人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种有前景的 体外 用于药物诱导心脏毒性筛选和疾病建模。本文中，我们详细描述了一种测量人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）收缩力和电生理特性的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
药物诱导的心脏毒性是导致药物研发失败和撤市的主要原因。因此，在药物开发过程中采用适当的临床前心脏安全性评价模型至关重要。目前，心脏安全性评价仍高度依赖动物实验。然而，由于物种间差异，特别是心脏电生理特性的种属特异性，动物模型在向人类转化时存在特异性差的问题。因此，迫切需要建立一种可靠、高效且基于人类细胞的临床前心脏安全性评价模型。人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）已成为一种极具价值的 体外 用于药物诱导心脏毒性筛选和疾病建模的模型。hiPSC-CMs 可从具有不同遗传背景和多种疾病状态的个体中获得，使其成为评估个体化药物诱导心脏毒性的理想替代模型。因此，亟需建立全面研究 hiPSC-CMs 功能特性的方法体系。在本方案中，我们详细描述了可在 hiPSC-CMs 上进行的多种功能检测，包括收缩力、场电位、动作电位和钙处理能力的测量。总体而言，将 hiPSC-CMs 应用于临床前心脏安全性评估，有望彻底改变药物研发模式。
引言
药物研发是一个漫长且昂贵的过程。一项针对2009年至2018年间获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的新治疗药物的研究报告指出，每种产品的资本化研发和临床试验的估计中位成本为9.85亿美元1。药物诱导的心脏毒性是导致药物研发失败和撤市的首要原因2。值得注意的是，多种类别的治疗药物均被报道可引发心脏毒性3。因此，心脏安全性评估是药物研发过程中的关键环节。目前心脏安全性评估的范式仍高度依赖动物模型。然而，使用动物模型所带来的物种差异正日益被视为对人类患者药物诱导心脏毒性预测不准确的主要原因4。例如，由于复极化电流的差异，人类与小鼠之间的心肌动作电位形态存在显著不同5。此外，不同物种间心脏肌球蛋白和可影响心脏生理功能的环状RNA的差异性亚型已有充分文献记录6,7。为弥补这些差距，迫切需要建立一种可靠、高效且基于人类的模型，用于临床前心脏安全性评估。
诱导性多能干细胞（iPSC）技术的突破性发明，为药物筛选和疾病建模提供了前所未有的平台。在过去十年中，生成人诱导性多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的方法已日趋成熟
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方案
1. 培养基与溶液的制备
- 通过将一管10 mL的50倍浓缩B27添加剂与500 mL RPMI 1640培养基混合，配制hiPSC-CM维持培养基。将培养基储存在4 °C，一个月内使用。使用前平衡至室温（RT）。
- 通过将20 mL血清替代物与180 mL hiPSC-CM维持培养基混合（10%稀释，v/v），配制hiPSC-CM接种培养基。建议使用新鲜配制的接种培养基，但可在4 °C储存不超过2周。使用前平衡至室温（RT）。
- 通过在4 °C过夜解冻一管（10 mL）基底膜基质，并将其分装为每管500 µL至无菌1.5 mL离心管中，制备细胞外基质包被溶液。储存于-20 °C以备后续使用。将500 µL基底膜基质与100 mL冰冻的DMEM/F12培养基混合（1:200稀释，v/v），制成基底膜基质包被溶液。
- 配制50 mL Tyrode溶液，其中含135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl2、5 mM葡萄糖和10 mM HEPES。用NaOH调节pH至7.4。实验当天新鲜配制Tyrode溶液。
- 配制50 mL细胞内移液管溶液，其中含120 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM EGTA和10 mM HEPES。用KOH调节pH至7.2。将细胞内移液管溶液分装至无菌5 mL离....
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结果
本方案描述了如何测量hiPSC-CMs的收缩运动、场电位、动作电位以及Ca2+瞬变。包含酶消化、细胞接种、维持培养及功能检测操作的示意图见图1。hiPSC-CM单层的形成是进行收缩运动测量的必要条件（图2B）。hiPSC-CMs收缩-舒张运动的代表性轨迹如图2C所示。分析软件可通过默认设置自动识别收缩起始点、收缩峰值点、收缩终止点、舒张峰值点和舒张终止点，从而实现对收缩-舒张运动轨迹的自动化分析（图2D）。收缩与舒张峰值速度可用于评估hiPSC-CMs的收缩与舒张能力。此外，还可获得收缩与舒张的形变距离。
MEA 检测是一种细胞外记录动作电位（称为场电位）的方法。成功记录场电位需要在 MEA 板每孔内的所有电极上完全覆盖 hiPSC-CM 单层细胞（图 3C）。每个.......
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讨论
人类诱导多能干细胞（iPSC）技术已成为疾病建模和药物筛选的强大平台。本文中，我们描述了一种详细的实验方案，用于测量hiPSC-CM的收缩力、场电位、动作电位以及Ca2+瞬变。该方案可对hiPSC-CM的收缩功能和电生理特性进行全面表征。这些功能性检测方法已在本课题组的多项研究中得到应用12,13,18,24,25,26,27。
必须使用搏动状态良好的hiPSC-CMs，否则检测信号的信噪比将显著下降。此外，建议在测量前确保hiPSC-CMs具有高纯度。非心肌细胞的存在尤其会影响收缩运动和场电位测量的.......
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披露
J.C.W. 是 Greenstone Biosciences 的联合创始人，但不存在利益冲突，因为本文所展示的工作完全独立。其他作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Blake Wu 对手稿的校对。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 HL113006、R01 HL141371、R01 HL163680、R01 HL141851、U01FD005978 和 NASA NNX16A069A（JCW）以及美国心脏协会博士后奖学金 872244（GMP）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 玻璃底培养皿，带 20 mm 微孔，#1.5 盖玻片 | Cellvis | D35-20-1.5-N | 膜片钳 |
| 50x B27添加剂 | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM 培养基 |
| 6孔培养板 | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM 培养 |
| 96孔平底透明黑色聚苯乙烯TC处理微孔板 | 康宁 | 3603 | 收缩运动测量 |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | 酶解离 |
| Axion集成工作室（AxIS） | Axion Biosystems | 导航软件 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | 哈佛仪器 | BF 100-50-10 | 膜片钳 |
| CaCl2 1 M H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s 溶液 |
| 细胞计数板载玻片 | 赛默飞世尔科技 | C10228 | 细胞计数 |
| CytoView 48孔MEA板 | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | 多电极阵列 |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | 细胞外基质培养基 |
| 不含钙、镁的DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | 细胞内移液管溶液 |
| EPC 10 USB 膜片钳放大器 | Warner Instruments | 89-5000 | 膜片钳 |
| Fura-2 AM，细胞通透性 | 赛默飞世尔科技 | F1221 | Ca2+ 瞬态测量 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s 溶液 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’溶液 |
| hiPSCs | 斯坦福心血管研究所iPSC生物样本库 | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s 溶液 |
| KnockOut血清替代物 | 赛默飞世尔科技 | 10828-028 | hiPSC-CM 接种培养基 |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | 细胞内移液管溶液 |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ 瞬态测量；超高速波长切换光源 | |
| Luna-FL 全自动荧光细胞计数仪 | WISBIOMED | LB-L20001 | 细胞计数 |
| Maestro Pro MEA系统 | Axion Biosystems | 多电极阵列 | |
| 基底膜基质（生长因子减少型 Matrigel GFR） | 康宁 | 356231 | 细胞外基质培养基 |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | 细胞内移液管溶液 |
| MgCl₂2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s 溶液 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s 溶液 |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s 溶液 |
| NIS 元素 AR | |||
| Pluronic F-127（DMSO 中 20% 溶液） | 赛默飞世尔科技 | P3000MP | Ca2+ 瞬态测量 |
| RPMI 1640 培养基 | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM 培养基 |
| 索尼 SI8000 细胞运动成像系统 | 索尼生物技术 | 收缩运动测量 | |
| Sutter 微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments | P-97 | 膜片钳 |
| 台盼蓝染色 | Life Technologies | T10282 | 细胞计数 |
参考文献
- Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
- Pang, L., et al.
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重印与许可
