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方法文章

利用微型计算机断层扫描评估骨骨折愈合

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DOI：

10.3791/64262

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2022年12月9日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, The Pennsylvania State University College of Medicine, 3Department of Pharmacology, The Pennsylvania State University College of Medicine, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

微型计算机断层扫描（µCT）是一种非破坏性成像工具，在临床前研究中对评估骨结构具有重要作用，然而目前在分析骨愈合骨痂的µCT操作流程方面尚缺乏统一共识。本研究提供了一套逐步实施的µCT实验方案，可用于监测骨折愈合过程。

摘要

微型计算机断层扫描（µCT）是转化科学研究中用于表征骨折愈合过程中骨组织及新生骨三维（3D）形态最常用的成像方式。啮齿类动物长骨骨折愈合的研究通常涉及继发性愈合以及矿化性骨痂的形成。不同时间点和不同处理条件下，所形成的骨痂形态及其新生骨密度可能存在显著差异。尽管目前已有广泛使用且集成于商业软件中的标准方法用于定量完整皮质骨和小梁骨的参数，但针对愈合骨痂分析的操作流程尚缺乏统一共识。本研究旨在描述一种标准化的定量分析方案，用于测定愈合骨痂中的骨体积分数和骨痂矿化密度。该方案详细说明了成像与分析过程中应考虑的各项参数，包括成像时样本的对齐方式、感兴趣区域的大小，以及用于界定骨痂轮廓的切片数量。

引言

微型计算机断层扫描（µCT）成像已广泛应用于临床前骨研究，可提供无创、高分辨率的图像，用于评估骨的微结构1,2,3,4,5。µCT通过旋转样品，或使用旋转的X射线源和探测器，获取大量X射线图像，并利用算法重建为一系列图像切片形式的三维体数据。临床CT是人体骨骼三维成像的金标准，而µCT是评估实验动物骨愈合效率的常用技术1,2,3,4,6,7。矿化骨组织对X射线具有良好的对比度，而软组织在未使用对比剂的情况下对比度相对较低。在骨折愈合评估中，µCT可生成提供矿化骨痂三维结构和密度详细信息的图像。体内 µCT扫描还可用于骨折愈合过程的纵向、时间序列评估。

采用µCT对完整皮质骨和松质骨进行定量分析的方法已较为成熟且标准化8。尽管临床前研究中存在多种用于分析骨折愈合的定量方法9,10,11，但目前尚未发表针对骨痂定量的µCT图像分析详细操作流程。因此，本研究旨在提供一套详细的µCT成像及骨愈合骨痂分析的逐步操作方案。

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方案

以下方案旨在对安乐死小鼠采集的长骨愈合组织（骨痂）进行表征。然而，其中大部分步骤也可适用于大鼠，并可用于 体内 骨折的扫描。该方案描述了一种特定的 µCT 系统及特定的图像处理、分析和可视化软件（参见 材料清单），但该方法通常适用于其他扫描仪和软件。本方案已获宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。本研究使用的小鼠为16周龄雄性C57BL/6J小鼠（平均体重31.45 ± 3.2 g）。

1. 组织采集与保存

注意：采用合适的鼠类骨折模型。本研究中使用的是中段骨干开放性胫骨骨折模型，具体操作依据文献12,13中所述的标准方案进行。

  1. 骨折模型实验结束后，通过腹腔注射氯胺酮或赛拉嗪（剂量分别为 500 mg/kg 或 50 mg/kg）处死小鼠。
  2. 使用剪刀从股骨中段至胫距关节处完整取下骨折骨组织，注意不要扰动骨折部位。去除骨骼周围的肌肉组织，仅保留与骨直接接触并能支撑骨折部位的软组织，以用于后续处理步骤。使用微型直蚊式止血钳取出髓内针。
  3. 将样本保存在 4 °C 的甲醛溶液中或 -20 °C 的生理盐水中。保存介质的选择取决于后续是否进行微计算机断层扫描（µCT）分析。本研究中，样本保存于 -20 °C 的生理盐水中。

2. µCT 扫描

  1. 样本制备
    1. 为实现多个样本的同时扫描，将最多六个样本放入定制开发的3D打印扫描夹具（图1 A,B）或类似装置中。同时扫描可减少扫描时间和成本。本研究中使用的定制夹具包含六个用于固定长骨样本的插槽，以及一个用于放置羟基磷灰石（HA）体模的中心孔（图1A,B；材料表）。
      注：HA体模将在第4.2步（见下文）中作为标准，用于将µCT单位（通常为Hounsfield单位）转换为HA密度（mgHA/ccm）。
    2. 将准备好的夹具放入与视野（FOV）直径相近的注射器或锥形管中（图1C）。本研究中使用了直径为20 mm的注射器，以匹配21.5 mm的视野。
    3. 为防止样本在扫描过程中干燥，向注射器或锥形管中加入步骤1.3中使用的保存液（本研究中使用生理盐水）。
  2. 扫描
    1. 扫描前，确认µCT设备已校准：将HA体模置于µCT视野（FOV）的中心线上，扫描该体模并测量其HA密度。确保测得的密度与制造商提供的密度一致。
    2. 将样本夹具的中心线与µCT视野的大致中心线对齐。这可确保样本位于视野范围内，且其长轴方向与所得图像的轴向基本一致。
      注：这种标准化的取向后续有助于减少分析过程中的变异性，例如在感兴趣体积内所考虑组织量方面的差异。
    3. 设置µCT系统的扫描参数（材料表）。本研究使用的参数为：10.5 µm（各向同性体素尺寸）、55 kVp（能量/强度）、145 µA（电流）和300 ms（积分时间）。根据小鼠骨小梁的大致厚度（20–60 µm）8确定体素尺寸。通过不同视角观察扫描图像，确保覆盖所有骨痂样本的完整体积。

羟基磷灰石（HA）模体扫描夹具、实验装置、示意图、生物医学研究。
图 1：定制扫描夹具的结构。（A）扫描夹具的图像（上图），显示六个样品槽，以及羟基磷灰石（HA）模体（下图）。（B）显示长骨样品（上图）和置于专用槽位中的羟基磷灰石（HA）模体（下图）的图像。（C）显示将扫描夹具放入20 mm注射器中的图像。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 图像分割

注意：原始图像将自动重建为图像序列数据。

  1. 图像转换：使用图像处理软件（参见材料表）将重建的图像序列数据转换为DICOM图像序列。将DICOM图像序列导入软件（参见材料表）中，用于图像处理、分析和可视化（图2A）。
  2. 图像裁剪：逐个样本对每幅图像堆栈进行裁剪，确保裁剪后的体积包含整个样本（图2B）。保存裁剪后的图像：单击屏幕左上角的文件 选项卡，选择保存项目，然后从屏幕上显示的选项中选择最小化项目大小 。文件将以商业软件格式保存。
  3. 图像去噪：采用滤波方法降低噪声水平并避免模糊，操作如下。
    1. 单击文件 选项卡，使用打开数据选择待处理的图像。打开的图像将显示在屏幕左上角的项目视图窗口中。
    2. 右键单击，选择图像处理，然后选择滤波沙盒。单击创建。
    3. 在属性窗口（位于屏幕左下角）中执行以下操作：选择数据 作为预览类型；从“滤波器”旁边的下拉菜单中选择滤波器类型；选择3D 作为解释模式；从“核类型”旁边的下拉菜单中选择可分离；在各自对应的空白框中填写标准差和核大小因子的数值；从“输出”旁边的下拉菜单中选择与输入相同；单击应用。
      注：滤波器类型（可选类型包括双边、方框、高斯、中值、递归指数、轮廓提取、各向异性扩散、非局部均值、非锐化掩模和FFT滤波器）及参数的选择取决于扫描图像的噪声水平和体素大小。对于高斯滤波器，核大小因子通常使用3 × 3 × 3和5 × 5 × 5，标准差通常使用0.5–2.08。本研究中采用了高斯滤波器，核大小因子和标准差分别设置为5 × 5 × 5和0.8。
  4. 图像重对齐
    注：此为可选步骤。在扫描过程中，若长骨样本相对于成像系统的坐标轴发生错位，可采用数字对齐方法校正错位（图2C）。
    1. 创建样本的三维渲染图像，操作如下：在项目视图窗口中选择步骤3.3生成的已滤波且已裁剪的图像。右键单击，从下拉菜单中选择显示 ，然后选择体绘制，再单击创建。在矢状面和冠状面中目视检查三维渲染图像。
    2. 手动旋转渲染体积，使纵向轴对齐良好。对旋转后的图像应用变换，操作如下：在属性窗口中单击变换编辑器，进入变换编辑器-操作器，从下拉菜单中选择变换器 。此时可对样本进行旋转和重新对齐。完成重对齐后，再次单击变换编辑器以锁定图像。
    3. 对滤波后的图像（步骤3.3生成）进行重采样，以生成新的横断面（轴向）图像切片，操作如下：在项目视图窗口中选择步骤3.4.2生成的图像。右键单击，从下拉菜单中选择几何变换，然后选择重采样变换图像，再单击创建。在属性窗口中，进入数据 部分并执行以下操作：插值方式选择下拉菜单中的标准 ；模式选择扩展；保留选项选择体素大小；在“填充值”对应的空白框中输入0。然后单击应用。
  5. 定义感兴趣体积（VOI）
    1. 浏览横断面图像切片，确定骨折骨痂的中心层面。根据骨痂的近端和远端定义VOI。当骨痂端点难以界定时，可根据距骨痂中心层面标准化的距离来定义VOI（图2D）。
      注：在骨重塑阶段之前的愈合期，由于新生编织骨的小梁结构与原始骨的皮质结构明显不同，因此矿化骨痂边缘较易界定。然而，当进入重塑阶段后，新生骨逐渐获得皮质结构，因此界定骨痂边缘变得越来越具挑战性。

骨成像分析；CT扫描切片；显示三维重建与对齐过程的示意图。
图2：图像分割。（A）一幅显示单次扫描中六个样本的图像。（B）图像裁剪以分离各个样本。（C）数字对齐以校正偏离的纵向轴（黄色虚线）。（D）定义感兴趣体积（VOI）及骨痂中心平面。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 图像分析

  1. 骨痂与皮质骨的分割
    1. 使用分割套索工具，结合自动追踪和边缘追踪功能，半自动勾勒出愈伤组织的外边界图3A如下所示：
      1. 图像重组完成后（步骤 3.4.3），单击 分割 在屏幕顶部的第二行标签中，点击相应标签。在分割编辑器窗口中，从“图像”旁边的下拉菜单中选择一幅已变换的图像（在步骤 3.4.3 中创建）。
      2. 在“材料”窗口中，双击 添加；执行此操作后，将出现名为 material3 和 material4 的两个标签页。右键单击，将 material3 重命名为 callus，将 material4 重命名为 cortical bone。
      3. 在“选择”窗口中，单击套索图标；从出现的选项中选择 徒手操作 对于2D模式， 内部 3D 模式，以及两者 自动追踪 和 追踪边缘 选择选项。使用套索工具标记感兴趣区域。
    2. 在VOI范围内选取多个切片，重复此勾画步骤图3B）。可将轮廓切片间隔一定距离排列（例如，间隔20个切片）。
      注意：在具有复杂愈伤组织结构的区域，用户可考虑减小轮廓切片之间的间距，以捕获更多片段图 3A，B).
    3. 对轮廓化的骨痂轮廓进行插值，以生成完整的骨痂标签（图 3C，D）操作如下：在“材料”窗口中，选择愈伤组织文件（于步骤4.1.1.2中创建），单击 选择 屏幕顶部的标签，然后选择 插值 从下拉菜单中选择。在“选择”窗口中，点击 加号.
    4. 打开 皮质骨 在步骤 4.1.1.2 中创建的文件。按照步骤 4.1.1 和 4.1.2 中对骨痂的处理方法，对皮质骨（包括骨髓腔）进行分割。图 4A，B）。参照步骤 4.1.3 中对骨痂的处理方法，对轮廓化的骨膜皮质进行插值，以创建皮质骨标签（图4C，D).
    5. 按如下步骤计算骨痂的轮廓体积和平均灰度值：点击 分割 屏幕顶部一行的标签并选择 材料统计学 从下拉菜单中选择。这将生成一个包含所有计算值的表格，其中皮质骨和骨痂（扣除皮质骨后）的数值将分别列出。表格生成后，点击 导出到工作区 以保存数据。
  2. 灰度单位转换为骨密度
    1. 裁剪4.5 mm HA模体的3D图像（图2B) 从整张图像中选取并单击 分割. HA 模体的树脂中包含五个小型 HA 圆柱体（图1A）。对于密度最高的 HA 圆柱体，通过视觉检查确定其第一层和最后一层切片。
    2. 使用画笔工具在第一张和最后一张切片上（避开边缘）绘制两个圆圈图 5A）如下所述：在“材料”窗口中，点击 添加 四次。右键单击，将 material3、material4、material5 和 material6 分别重命名为 phantom1、phantom2、phantom3 和 phantom4。选择 幻影1单击“选择”窗口中的画笔图标，并使用滑块根据模体的大小调整画笔尺寸（圆形描迹），使圆的直径小于模体的尺寸。
    3. 在两个圆之间应用插值，以生成每个 HA 圆柱体的体积图5B）如下所述：在“材料”窗口中，选择 Phantom1，点击 选择 屏幕顶部一行的标签，从下拉菜单中选择插值。在“选择”窗口中，单击 加号.
    4. 对剩余的三个HA圆柱体重复分割过程，顺序从第二高的HA密度开始，到第二低的HA密度结束（图 5B). 可排除HA密度最低的圆柱体，因其通常难以分割。
    5. 使用生成的三维标签计算所分析的四个 HA 圆柱体的平均灰度值。使用电子表格（参见 材料表）或类似设备，绘制模体制造商提供的平均灰度值与相应的骨密度（BMD）值。利用线性回归生成BMD与灰度值之间的相关性方程。
  3. 矿化骨痂的分割及骨密度（BMD）计算
    1. 根据步骤 4.2.5 中生成的相关方程以及用于区分矿化和未矿化骨痂的选定阈值，确定相应的灰度值阈值。据此，将灰度值高于该阈值的骨痂区域标记为矿化骨痂，其余部分标记为未矿化骨痂图6A，B在此项研究中，250 mgHA/ccm 被用作矿化骨痂的阈值14,15.
    2. 计算总骨痂体积和矿化骨痂体积。根据这些数值，计算骨体积分数（矿化骨痂体积与总骨痂体积的比值，即 BV/TV）。利用测得的总骨痂平均灰度值，结合步骤 4.2.5 中建立的相关方程，计算骨痂的骨密度（BMD）。
      注意：根据研究目的及所用分析软件，可计算其他参数，如结构模型指数（SMI）、小梁厚度和各向异性程度。

CT扫描分析；骨结构的3D模型；表示分割与重建的示意图。
图3：骨痂外边界的分割。（A）骨痂外边界的轮廓（红线）。（B）在感兴趣体积（VOI）内采样切片上的轮廓（红片）。（C）通过插值得到的三维骨痂标签（红色体积）。（D）C中所示骨痂标签的横截面（包含皮质骨）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示分割后三维结构的断层扫描分析示意图；数据可视化与分割结果。
图 4：皮质骨的分割。（A）皮质骨骨外膜表面的轮廓（绿色线条）。（B）在感兴趣体积（VOI）内采样切片处的轮廓（绿色切片）。（C）由骨外膜皮质骨和骨痂插值标签生成的皮质骨（包含骨髓腔；绿色）与骨痂（红色）的三维标签。（D）骨痂（红色）与皮质骨（包含髓腔；绿色）的横截面。请点击此处查看此图的放大版本。

CT 扫描切片和三维模型示意图，展示使用成像软件工具的分割过程。
图 5：灰度单位转换为骨密度（BMD）。（A）第一层和最后一层切片中羟基磷灰石（HA）圆柱体的轮廓（红色圆圈）。（B）三维插值重建的 HA 圆柱体（左）及其横截面（右）。棕色：最高 HA 密度；蓝色：第二高 HA 密度；紫色：第三高 HA 密度；绿色：第四高 HA 密度。请点击此处查看该图的高清版本。

骨愈合过程；三维CT扫描；矿化骨痂（蓝色），原始骨组织（绿色）；结构分析。
图6：矿化骨痂的分割。（A）矿化骨痂（≥250 mgHA/ccm）以蓝色显示，其余骨痂部分（<250 mgHA/ccm）以红色显示，对应原始骨组织的空间以绿色显示。（B）各独立标签的三维视图。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

为监测骨折愈合过程中的骨形成，对成年雄性C57BL/6J小鼠建立胫骨中段开放性骨折模型。采用髓内钉固定骨折，该模型为继发性愈合的既定模型。13在骨折后第14、21和28天采集愈伤组织12. 这些时间点代表了愈合过程的不同阶段。继发性骨愈合过程中的软骨内成骨进行如下 通过 纤维软骨（软性）骨痂的初期形成，随后在后期阶段发生矿化，以减少骨折间隙的微动，从而促进新生血管跨越骨折线的形成13在本研究采用的小鼠骨折模型中，骨折后第14天代表矿化软性骨痂阶段。随着愈合进程从第14天进展至第21天，矿化软性骨痂被新形成的编织骨完全替代，从而实现骨折间隙的骨性桥接13在第21至28天之间，骨痂经历吸收和重塑过程，以重建皮质骨的特征性结构12.

采用上述方案在三个时间点获取并分析了µCT图像，每个时间点至少分析10个样本。针对每个样本，计算骨体积...

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讨论

本研究旨在描述一种用于µCT分析的详细方案，目标是对三维矿化骨痂结构进行准确定量，这在骨组织及骨折愈合研究中通常具有基础性意义。该方案采用一种通用的、先进的三维图像分析软件平台，可实现从简单到复杂的图像可视化、分割/标记及各类测量。

该方案中最耗时的步骤是骨痂的半自动分割，需排除皮质骨和骨髓腔区域。许多先前的研究也已排除了该区域9,16,17,18。一些研究在其分析中包含了原始皮质骨和骨髓腔区域19,21，而其他研究中该方法并不明确。包含原始皮质骨可避免对粉碎性骨折皮质骨区域进行轮廓勾画的困难和潜在的主观性，但会高估骨痂矿化程度的测量值。

该方案重点关注获取...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 DK121327（资助R.A.E）和R01 AR071968（资助F.K.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10%中性缓冲福尔马林 Fisher chemicalSF100-20用于骨组织固定
AvizoThermo Scientific图像处理与分析软件
羟基磷灰石体模 Micro-CT HA D4.5, QRMQRM-70128
图像处理语言Scanco用于将原始图像转换为DICOM图像
微型直蚊式止血钳Medline用于取出髓内针 
Microsoft ExcelMicrosoft电子表格软件
Scanco mCT系统（vivaCT 40）Scanco用于µCT成像 

参考文献

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