微电极阵列和膜片钳记录在人诱导多能干细胞来源心肌细胞上的技术应用

Summary

人诱导的多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为药物诱导的心脏毒性筛查和疾病建模的有前途的 体外 模型。在这里，我们详细介绍了用于测量hiPSC-CMs的收缩力和电生理学的方案。

Abstract

药物引起的心脏毒性是药物损耗和退出市场的主要原因。因此，使用适当的临床前心脏安全性评估模型是药物开发过程中的关键步骤。目前，心脏安全性评估仍然高度依赖于动物研究。然而，由于物种特异性差异，特别是在心脏电生理特性方面，动物模型受到人类翻译特异性差的困扰。因此，迫切需要开发一种可靠、高效和基于人的临床前心脏安全性评估模型。人诱导的多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为药物诱导的心脏毒性筛查和疾病建模的 宝贵体外 模型。hiPSC-CMs可以从具有不同遗传背景和各种疾病状况的个体中获得，使其成为单独评估药物诱导的心脏毒性的理想替代品。因此，需要建立全面研究hiPSC-CMs功能特征的方法。在该协议中，我们详细介绍了可以在hiPSC-CMs上评估的各种功能测定，包括收缩力，场电位，动作电位和钙处理的测量。总体而言，将hiPSC-CMs纳入临床前心脏安全性评估有可能彻底改变药物开发。

Introduction

药物开发是一个漫长而昂贵的过程。一项针对美国食品和药物管理局 （FDA） 在 2009 年至 2018 年间批准的新治疗药物的研究报告称，资本化研究和临床试验的估计成本中位数为每种产品 9.85 亿美元¹。药物引起的心脏毒性是药物损耗和退出市场的主要原因².值得注意的是，多类治疗药物中报告了心脏毒性³。因此，心脏安全性评估是药物开发过程中的关键组成部分。目前的心脏安全性评估范式仍然高度依赖于动物模型。然而，与使用动物模型的物种差异越来越被认为是^{人类患者药物}诱导的心脏毒性预测不准确的主要原因4。例如，由于不同复极电流的贡献，人类和小鼠之间的心脏动作电位形态差异^很大5。此外，可影响心脏生理学的心肌球蛋白和环状RNA的差异亚型^{已在物种6，7}中得到充分记录。为了弥合这些差距，必须建立一个可靠、高效和基于人的临床前心脏安全性评估模型。

诱导多能干细胞（iPSC）技术的突破性发明产生了前所未有的药物筛选和疾病建模平台。在过去的十年中，产生人类诱导的多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CMs）的方法^{已经非常成熟}8^，9。hiPSC-CMs在疾病建模、药物诱导的心脏毒性筛查和精准医学中的潜在应用引起了极大的兴趣。例如，hiPSC-CMs已被用于模拟由遗传引起的心脏病的病理表型，例如长QT综合征10，肥厚型心肌病11，12和扩张型心肌病¹³，^14，15。因此，已经确定了与心脏病发病机制有关的关键信号通路，这可以阐明有效治疗的潜在治疗策略。此外，hiPSC-CMs已被用于筛选与抗癌药物相关的药物诱导的心脏毒性，包括多柔比星，曲妥珠单抗和酪氨酸激酶抑制剂¹⁶，^17，18;减轻由此产生的心脏毒性的策略正在研究中。最后，hiPSC-CMs中保留的遗传信息允许在个体和人群水平上筛选和预测药物诱导的心脏毒性^19，20。总的来说，hiPSC-CMs已被证明是个性化心脏安全预测的宝贵工具。

该协议的总体目标是建立全面有效地研究hiPSC-CMs功能特征的方法，这对于将hiPSC-CMs应用于疾病建模，药物诱导的心脏毒性筛查和精准医学非常重要。在这里，我们详细介绍了一系列功能测定来评估hiPSC-CMs的功能特性，包括收缩力，场电位，动作电位和钙（Ca²⁺）处理的测量（图1）。

Protocol

1. 培养基和溶液的制备

1. 通过混合 10 mL 瓶装 50x B27 补充剂和 500 mL RPMI 1640 培养基来制备 hiPSC-CM 维持培养基。将培养基储存在4°C并在一个月内使用。使用前将介质平衡至室温 （RT）。
2. 通过混合 20 mL 血清替代物和 180 mL hiPSC-CM 维持培养基（10% 稀释度，v/v）制备 hiPSC-CM 接种培养基。虽然新鲜制备的播种培养基是优选的，但它可以在4°C下储存不超过2周。使用前将培养基平衡至室温。
3. 通过在4°C下解冻一瓶（10mL）基底膜基质过夜并在无菌1.5mL管中等分500μL基底膜基质来制备细胞外基质包被溶液。储存在-20°C以备进一步使用。混合 500 μL 基底膜基质和 100 mL 冰冷的 DMEM/F12 培养基（1:200 稀释，v/v），制成基底膜基质涂层溶液。
4. 制备 50 mL Tyrode 溶液，其中含有 135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM 氯化镁 2、1.8 mM CaCl₂、5 mM 葡萄糖和 10 mM HEPES。用氢氧化钠将pH值调节至7.4。在实验当天准备新鲜的Tyrode溶液。
5. 制备 50 mL 细胞内移液器溶液，含有 120 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM EGTA 和 10 mM HEPES。用KOH将pH值调节至7.2。将细胞内移液器溶液分装在无菌5mL管中，并将其储存在-20°C。 在实验当天，将MgATP新鲜添加到溶液中，以达到3mM的最终浓度。
6. 制备 1 mL 含有 2 μM Fura-2 AM 和 0.1% 冥王星 F-127 的 Fura-2 AM 上样溶液。在实验当天准备新鲜的装载溶液并避光。

2. 测量 hiPSC-CM 收缩运动

1. 通过向 96 孔板的每个孔中加入 100 μL 细胞外基质包被溶液来制备基底膜基质包被板。将96孔板在37°C，5%CO₂ 的加湿细胞培养箱中孵育过夜。
2. 酶解离 hiPSC-CMs
   1. 向斯坦福心血管研究所iPSC生物库（http://med.stanford.edu/scvibiobank.html）申请hiPSC。根据先前的出版物^8，9生成hiPSC-CM。在显微镜下以10倍放大倍率观察在六孔板中培养的hiPSC-CMs。
      注意:当细胞仍在增殖时，不要解离它们。否则，细胞在重新铺板后会在孔上过度生长，并导致功能测定的结果不准确。通常，hiPSC-CMs在第18-23天停止增殖。
   2. 确保 hiPSC-CM 跳动强烈且纯度超过 95%。通过对心肌肌钙蛋白T（心肌细胞8^，9的特异性标志物）进行免疫染色来评估纯度。
   3. 吸出维持培养基并用1x DPBS洗涤细胞两次。向六孔板的每个孔中加入1mL细胞分离溶液，并在37°C下孵育10分钟。
      注意:应定期监测孵育时间。确保不要过度消化细胞，因为它会降低细胞活力。
   4. 使用 5 mL 移液器轻轻上下移取 hiPSC-CM 数次，以产生单细胞悬液。加入等体积的hiPSC-CMs接种培养基以中和细胞分离溶液。
   5. 在室温下以 300 x g 离心 hiPSC-CMs 3 分钟。 吸出上清液并将细胞沉淀重悬于 1-2 mL hiPSC-CM 接种培养基中。
   6. 使用台盼蓝排除法量化细胞密度和活力。简而言之，将 10 μL 细胞悬液与等体积台盼蓝混合，转移到细胞计数载玻片上，然后使用细胞计数器计数，如前所述²¹.
3. 接种 hiPSC-CMs
   1. 从96孔板中取出细胞外基质包被溶液。
   2. 将每孔 50，000 个细胞接种在 100 μL hiPSC-CM 接种培养基中，并将 96 孔板置于 37 °C、5% CO₂ 的加湿细胞培养箱中过夜。
   3. 接种后 1 天用 100 μL hiPSC-CM 维持培养基替换 hiPSC-CM 接种培养基。每 2 天更换一次 hiPSC-CM 维持培养基，直到记录。
4. 数据采集
   1. 在电镀后至少 10 天测量 hiPSC-CM 收缩运动（推荐）。
   2. 打开温度控制器并将37°C设置为首选温度。打开显微镜、相机和 CO₂ 电源。
   3. 用适量的无菌去离子水填充板架的水套（图2A）。将96孔板放在板架上，让细胞适应至少5分钟。
   4. 打开视图软件，将相机帧速率设置为 75 帧/秒 （fps），将视频/图像分辨率设置为 1024 × 1024 像素。应用自动对焦和自动亮度功能。录制hiPSC-CM的视频和图像。
      注意:记录过程中避免显微镜台振动。
   5. 打开分析仪软件进行自动分析。

3. hiPSC-CM场电位的测量

1. 基底膜基质涂层板的制备
   1. 小心地将 8 μL 细胞外基质包被溶液液滴放在 48 孔微电极阵列 （MEA） 板每个孔的记录电极区域上。参见 图3A ，了解液滴放置的适当电极面积。此步骤对于保持hiPSC-CM单层集中在电极上至关重要。在任何情况下都避免触摸电极。
   2. 向 3 孔 MEA 板的孔周围区域（图 3A）中加入 48 mL 无菌去离子水，以防止涂层溶液蒸发。在37°C，5%CO₂ 的加湿细胞培养箱中孵育48孔MEA板45-60分钟。
      注意:不要孵育太久，以防止基底膜基质干燥。
2. 按照步骤2.2中所述对hiPSC-CMs进行酶解离。
3. 接种 hiPSC-CMs
   1. 在同一行或同一列内使用 200 μL 移液器吸头从孔表面去除大部分细胞外基质培养基，而无需接触电极。
   2. 在同一行或列的每个孔的记录电极区域上，将每孔接种 50，000 个细胞放入 8 μL 液滴的 hiPSC-CM 接种培养基中。
   3. 重复最后两个步骤，直到所有孔都接种了细胞。在显微镜下检查所有孔是否具有hiPSC-CM悬浮液。有关所需密度，请参见 图3B。
      注意:如果基底膜基质完全干燥，hiPSC-CMs的附着将受到损害，使细胞附着次优。
   4. 将48孔MEA板在37°C，5%CO₂ 的加湿细胞培养箱中孵育60分钟。
   5. 缓慢而温和地向 48 孔 MEA 板的每个孔中加入 150 μL hiPSC-CM 接种培养基。要在不分散先前接种的hiPSC-CMs的情况下添加培养基，请将板保持在45°角，将移液器吸头靠在每个孔壁上，然后缓慢释放培养基。
      注意:添加培养基过快或高压会使粘附的心肌细胞脱落。避免直接接触 hiPSC-CM 跌落悬浮液。
   6. 将48孔MEA板在37°C，5%CO₂ 的加湿细胞培养箱中孵育过夜。
   7. 接种后 1 天用 300 μL hiPSC-CM 维持培养基刷新 hiPSC-CM 接种培养基。记录前每 2 天更换一次 hiPSC-CM 维持培养基。
4. 数据采集
   1. 电镀后至少10天进行MEA测量（推荐）。在电镀后第10天，在显微镜下以10倍放大倍率检查自发跳动hiPSC-CM单层的密度，应如图 3C所示。
   2. 将 48 孔 MEA 板放入记录仪器中。触摸屏允许观察温度（37°C）和CO₂ （5%）状态。
   3. 打开导航器软件。在实验设置窗口中，选择 心脏实时配置和野电位记录。应用自发或有节奏的跳动配置。
   4. 在拍频检测参数中，将检测阈值设置为 300 μV，最小跳动周期设置为 250 ms，最大跳动时间为 5 s。选择多项 式回归 进行场势持续时间 （FPD） 计算。
   5. 检查基线电活动信号是否成熟稳定。
      注意:来自多孔MEA板的每个电极记录的成熟波形必须反映心脏场电位，其特征易于识别，与心脏去极化尖峰和复极相位一致，如图3D-F所示。
   6. 获得基线心脏活动1-3分钟。如果需要药物治疗，请在基线记录后将化合物添加到孔中。在下一次记录之前将板放入培养箱中至少30分钟。

4. 测量 hiPSC-CM 动作电位

1. 通过将 500 μL 细胞外基质涂层溶液放在 35 mm 培养皿的玻璃底部分来制备基底膜基质包被的培养皿（图 4A）。将35mm培养皿在37°C，5%CO₂ 的加湿细胞培养箱中孵育过夜。
2. 按照步骤2.2中所述对hiPSC-CMs进行酶解离。
3. 接种 hiPSC-CMs
   1. 从35 mm培养皿中取出细胞外基质涂层溶液。在 35 mm 培养皿的玻璃底部的 500 μL hiPSC-CM 接种培养基中每孔接种 50，000 个细胞。
   2. 将35mm培养皿在37°C，5%CO₂ 的加湿细胞培养箱中孵育过夜。取出 hiPSC-CM 接种培养基，并将 2 mL 的 hiPSC-CM 维持培养基加入 35 mm 培养皿中。
      注意:建议将 200 μL 未过滤吸头放在 2 mL 吸液器上，以去除用过的培养基以避免接触细胞。
   3. 记录前每2天更换一次hiPSC-CM培养基。
4. 数据采集
   1. 在电镀后至少 10 天进行动作电位测量（推荐）。按照步骤1.4中的说明准备新鲜的Tyrode溶液。解冻一等分试样的细胞内移液管溶液，新鲜加入MgATP至终浓度为3mM。
   2. 使用微量移液器拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉出微量移液器。
      注意:优选微量移液器的电阻为2-5 MΩ。
   3. 用Tyrode溶液替换hiPSC-CM维持培养基，并让细胞适应Tyrode溶液15分钟（图4C）。将温度传感器插入腔室中，如图 4C所示将35 mm培养皿放入腔室中，然后将温度调节至37°C（图4D）。
   4. 用细胞内溶液填充微量移液器，并将其插入连接到膜片钳放大器头级的支架中（图4E）。打开刺激/采集软件，加载动作电位记录协议，然后选择电压钳配置。
   5. 将微量移液器插入浴液中，选择合适的单个hiPSC-CM，并使用显微操纵器调整和降低微量移液器在所选细胞旁边的位置。当移液器吸头插入浴液中时，检查移液器电阻是否可以在示波器监视器上观察到。
   6. 将移液器靠近细胞放置，电流脉冲将略微减小，以反映增加的密封电阻。用负压轻轻抽吸以增加阻力，这将形成gigaseal。应用 密封 功能。
   7. 施加额外的吸力以破坏膜以获得全细胞记录配置。一旦移液器区域内的膜部分被抽吸破裂，内部溶液就与细胞质保持平衡。此时，使用放大器对话框从电压钳模式（V-箝位）切换到电流箝位模式或无电流注入（C-Clamp）。按 "记录" 按钮生成并保存动作电位记录文件。
      注意:模式变化通过无触发和无刺激记录协议 连续 记录hiPSC-CM的自发动作电位，可以在膜片钳放大器的V-mon输出端进行监控。

5. 测量 hiPSC-CM Ca²⁺ 瞬态

1. 参考先前的协议，为Ca 2⁺ 成像制备定制的细胞室²¹。为了制备基底膜基质包被的细胞室，将200μL细胞外基质包被溶液置于细胞室中。将细胞室在37°C，5%CO₂ 的加湿细胞培养箱中孵育过夜。
2. 按照步骤2.2中所述对hiPSC-CMs进行酶解离。
3. 接种 hiPSC-CMs
   1. 从细胞室中取出细胞外基质涂层溶液。在 200 μL hiPSC-CM 接种培养基中每孔接种 20，000 个细胞。
   2. 接种后 1 天用 200 μL hiPSC-CM 维持培养基替换 hiPSC-CM 接种培养基。记录前每 2 天更换一次 hiPSC-CM 维持培养基。
4. 数据采集
   1. 在电镀后至少10天进行Ca²⁺ 瞬态测量（推荐）。按照步骤1.4中的说明准备新鲜的Tyrode溶液。按照步骤1.6中的说明制备新鲜的Fura-2 AM上样溶液。
   2. 吸出hiPSC-CM维持培养基并用Tyrode溶液洗涤两次。应用 100 μL Fura-2 AM 上样溶液，并在室温下孵育 10 分钟。
   3. 用Tyrode溶液替换Fura-2 AM上样溶液，并等待至少5分钟以使Fura-2 AM完全脱酯。
   4. 在配备40倍油浸物镜（0.95 NA）的倒置落射荧光显微镜的40倍物镜上加入一滴浸油。将细胞室放在显微镜的载物台适配器中（图5A）。
   5. 将温度控制器电线安装到浴室中并将其设置为37°C。 安装电场刺激电极并将脉冲设置为 0.5 Hz，持续时间为 20 ms。
   6. 打开超高速波长切换光源，根据仪器说明将其设置为340 nm和380 nm快速切换模式。
   7. 在软件中对两个波长应用20 ms的曝光时间和20 s的记录时间。录制反映 hiPSC-CM 中 Ca²⁺ 瞬态实时变化的视频。将数据导出到电子表格并分析数据，如前所述²³.

Results

该协议描述了如何测量hiPSC-CM的收缩运动，场电位，动作电位和Ca^{2 +} 瞬态。包括酶消化、细胞接种、维持和功能测定传导的示意图如图 1 所示。hiPSC-CM单层的形成对于收缩运动测量是必要的（图2B）。hiPSC-CMs收缩-松弛运动的代表性迹线如图 2C所示。分析仪软件通过使用默认设置检测收缩开始、收缩峰值、收缩结束、松弛峰值和松弛结束，能够以自动方式分析收缩-松弛运动轨迹（图 2D）。收缩和弛豫峰的速度用于评估hiPSC-CMs的收缩和弛豫能力。此外，还可以获得收缩和松弛变形距离。

MEA测定是动作电位的细胞外记录，称为场电位。成功测量场电位需要完全覆盖MEA板每个孔内所有电极上的hiPSC-CM单层（图3C）。每个电极记录的成熟波形必须反映具有易于识别...

Discussion

人类iPSC技术已成为疾病建模和药物筛选的强大平台。在这里，我们描述了用于测量hiPSC-CM收缩力，场电位，动作电位和Ca^{2 +}瞬态的详细协议。该协议提供了hiPSC-CM收缩力和电生理学的全面表征。这些功能测定已应用于我们组^12，13，¹⁸，^24，25，^26，27的多种出版物中。

必须使用处于良好跳动条件下的hiPSC-CM，否则读数的信噪比将急剧下降。此外，希望在测量前确保hiPSC-CMs的高纯度。非心肌细胞的存在尤其会损害收缩运动和场电位测量的数据准确性，这两者都需要形成hiPSC-CM单层...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm 玻璃底培养皿，带 20 mm 微孔 #1.5 盖玻片	Cellvis	D35-20-1.5-N	膜片钳
50x B27 添加剂	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM 培养基
6 孔培养板	E &K Scientific	EK-27160	hiPSC-CM 培养
96 孔平底透明底黑色聚苯乙烯 TC 处理的微孔板	康宁	3603	收缩运动测量
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	酶解离
Axion 的集成工作室 （AxIS）	Axion Biosystems		导航软件
硅酸盐玻璃毛细管	哈佛仪器	BF 100-50-10，	膜片钳
CaCl2 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode's 溶液
细胞计数室载玻片	ThermoFisher Scientific	C10228	细胞计数
CytoView 48 孔 MEA 板	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	MEA
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	细胞外基质培养基
DPBS，无钙、无镁	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	细胞内移液器溶液
EPC 10 USB 膜片钳放大器	Warner Instruments	89-5000	膜片钳
Fura-2，AM，细胞通透性	ThermoFisher Scientific	F1221	Ca2+ 瞬态测量
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode's 解决方案
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode's 解决方案
hiPSCs	： 斯坦福心血管研究所 iPSC 生物样本库
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode's 溶液
KnockOut 血清替代	ThermoFisher Scientific	10828-028	hiPSC-CM 接种培养基
KOH 8 M	Sigma-Aldrich	P4494	细胞内移液器溶液
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ 瞬态测量;超高速波长切换光源
Luna-FL 自动荧光细胞计数器	WISBIOMED	LB-L20001	细胞计数
Maestro Pro MEA 系统	Axion Biosystems		MEA
基质胶生长因子降低 （GFR） 基底膜基质	康宁	356231	细胞外基质培养基
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	细胞内移液器溶液
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode's 溶液
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode's 溶液
NaOH 10 M	Sigma-Aldrich	72068	泰罗德's 溶液
NIS Elements AR
Pluronic F-127（20% 溶于 DMSO 中）	ThermoFisher Scientific	P3000MP	Ca2+ 瞬态测量
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11875-119	hiPSC-CM 培养基
Sony SI8000 细胞运动成像系统	Sony Biotechnology		收缩运动测量
Sutter 微量移液器拉拔器	Sutter Instruments	P-97	膜片钳
台盼蓝染色	Life Technologies	T10282	细胞计数