人诱导多能干细胞衍生心肌细胞中微电极阵列与膜片钳记录的技术应用

摘要

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种有前景的 体外 用于药物诱导心脏毒性筛选和疾病建模。本文中，我们详细描述了一种测量人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）收缩力和电生理特性的实验方案。

摘要

药物诱导的心脏毒性是导致药物研发失败和撤市的主要原因。因此，在药物开发过程中采用适当的临床前心脏安全性评价模型至关重要。目前，心脏安全性评价仍高度依赖动物实验。然而，由于物种间差异，特别是心脏电生理特性的种属特异性，动物模型在向人类转化时存在特异性差的问题。因此，迫切需要建立一种可靠、高效且基于人类细胞的临床前心脏安全性评价模型。人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种极具价值的 体外 用于药物诱导心脏毒性筛选和疾病建模的模型。hiPSC-CMs 可从具有不同遗传背景和多种疾病状态的个体中获得，使其成为评估个体化药物诱导心脏毒性的理想替代模型。因此，亟需建立全面研究 hiPSC-CMs 功能特性的方法体系。在本方案中，我们详细描述了可在 hiPSC-CMs 上进行的多种功能检测，包括收缩力、场电位、动作电位和钙处理能力的测量。总体而言，将 hiPSC-CMs 应用于临床前心脏安全性评估，有望彻底改变药物研发模式。

引言

药物研发是一个漫长且昂贵的过程。一项针对2009年至2018年间获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的新治疗药物的研究报告指出，每种产品的资本化研发和临床试验的估计中位成本为9.85亿美元¹。药物诱导的心脏毒性是导致药物研发失败和撤市的首要原因²。值得注意的是，多种类别的治疗药物均被报道可引发心脏毒性³。因此，心脏安全性评估是药物研发过程中的关键环节。目前心脏安全性评估的范式仍高度依赖动物模型。然而，使用动物模型所带来的物种差异正日益被视为对人类患者药物诱导心脏毒性预测不准确的主要原因⁴。例如，由于复极化电流的差异，人类与小鼠之间的心肌动作电位形态存在显著不同⁵。此外，不同物种间心脏肌球蛋白和可影响心脏生理功能的环状RNA的差异性亚型已有充分文献记录^6,7。为弥补这些差距，迫切需要建立一种可靠、高效且基于人类的模型，用于临床前心脏安全性评估。

诱导性多能干细胞（iPSC）技术的突破性发明，为药物筛选和疾病建模提供了前所未有的平台。在过去十年中，生成人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的方法已日趋成熟^8,9。hiPSC-CMs 因其在疾病建模、药物诱导心脏毒性筛选以及精准医学中的潜在应用而受到广泛关注。例如，hiPSC-CMs 已被用于模拟由遗传因素引起的心脏疾病的病理表型，如长QT综合征¹⁰、肥厚型心肌病^11,12和扩张型心肌病^13,14,15。由此，研究人员已鉴定出参与心脏疾病发病机制的关键信号通路，为开发有效的治疗策略提供了线索。此外，hiPSC-CMs 还被用于筛选与抗癌药物相关的心脏毒性，包括阿霉素、曲妥珠单抗和酪氨酸激酶抑制剂^16,17,18；目前，减轻此类心脏毒性的策略正在研究中。最后，hiPSC-CMs 中保留的遗传信息使得在个体和群体水平上对药物诱导心脏毒性进行筛查和预测成为可能^19,20。综上所述，hiPSC-CMs 已被证实是个性化心脏安全性预测中不可或缺的工具。

本方案的总体目标是建立一套全面且高效的方法，用于研究hiPSC-CMs的功能特性，这对于将hiPSC-CMs应用于疾病建模、药物诱导的心脏毒性筛选以及精准医学具有重要意义。本文详细介绍了多种功能检测方法，用于评估hiPSC-CMs的功能特性，包括收缩力、场电位、动作电位以及钙离子（Ca²⁺）处理能力的测定（图1）。

方案

1. 培养基与溶液的制备

1. 通过将一管10 mL的50倍浓缩B27添加剂与500 mL RPMI 1640培养基混合，配制hiPSC-CM维持培养基。将培养基储存在4 °C，一个月内使用。使用前平衡至室温（RT）。
2. 通过将20 mL血清替代物与180 mL hiPSC-CM维持培养基混合（10%稀释，v/v），配制hiPSC-CM接种培养基。建议使用新鲜配制的接种培养基，但可在4 °C储存不超过2周。使用前平衡至室温（RT）。
3. 通过在4 °C过夜解冻一管（10 mL）基底膜基质，并将其分装为每管500 µL至无菌1.5 mL离心管中，制备细胞外基质包被溶液。储存于-20 °C以备后续使用。将500 µL基底膜基质与100 mL冰冻的DMEM/F12培养基混合（1:200稀释，v/v），制成基底膜基质包被溶液。
4. 配制50 mL Tyrode溶液，其中含135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl₂、1.8 mM CaCl₂、5 mM葡萄糖和10 mM HEPES。用NaOH调节pH至7.4。实验当天新鲜配制Tyrode溶液。
5. 配制50 mL细胞内移液管溶液，其中含120 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM EGTA和10 mM HEPES。用KOH调节pH至7.2。将细胞内移液管溶液分装至无菌5 mL离心管中，储存在-20 °C。实验当天，新鲜加入MgATP至终浓度为3 mM。
6. 配制1 mL Fura-2 AM负载溶液，其中含2 µM Fura-2 AM和0.1% Pluronic F-127。实验当天新鲜配制负载溶液，并避光保存。

2. hiPSC-CM 收缩运动的测量

1. 通过向96孔板的每个孔中加入100 µL细胞外基质包被液，制备基底膜基质包被的培养板。将96孔板置于37 °C、5% CO₂的加湿细胞培养箱中孵育过夜。
2. hiPSC-CMs的酶解离
   1. 从斯坦福心血管研究所iPSC生物样本库 (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html)申请获取hiPSCs。根据先前发表的研究方法^8,9诱导生成hiPSC-CMs。在10倍显微镜下观察六孔板中培养的hiPSC-CMs。
      注意：当细胞仍处于增殖状态时，不要进行解离。否则，传代后细胞将在孔中过度生长，导致功能检测结果不准确。通常hiPSC-CMs在培养第18–23天时停止增殖。
   2. 确保hiPSC-CMs搏动强烈，且纯度超过95%。通过针对心肌细胞特异性标志物——心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T）的免疫染色评估细胞纯度^8,9。
   3. 吸除维持培养基，用1× DPBS洗涤细胞两次。向六孔板的每个孔中加入1 mL细胞解离液，于37 °C孵育10分钟。
      注意：应定期监测孵育时间。避免过度消化，以免降低细胞活力。
   4. 使用5 mL移液器轻柔地将hiPSC-CMs上下吹打数次，以获得单细胞悬液。加入等体积的hiPSC-CMs接种培养基以中和细胞解离液。
   5. 在室温下以300 × g离心3分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1–2 mL hiPSC-CMs接种培养基中。
   6. 采用台盼蓝排斥法测定细胞密度和活力。简要步骤如下：将10 µL细胞悬液与等体积台盼蓝混合，转移至细胞计数板，然后使用细胞计数仪进行计数，具体操作如前所述²¹。
3. 接种hiPSC-CMs
   1. 从96孔板中移除细胞外基质包被液。
   2. 在100 µL hiPSC-CMs接种培养基中每孔接种50,000个细胞，并将96孔板置于37 °C、5% CO₂的加湿细胞培养箱中孵育过夜。
   3. 接种后1天，将hiPSC-CMs接种培养基更换为100 µL hiPSC-CMs维持培养基。此后每2天更换一次维持培养基，直至开始记录数据。
4. 数据采集
   1. 建议在接种后至少10天测量hiPSC-CMs的收缩运动。
   2. 打开温控装置，将目标温度设为37 °C。开启显微镜、相机和CO₂供气系统。
   3. 向载板架的水夹层中加入适量无菌去离子水（图2A）。将96孔板放置于载板架上，使细胞适应环境至少5分钟。
   4. 打开成像软件，将相机帧率设置为每秒75帧（fps），视频/图像分辨率为1024 × 1024像素。启用自动对焦和自动亮度功能，记录hiPSC-CMs的视频和图像。
      注意：记录过程中避免显微镜台面振动。
   5. 打开分析软件以进行自动分析。

3. hiPSC-CM 场电位的测量

1. 基底膜基质包被板的制备
   1. 在每孔48孔微电极阵列（MEA）板的记录电极区域上方，小心滴加8 µL细胞外基质包被溶液。参见 图3A 选择合适的电极区域放置液滴。此步骤对于保持hiPSC-CM单层集中在电极上至关重要。任何情况下均应避免触碰电极。
   2. 向孔周围的区域加入 3 mL 无菌去离子水（图3A以防止48孔MEA板中的包被溶液蒸发。将48孔MEA板置于37 °C、5% CO₂的湿化细胞培养孵箱中孵育₂ 45–60 分钟。
      注意：孵育时间不宜过长，以防止基底膜基质干燥。
2. 按照第2.2步所述进行hiPSC-CMs的酶解离。
3. 接种 hiPSC-CMs
   1. 使用200 µL枪头，在同一行或列中，小心移除孔表面大部分的细胞外基质培养基，避免触碰电极。
   2. 在每孔同一行或列的记录电极区域，用8 µL hiPSC-CM接种培养基将50,000个细胞接种至每孔。
   3. 重复最后两个步骤，直至所有孔均已接种细胞。在显微镜下检查，确认所有孔中均含有hiPSC-CM悬液。关于所需密度，请参见 图3B.
      注意：如果基底膜基质完全干燥，将影响 hiPSC-CMs 的贴附，导致细胞贴附效果不理想。
   4. 将48孔MEA板置于37 °C、5% CO₂的湿化细胞培养孵育箱中孵育₂ 60 分钟。
   5. 缓慢而轻柔地向48孔MEA板的每孔中加入150 µL hiPSC-CM接种培养基。为避免分散先前已接种的hiPSC-CM，在加液时将培养板倾斜至45°角，将移液器枪头靠在每孔的孔壁上，缓慢释放培养基。
      注意：加入培养基时速度过快或压力过高会导致贴壁的心肌细胞脱落。避免与hiPSC-CM悬液滴直接接触。
   6. 将48孔MEA板置于37 °C、5% CO₂的湿化细胞培养孵育箱中孵育₂ 过夜。
   7. 接种后1天，用300 µL hiPSC-CM维持培养基更换hiPSC-CM接种培养基。记录前每2天更换一次hiPSC-CM维持培养基。
4. 数据采集
   1. 接种后至少10天进行MEA检测（推荐）。接种后第10天，在10倍显微镜下观察自发搏动的hiPSC-CM单层细胞的密度，应如图所示 图3C.
   2. 将48孔MEA板放入记录仪器中。触摸屏可用于监测温度（37 °C）和CO₂ (5%) 状态。
   3. 打开导航器软件。在实验设置窗口中，选择 心脏实时构型与场电位记录应用自发性或起搏控制的搏动模式。
   4. 在搏动检测参数中，将检测阈值设为 300 µV，最小搏动周期设为 250 ms，最大搏动周期设为 5 s。选择 多项式回归 用于场电位持续时间（FPD）的计算。
   5. 检查基线电活动信号是否成熟且稳定。
      注意：多孔MEA板中每个电极记录到的成熟波形必须反映出具有清晰可辨特征的心脏场电位，这些特征应与心肌去极化峰和复极化相位相对应，如图所示 图3D- F.
   6. 记录基线心肌活动1-3分钟。如需药物处理，在记录基线后向孔中加入化合物。将培养板置于培养箱中孵育至少30分钟，再进行下一次记录。

4. 人诱导多能干细胞衍生心肌细胞动作电位的测量

1. 通过将500 µL细胞外基质包被液加入35 mm玻璃底培养皿的玻璃底部区域，制备基底膜基质包被培养皿（图 4A）。将35 mm培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿润化细胞培养孵育箱中孵育₂ 过夜。
2. 按照步骤2.2所述进行hiPSC-CMs的酶解离。
3. 接种 hiPSC-CMs
   1. 从35 mm培养皿中移除细胞外基质包被溶液。在35 mm培养皿的玻璃底部分，每孔加入500 µL hiPSC-CM接种培养基，接种50,000个细胞。
   2. 将35 mm培养皿置于37 °C、5% CO₂的湿润化细胞培养孵育箱中孵育₂ 过夜。移除hiPSC-CM接种培养基，向35 mm培养皿中加入2 mL hiPSC-CM维持培养基。
      注意：建议在2 mL吸液移液管上套一个200 µL非滤芯吸头，以去除废弃培养基，避免接触细胞。
   3. 每2天更换一次hiPSC-CM培养基，然后再进行记录。
4. 数据采集
   1. 至少在铺板后10天进行动作电位测量（推荐）。按照步骤1.4所述配制新鲜的Tyrode溶液。解冻一份细胞内电极溶液，并新鲜加入MgATP至终浓度为3 mM。
   2. 使用显微拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制显微移液管。
      注意：微电极的电阻宜为 2-5 MΩ。
   3. 将hiPSC-CM维持培养基更换为Tyrode's溶液，使细胞在Tyrode's溶液中适应15分钟图4C）。将温度传感器插入腔室中，将35 mm培养皿按图示放入腔室 图4C，并将温度调节至 37 °C（图 4D).
   4. 用细胞内液填充微量移液管，并将其插入连接至膜片钳放大器头级的电极架中图4E）。打开刺激/采集软件，加载动作电位记录程序，并选择电压钳制模式。
   5. 将微移液管插入浴液中，选择合适的单个hiPSC-CMs，使用显微操作器调节并降低微移液管的位置，使其靠近选定的细胞。当移液管尖端插入浴液时，通过示波器显示器观察移液管电阻。
   6. 将移液管靠近细胞，电流脉冲会略微减小，以反映封接电阻的增加。施加轻柔的负压吸力以进一步提高电阻，从而形成吉欧封接（gigaseal）。继续施加 密封 功能
   7. 施加额外负压以击穿膜，获得全细胞记录构型。一旦吸破移液管尖端区域内的膜，细胞内液即与细胞胞质达到平衡。此时，通过放大器对话框从电压钳模式（V-clamp）切换至电流钳模式或零电流注入模式（C-Clamp）。按下 记录 单击按钮以生成并保存动作电位记录文件。
      注意：模式切换可连续记录hiPSC-CMs的自发性动作电位 通过 无触发无刺激记录程序，可通过膜片钳放大器的V-mon输出进行监测。

5. hiPSC-CM 钙离子的测量²⁺ 瞬时的

1. 参见先前的实验方案，制备用于 Ca²⁺ 成像的定制化细胞培养室²¹。对于基底膜基质包被的细胞培养室，向细胞培养室中加入 200 µL 细胞外基质包被液。将细胞培养室置于 37 °C、5% CO₂ 的加湿细胞培养箱中孵育过夜。
2. 按照步骤 2.2 所述方法对 hiPSC-CMs 进行酶解离散。
3. 接种 hiPSC-CMs
   1. 从细胞培养室中移除细胞外基质包被液。每孔加入 200 µL hiPSC-CM 接种培养基，接种 20,000 个细胞。
   2. 接种后 1 天，将 hiPSC-CM 接种培养基更换为 200 µL hiPSC-CM 维持培养基。记录前每 2 天更换一次维持培养基。
4. 数据采集
   1. 建议在接种后至少 10 天进行 Ca²⁺ 瞬变测量。按照步骤 1.4 所述配制新鲜的台氏液。按照步骤 1.6 所述配制新鲜的 Fura-2 AM 负载溶液。
   2. 吸除 hiPSC-CM 维持培养基，用台氏液洗涤两次。加入 100 µL Fura-2 AM 负载溶液，在室温下孵育 10 分钟。
   3. 将 Fura-2 AM 负载溶液替换为台氏液，静置至少 5 分钟，以确保 Fura-2 AM 完全去酯化。
   4. 在配备 40 倍油浸物镜（0.95 NA）的倒置落射荧光显微镜的 40 倍物镜上滴加一滴浸油。将细胞培养室置于显微镜载物台适配器中（图 5A）。
   5. 将温度控制器导线连接至灌流室，并设定为 37 °C。安装电场刺激电极，设置脉冲频率为 0.5 Hz，脉冲持续时间为 20 ms。
   6. 打开超高速波长切换光源，根据仪器说明书将其设置为 340 nm 和 380 nm 的快速切换模式。
   7. 在软件中设置两个波长的曝光时间为 20 ms，记录时间为 20 s。记录反映 hiPSC-CMs 中 Ca²⁺ 瞬变实时变化的视频。将数据导出至电子表格，并按照先前所述方法进行分析²³。

结果

本方案描述了如何测量hiPSC-CMs的收缩运动、场电位、动作电位以及Ca²⁺瞬变。图中展示了包括酶消化、细胞接种、维持培养和功能检测在内的示意图（图1）。hiPSC-CMs单层的形成是进行收缩运动测量的必要条件（图2B）。hiPSC-CMs收缩-舒张运动的代表性轨迹如（图2C）所示。分析软件可通过默认设置自动识别收缩起始点、收缩峰值点、收缩终止点、舒张峰值点和舒张终止点，从而实现对收缩-舒张运动轨迹的自动化分析（图2D）。收缩与舒张峰值的速度可用于评估hiPSC-CMs的收缩和舒张能力。此外，还可获得收缩和舒张过程中的形变距离。

MEA 检测是一种细胞外记录动作电位（即场电位）的方法。成功测量场电位需要在 MEA 板每孔内的所有电极上，hiPSC-CM 单层细胞完全覆盖图3C

讨论

人类诱导多能干细胞（iPSC）技术已成为疾病建模和药物筛选的强大平台。本文中，我们描述了一种详细的实验方案，用于测量hiPSC-CM的收缩力、场电位、动作电位以及Ca²⁺瞬变。该方案可对hiPSC-CM的收缩功能和电生理特性进行全面表征。这些功能性检测方法已在本课题组的多项研究中得到应用^{12,13,18,24,25,26,27}。

必须使用搏动状态良好的hiPSC-CMs，否则检测信号的信噪比将显著下降。此外，建议在测量前确保hiPSC-CMs具有高纯度。非心肌细胞的存在尤其会影响收缩运动和场电位测量的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿，带 20 mm 微孔，#1.5 盖玻片	Cellvis	D35-20-1.5-N	膜片钳
50x B27添加剂	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM 培养基
6孔培养板	E & K Scientific	EK-27160	hiPSC-CM 培养
96孔平底透明黑色聚苯乙烯TC处理微孔板	康宁	3603	收缩运动测量
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	酶解离
Axion集成工作室（AxIS）	Axion Biosystems		导航软件
硼硅酸盐玻璃毛细管	哈佛仪器	BF 100-50-10	膜片钳
CaCl2 1 M H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode’s 溶液
细胞计数板载玻片	赛默飞世尔科技	C10228	细胞计数
CytoView 48孔MEA板	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	多电极阵列
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	细胞外基质培养基
不含钙、镁的DPBS	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	细胞内移液管溶液
EPC 10 USB 膜片钳放大器	Warner Instruments	89-5000	膜片钳
Fura-2 AM，细胞通透性	赛默飞世尔科技	F1221	Ca2+ 瞬态测量
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode’s 溶液
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode’溶液
hiPSCs	斯坦福心血管研究所iPSC生物样本库
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode’s 溶液
KnockOut血清替代物	赛默飞世尔科技	10828-028	hiPSC-CM 接种培养基
KOH 8 M	Sigma-Aldrich	P4494	细胞内移液管溶液
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ 瞬态测量；超高速波长切换光源
Luna-FL 全自动荧光细胞计数仪	WISBIOMED	LB-L20001	细胞计数
Maestro Pro MEA系统	Axion Biosystems		多电极阵列
基底膜基质（生长因子减少型 Matrigel GFR）	康宁	356231	细胞外基质培养基
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	细胞内移液管溶液
MgCl₂2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode’s 溶液
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode’s 溶液
NaOH 10 M	Sigma-Aldrich	72068	Tyrode’s 溶液
NIS 元素 AR
Pluronic F-127（DMSO 中 20% 溶液）	赛默飞世尔科技	P3000MP	Ca2+ 瞬态测量
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11875-119	hiPSC-CM 培养基
索尼 SI8000 细胞运动成像系统	索尼生物技术		收缩运动测量
Sutter 微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	P-97	膜片钳
台盼蓝染色	Life Technologies	T10282	细胞计数