微电极阵列和膜片钳记录在人诱导多能干细胞来源心肌细胞上的技术应用

Summary

人诱导的多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为药物诱导的心脏毒性筛查和疾病建模的有前途的 体外 模型。在这里，我们详细介绍了用于测量hiPSC-CMs的收缩力和电生理学的方案。

Abstract

药物引起的心脏毒性是药物损耗和退出市场的主要原因。因此，使用适当的临床前心脏安全性评估模型是药物开发过程中的关键步骤。目前，心脏安全性评估仍然高度依赖于动物研究。然而，由于物种特异性差异，特别是在心脏电生理特性方面，动物模型受到人类翻译特异性差的困扰。因此，迫切需要开发一种可靠、高效和基于人的临床前心脏安全性评估模型。人诱导的多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为药物诱导的心脏毒性筛查和疾病建模的 宝贵体外 模型。hiPSC-CMs可以从具有不同遗传背景和各种疾病状况的个体中获得，使其成为单独评估药物诱导的心脏毒性的理想替代品。因此，需要建立全面研究hiPSC-CMs功能特征的方法。在该协议中，我们详细介绍了可以在hiPSC-CMs上评估的各种功能测定，包括收缩力，场电位，动作电位和钙处理的测量。总体而言，将hiPSC-CMs纳入临床前心脏安全性评估有可能彻底改变药物开发。

Introduction

药物开发是一个漫长而昂贵的过程。一项针对美国食品和药物管理局 （FDA） 在 2009 年至 2018 年间批准的新治疗药物的研究报告称，资本化研究和临床试验的估计成本中位数为每种产品 9.85 亿美元¹。药物引起的心脏毒性是药物损耗和退出市场的主要原因².值得注意的是，多类治疗药物中报告了心脏毒性³。因此，心脏安全性评估是药物开发过程中的关键组成部分。目前的心脏安全性评估范式仍然高度依赖于动物模型。然而，与使用动物模型的物种差异越来越被认为是^{人类患者药物}诱导的心脏毒性预测不准确的主要原因4。例如，由于不同复极电流的贡献，人类和小鼠之间的心脏动作电位形态差异^很大5。此外，可影响心脏生理学的心肌球蛋白和环状RNA的差异亚型^{已在物种6，7}中得到充分记录。为了弥合这些差距，必须建立一个可靠、高效和基于人的临床前心脏安全性评估模型。

诱导多能干细胞（iPSC）技术的突破性发明产生了前所未有的药物筛选和疾病建模平台。在过去的十年中，产生人类诱导的多能干细胞衍生心肌细胞（hiPSC-CMs）的方法^已经....

Protocol

1. 培养基和溶液的制备

1. 通过混合 10 mL 瓶装 50x B27 补充剂和 500 mL RPMI 1640 培养基来制备 hiPSC-CM 维持培养基。将培养基储存在4°C并在一个月内使用。使用前将介质平衡至室温 （RT）。
2. 通过混合 20 mL 血清替代物和 180 mL hiPSC-CM 维持培养基（10% 稀释度，v/v）制备 hiPSC-CM 接种培养基。虽然新鲜制备的播种培养基是优选的，但它可以在4°C下储存不超过2周。使用前将培养基平衡至室温。
3. 通过在4°C下解冻一瓶（10mL）基底膜基质过夜并在无菌1.5mL管中等分500μL基底膜基质来制备细胞外基质包被溶液。储存在-20°C以备进一步使用。混合 500 μL 基底膜基质和 100 mL 冰冷的 DMEM/F12 培养基（1:200 稀释，v/v），制成基底膜基质涂层溶液。
4. 制备 50 mL Tyrode 溶液，其中含有 135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM 氯化镁 2、1.8 mM CaCl₂、5 mM 葡萄糖和 10 mM HEPES。用氢氧化钠将pH值调节至7.4。在实验当天准备新鲜的Tyrode溶液。
5. 制备 50 mL 细胞内移液器溶液，含有 120 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM EGTA 和 10 mM HEPES。用....

Results

该协议描述了如何测量hiPSC-CM的收缩运动，场电位，动作电位和Ca^{2 +} 瞬态。包括酶消化、细胞接种、维持和功能测定传导的示意图如图 1 所示。hiPSC-CM单层的形成对于收缩运动测量是必要的（图2B）。hiPSC-CMs收缩-松弛运动的代表性迹线如图 2C所示。分析仪软件通过使用默认设置检测收缩开始、收缩峰值、收缩结束、松弛峰值和松弛结束，能够以自动方式分析收缩-松弛运动轨迹（图 2D）。收缩和弛豫峰的速度用于评估hiPSC-CMs的收缩和弛豫能力。此外，还可以获得收缩和松弛变形距离。

MEA测定是动作电位的细胞外记录，称为场电位。成功测量场电位需要完全覆盖MEA板每个孔内所有电极上的hiPSC-CM单层（图3C）。每个电极记录的成熟波形必须反映具有易于识别.......

Discussion

人类iPSC技术已成为疾病建模和药物筛选的强大平台。在这里，我们描述了用于测量hiPSC-CM收缩力，场电位，动作电位和Ca^{2 +}瞬态的详细协议。该协议提供了hiPSC-CM收缩力和电生理学的全面表征。这些功能测定已应用于我们组^12，13，¹⁸，^24，25，^26，27的多种出版物中。

必须使用处于良好跳动条件下的hiPSC-CM，否则读数的信噪比将急剧下降。此外，希望在测量前确保hiPSC-CMs的高纯度。非心肌细胞的存在尤其会损害收缩运动和场电位测量的数据准确性，这两者都需要形成hiPSC-CM单层.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm 玻璃底培养皿，带 20 mm 微孔 #1.5 盖玻片	Cellvis	D35-20-1.5-N	膜片钳
50x B27 添加剂	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM 培养基
6 孔培养板	E &K Scientific	EK-27160	hiPSC-CM 培养
96 孔平底透明底黑色聚苯乙烯 TC 处理的微孔板	康宁	3603	收缩运动测量
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	酶解离
Axion 的集成工作室 （AxIS）	Axion Biosystems		导航软件
硅酸盐玻璃毛细管	哈佛仪器	BF 100-50-10，	膜片钳
CaCl2 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode's 溶液
细胞计数室载玻片	ThermoFisher Scientific	C10228	细胞计数
CytoView 48 孔 MEA 板	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	MEA
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	细胞外基质培养基
DPBS，无钙、无镁	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	细胞内移液器溶液
EPC 10 USB 膜片钳放大器	Warner Instruments	89-5000	膜片钳
Fura-2，AM，细胞通透性	ThermoFisher Scientific	F1221	Ca2+ 瞬态测量
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode's 解决方案
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode's 解决方案
hiPSCs	： 斯坦福心血管研究所 iPSC 生物样本库
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode's 溶液
KnockOut 血清替代	ThermoFisher Scientific	10828-028	hiPSC-CM 接种培养基
KOH 8 M	Sigma-Aldrich	P4494	细胞内移液器溶液
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ 瞬态测量;超高速波长切换光源
Luna-FL 自动荧光细胞计数器	WISBIOMED	LB-L20001	细胞计数
Maestro Pro MEA 系统	Axion Biosystems		MEA
基质胶生长因子降低 （GFR） 基底膜基质	康宁	356231	细胞外基质培养基
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	细胞内移液器溶液
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode's 溶液
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode's 溶液
NaOH 10 M	Sigma-Aldrich	72068	泰罗德's 溶液
NIS Elements AR
Pluronic F-127（20% 溶于 DMSO 中）	ThermoFisher Scientific	P3000MP	Ca2+ 瞬态测量
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11875-119	hiPSC-CM 培养基
Sony SI8000 细胞运动成像系统	Sony Biotechnology		收缩运动测量
Sutter 微量移液器拉拔器	Sutter Instruments	P-97	膜片钳
台盼蓝染色	Life Technologies	T10282	细胞计数