要
摘要
微型计算机断层扫描（µCT）是转化科学研究中用于表征骨折愈合过程中骨组织及新生骨三维（3D）形态最常用的成像方式。啮齿类动物长骨骨折愈合的研究通常涉及继发性愈合以及矿化性骨痂的形成。不同时间点和不同处理条件下，所形成的骨痂形态及其新生骨密度可能存在显著差异。尽管目前已有广泛使用且集成于商业软件中的标准方法用于定量完整皮质骨和小梁骨的参数，但针对愈合骨痂分析的操作流程尚缺乏统一共识。本研究旨在描述一种标准化的定量分析方案，用于测定愈合骨痂中的骨体积分数和骨痂矿化密度。该方案详细说明了成像与分析过程中应考虑的各项参数，包括成像时样本的对齐方式、感兴趣区域的大小，以及用于界定骨痂轮廓的切片数量。
引言
微型计算机断层扫描（µCT）成像已广泛应用于临床前骨研究，可提供无创、高分辨率的图像，用于评估骨的微结构1,2,3,4,5。µCT通过旋转样品，或使用旋转的X射线源和探测器，获取大量X射线图像，并利用算法重建为一系列图像切片形式的三维体数据。临床CT是人体骨骼三维成像的金标准，而µCT是评估实验动物骨愈合效率的常用技术1,2,3,4,6,7。矿化骨组织对X射线具有良好的对比度，而软组织在未使用对比剂的情况下对比度相对较低。在骨折愈合评估中，µCT可生成提供矿化骨痂三维结构和密度详细信息的图像。体内 µCT扫描还可用于骨折愈合过程的纵向、时间序列评估。
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方案
以下方案旨在对安乐死小鼠采集的长骨愈合组织（骨痂）进行表征。然而，其中大部分步骤也可适用于大鼠，并可用于 体内 骨折的扫描。该方案描述了一种特定的 µCT 系统及特定的图像处理、分析和可视化软件（参见 材料清单），但该方法通常适用于其他扫描仪和软件。本方案已获宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。本研究使用的小鼠为16周龄雄性C57BL/6J小鼠（平均体重31.45 ± 3.2 g）。
1. 组织采集与保存
注意：采用合适的鼠类骨折模型。本研究中使用的是中段骨干开放性胫骨骨折模型，具体操作依据文献12,13中所述的标准方案进行。
- 骨折模型实验结束后，通过腹腔注射氯胺酮或赛拉嗪（剂量分别为 500 mg/kg 或 50 mg/kg）处死小鼠。
- 使用剪刀从股骨中段至胫距关节处完整取下骨折骨组织，注意不要扰动骨折部位。去除骨骼周围的肌肉组织，仅保留与骨直接接触并能支撑骨折部位的软组织，以用于后续处理步骤。使用微型直蚊式止血钳取出髓内针。
- 将样本保存在 4 °C 的甲醛溶液中或 -20 °C 的生理盐水中。保存介质的选择取决于后续是否进行微计算机断层....
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结果
为监测骨折愈合过程中的骨形成，对成年雄性C57BL/6J小鼠建立胫骨中段开放性骨折模型。采用髓内钉固定骨折，该模型为继发性愈合的既定模型。13在骨折后第14、21和28天采集愈伤组织12. 这些时间点代表了愈合过程的不同阶段。继发性骨愈合过程中的软骨内成骨进行如下 通过 纤维软骨（软性）骨痂的初期形成，随后在后期阶段发生矿化，以减少骨折间隙的微动，从而促进新生血管跨越骨折线的形成13在本研究采用的小鼠骨折模型中，骨折后第14天代表矿化软性骨痂阶段。随着愈合进程从第14天进展至第21天，矿化软性骨痂被新形成的编织骨完全替代，从而实现骨折间隙的骨性桥接13在第21至28天之间，骨痂经历吸收和重塑过程，以重建皮质骨的特征性结构12.
采用上述方案在三个时间点获取并分析了µCT图像，每个时间点至少分析10个样本。针对每个样本，计算骨体积.......
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讨论
本研究旨在描述一种用于µCT分析的详细方案，目标是对三维矿化骨痂结构进行准确定量，这在骨组织及骨折愈合研究中通常具有基础性意义。该方案采用一种通用的、先进的三维图像分析软件平台，可实现从简单到复杂的图像可视化、分割/标记及各类测量。
该方案中最耗时的步骤是骨痂的半自动分割，需排除皮质骨和骨髓腔区域。许多先前的研究也已排除了该区域9,16,17,18。一些研究在其分析中包含了原始皮质骨和骨髓腔区域19,21，而其他研究中该方法并不明确。包含原始皮质骨可避免对粉碎性骨折皮质骨区域进行轮廓勾画的困难和潜在的主观性，但会高估骨痂矿化程度的测量值。
该方案重点关注获取.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 DK121327（资助R.A.E）和R01 AR071968（资助F.K.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10%中性缓冲福尔马林 | Fisher chemical | SF100-20 | 用于骨组织固定 |
| Avizo | Thermo Scientific | 图像处理与分析软件 | |
| 羟基磷灰石体模 | Micro-CT HA D4.5, QRM | QRM-70128 | |
| 图像处理语言 | Scanco | 用于将原始图像转换为DICOM图像 | |
| 微型直蚊式止血钳 | Medline | 用于取出髓内针 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | 电子表格软件 | |
| Scanco mCT系统（vivaCT 40） | Scanco | 用于µCT成像 |
参考文献
- Rüegsegger, P., Koller, B., Müller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcified Tissue International. 58 (1), 24-29 (1996).
- Müller, R., et al.
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