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方法文章

使用单分子定位显微镜绘制细胞核中DNA的绝对密度图

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DOI：

10.3791/64268

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2025年11月11日

 , 
1Institute of Molecular Biology (IMB), 2Max Planck Institute for Polymer Research

本文内容

摘要

本实验方案描述了一种利用单分子定位显微镜数据、已知体积、基因组大小和细胞周期阶段，通过沃罗诺伊图（Voronoi tessellation）测定贴壁细胞核内绝对DNA密度的方法。

摘要

在细胞核内，沉默基因通常位于称为异染色质的高密度染色质区域，而活性基因则主要分布于染色质与染色质间间隙的交界区域，即常染色质。目前，对常染色质和异染色质的鉴定主要基于表观遗传修饰 DNA序列上的组蛋白蛋白分布已有研究，但关于细胞核内绝对DNA密度及其功能意义的信息仍然有限。仅基于生化数据和染色质作为聚合物性质假设的细胞核模型，与高分辨率显微镜生成的成像数据存在根本性差异，这表明目前仍缺少重要的结构相关信息。我们认为空间限制可能参与基因调控，因此开发了一种方法，通过将超分辨率定位数据经由Voronoi镶嵌转换为真实比例的密度图，实现对哺乳动物细胞核内绝对DNA密度的测量。

引言

自细胞生物学发展初期以来，作为遗传信息中心的细胞核一直令生物学家着迷。1928年，Emil Heitz 在应用了自行开发的细胞学染色方法后，发现细胞核内存在染色程度不同的、着色较深的区域1。他将染色更深、更致密的区域称为"异染色质"，而将染色较浅、密度较低的区域命名为"常染色质"。随着时间推移，人们逐渐认识到，活跃的基因主要位于常染色质中，而更致密的区域则富含重复序列元件和沉默基因。尽管“异染色质”和“常染色质”这两个术语沿用至今，但其定义已从结构特征转变为分子特性（见下文）。如今我们了解到，细胞核可分为两个主要相态：一种是液态的染色质间区室，包含核体、剪接区室以及核质；另一种是固态、类水凝胶性质的染色质区室，包括染色体领地和核仁2。在与染色质间区室交界处，染色质密度较低，此处主要发生基因活性相关的过程，如转录、复制和修复3,4,5；而在核纤层附近、核仁周围以及着丝粒邻近区域，染色质高度压缩，通常转录活性较低6。

在分子水平上，染色质由DNA缠绕在核小体（组蛋白核心蛋白的八聚体）上构成。组蛋白具有内在无序的尾部结构域，可通过翻译后修饰添加多种化学基团（甲基、乙酰基、磷酸基、生物素）、氨基酸（精氨酸）甚至蛋白质（SUMO、泛素）进行修饰。7这些修饰可以被识别并招募其他蛋白质（例如，染色质重塑复合物、HP1、修复蛋白、RNA），从而在不直接改变DNA序列的情况下决定其生理状态（转录许可性/限制性）。 （因此“epi”"遗传的7特定序列周围的修饰类型和数量在不同细胞类型之间可能存在显著差异， 可逆的，并可在发育、衰老和疾病过程中发生改变8,9,10组蛋白尾部存在某些修饰在转录活跃区域更为常见，而另一些修饰则主要富集于基因组中转录活性较低或无转录活性的区域。

例如，富含 H3K4修饰或组蛋白尾部发生乙酰化的高转录区域通常被称为常染色质，而富含抑制性组蛋白修饰（如H3K9me3、H3K27me3或H4K20me3）的区域则被称为异染色质，后者可进一步分为组成型异染色质（在所有细胞中均无转录活性，例如H4K20me3）和兼性异染色质（根据细胞类型不同而沉默的染色质，例如H3K27me3）6。尽管生物化学和分子生物学方法非常适合在序列水平上检测化学变化，但利用这些方法对介观尺度上的空间特性进行分析则具有较大挑战性。

例如，已有研究尝试利用 Hi-C 实验的邻近信息来重建基因组的空间模型，Hi-C 实验可检测并绘制序列区域之间 DNA 的近距离关系11。然而，与高分辨率的光学显微镜和电子显微镜图像直接比较表明，这种方法仅在有限程度上可行（图1）。尽管 Hi-C12 等方法能够正确地将分裂间期细胞中的染色体区域识别为独立的结构，但这些模型较为"近视"，因为仅依赖 DNA 序列的邻近性无法反映基因组中相距较远区域之间的空间关系，因此并不十分适用于精确的三维基因组重建。因此，接触频率信息也无法准确反映密度差异。这导致了细胞核内基因组呈现出"意大利面条化"的结构（见图1B），看起来像是一个由可自由接触的环状结构组成的毛线球状团块。

为了建立一个整合性的、更接近真实的细胞核图像，将生化信息与生物物理和结构数据相结合，需要开发能够获取有关细胞核组织不同方面数据的方法。直到最近，从成像 数据中确定细胞核内绝对DNA密度仍然 十分困难。造成这一困难的原因包括传统光学显微镜的分辨率有限、电子显微镜中特异性染色DNA存在的问题，以及电子显微镜观察体积较小。

传统荧光显微镜的分辨率受到光衍射的限制。由于衍射极限的存在，点光源的图像会发生扩散，这一现象可用点扩散函数（PSF）来描述。根据点扩散函数，一个荧光分子的图像——在良好近似下可视为点光源——会占据其原始位置（荧光分子）周围一定大小的空间体积13。当多个荧光分子之间的距离远小于其衍射极限下图像的尺寸并被同时激发时，它们的成像强度分布会相互叠加，导致单个荧光分子的位置无法被分辨。通过荧光分子依次随机发光（闪烁），可实现单个分子的光学分离，从而通过确定其信号的强度重心来精确定位各个分子的位置。

通过累积大量记录图像中的荧光分子定位数据，可用于重建样品的结构信息。该方法通常被称为单分子定位显微镜技术（SMLM）（更多详细信息参见14）。荧光分子在其“开启时间”内发射的光子越多，其光强重心的定位就越精确。光路中的散光透镜可将位于光学焦平面之上或之下的荧光分子信号转化为椭圆形，从而用于确定其沿光轴方向的位置。来自焦平面下方荧光信号所产生的椭圆其长轴方向与焦平面上方荧光分子产生的椭圆长轴方向相差90°。此外，这些椭圆的轴长比可用于确定分子相对于焦平面沿光轴方向的位置，定位范围可达±300 nm15。

通过随机闪烁事件重建生成的超分辨率图像质量在很大程度上取决于标记密度以及闪烁事件的数量。后者又依赖于荧光染料的光稳定性及其在最终失活前发生的闪烁次数（即“开/关”循环次数）。本文所述用于获取细胞核内DNA分布超分辨率图像的方法称为fBALM（DNA结构波动辅助结合激活定位显微镜）。该方法基于能够瞬时插入核酸内部的荧光染料，这些染料仅在结合DNA后才产生荧光信号16,17。由于DNA的磷酸二酯骨架带有负电荷，因此DNA是一种高度带负电的聚合物。在活细胞中，互补DNA链的稳定需要通过带正电荷的蛋白质（例如组蛋白）和离子来中和电荷。通过降低pH值，可减弱碱基互补配对的稳定性，从而使插入型染料能够自由地进出DNA双螺旋结构16,17。

根据所使用的嵌入型荧光染料，该状态可在特定pH范围内达到。诸如YoYo-1和SYTOX Orange等荧光染料仅在与DNA结合时才会发出荧光，而由于嵌入型染料（与结合DNA小沟的染料如Hoechst和4',6-二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]不同）通常以序列非特异性方式结合，因此非常适合通过定位显微镜来绘制细胞核内DNA分布图。

Voronoi 镶嵌是一种基于点位置将空间划分为不同区域的数学方法。在二维空间中，所生成图形单元的大小反映了点密度的倒数18由于定位显微镜将图像重构为一组代表荧光分子位置的点，因此 Voronoi 镶嵌可用于帮助确定 定位信号的密度（图2因此，使用DNA特异性染料作为荧光染料可实现对DNA密度的测定。

先验的 了解DNA含量（碱基对数量）和细胞核空间尺寸，可将相对DNA密度转换为绝对DNA密度。以下方案展示了利用超分辨率单分子定位显微镜（SMLM）在贴壁细胞中以极高分辨率绘制绝对DNA密度图的方法，并表明这些密度存在显著变异。

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方案

注意：图3 概述了本节所述的工作流程。有关本方案中所用试剂、材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。本出版物所用代码可在此处查看和下载： https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy。

1. 细胞培养

  1. 在37 °C、5% CO2的湿化环境中，使用添加10%胎牛血清的DMEM培养基培养C3H10T1/2、HFB和HeLa细胞。当细胞接近融合状态时，分别以1:3（C3H10T1/2、HFB）和1:10（HeLa）的比例传代培养。
  2. 在进行测量前一天，将处于对数生长期的细胞接种至35 mm带网格的培养皿中。确保观察用培养皿具备优异的光学质量，适用于荧光显微镜观察（玻璃底厚度为170 µm，#1.5），并带有网格以便明确标记细胞位置。同时确保细胞呈单细胞悬液状态，且培养皿表面区域被细胞均匀覆盖。
    注意：建议使用带有压印网格的培养皿，以便再次准确定位已划分至特定细胞周期阶段的细胞。
  3. 若实验需要，向细胞培养基中添加100 nM曲古抑菌素A（TSA），并在步骤1.1所述条件下继续孵育细胞。

2. 样品制备

  1. 在测量当天，先用 1x DPBS 将细胞洗涤一次，然后在含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1x DPBS 中固定 30 分钟。
    注意：为获得可重复的结果，每次均需新鲜配制 PFA 溶液，并特别注意确保 PFA 浓度准确。
  2. 去除固定液后，用 1x DPBS 再次洗涤细胞两次，然后在含 0.4% Triton X-100 的 1x DPBS 中透化 20 分钟。
  3. 用移液器去除透化缓冲液，用 1x DPBS 进行一次额外洗涤，然后加入 RNase 混合液（在 1x DPBS 中按 1:1,000 稀释）。将细胞置于湿润腔内的 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。
  4. 通过将可被 fBALM 检测的 SYTOX Orange 原液（5 mM）在 1x DPBS 中按 1:10,000 稀释，制备染色液。
  5. 用移液器去除 RNase 缓冲液，加入染色液前再用 1x DPBS 进行一次额外洗涤。将细胞在室温下的湿润腔中孵育 5 分钟。
  6. 用移液器将 SYTOX Orange 染色液从细胞中去除，用 1x DPBS 洗涤，并将细胞保存在 1x DPBS 中，避免强光照射。

3. 细胞周期的流式细胞术测定

注意：此步骤使用了倒置高内涵筛选显微镜，但也可使用任何自动化的倒置宽场荧光显微镜。细胞核整体荧光强度可反映其DNA含量；因此，若使用共聚焦系统，需确保针孔完全打开。建议使用低数值孔径（NA）的空气物镜，而非油浸物镜。

  1. 将含有细胞的培养皿置于配备电动载物台的倒置荧光显微镜上，并使用可通过对自动拍摄的图像进行拼接来重建样品大范围区域的软件。
  2. 选择一个物镜，使其在每个视野中能够记录足够数量的细胞（总共至少900个单个细胞核[详细信息参见Roukos等19]），以便在合理时间内完成细胞周期测定的图像采集。选用在视野中心与边缘之间荧光强度差异较小的物镜。若无此类物镜，应对图像进行平场校正（见步骤7）。为遵循本方案，使用配备20x NA 0.4空气物镜、焦深 = 8 µm的宽场荧光显微镜。
  3. 在图像采集过程中，使用适用于所用荧光染料的适当滤光片覆盖培养皿中央区域。在透射光模式下采集明场图像。
    注意：明场图像对于步骤4.6中在网格上重新定位细胞至关重要。
  4. 将含有细胞的培养皿放入4 °C冰箱中，直至进行步骤4.4。
  5. 通过拼接所记录的单幅图像，重建扫描区域。
  6. 将荧光DNA染色的图像数据传输至运行开源软件CellProfiler4.2.120的计算机上。
  7. 若需对荧光图像进行平场校正，请基于所记录的图像生成该显微镜的参考图像。打开Illumination Correction.cpproj分析流程（作为补充文件1提供）；注意该流程将以一系列步骤的形式显示在屏幕上，各步骤可点击操作。将图像拖放到流程第一步images中的指定区域。
    注意：请使用窗口下部的筛选选项，确保排除列表文件中的所有非图像数据。
  8. 在照明校正流程的最后一步，点击Save Images以定义参考图像的存储位置，然后点击Analyze Images按钮。
  9. 打开分析流程CellCycleAnalysis.cpproj（作为补充文件2提供）。将步骤3.3中记录的图像（示例见图4A），包括参考图像（步骤3.8），拖放到流程第一步Images中的指定区域。
    注意：请使用窗口下部的筛选选项，确保排除列表文件中的所有非图像数据。
  10. 在流程的CorrectIlluminationApply步骤中，通过选择下拉菜单中的Select the Illumination function来指定参考图像。
  11. 在细胞周期分析流程的最后一步，定义步骤3.7中参考图像的存储位置，然后点击Analyze Images按钮，以开始批量测量步骤3.3中所记录图像内所有细胞核的积分荧光强度。
    注意：CellProfiler4.2.1将生成一个CSV格式的文本文件"CellCycleAnalysis_Nuclei.txt"，其中包含每个被测细胞核的数据（图像、对象ID、积分荧光强度、图像坐标）。
  12. 确保流程中的DisplayHistogram模块已被勾选为激活状态。
  13. 记录直方图中G1和G2 期峰的积分荧光强度（示例见图4B），并将围绕这些峰的区间输入流程中的FilteredObjects模块。通过勾选复选框激活相应流程模块。
  14. 激活相应的DisplayDataOnImage流程模块，以生成突出显示处于G1或G2期细胞的图像，并再次运行流程（示例见图4C）。
  15. 从生成图像的观察室标记区域内，选择最多五个代表目标细胞周期阶段的细胞，并尝试在SMLM显微镜上重新定位这些细胞。
    注意：由于本实验使用了两种基因组大小未知的细胞系，因此通过将人成纤维细胞系的G1峰与HeLa和C3H10T1/2细胞的G1峰进行比较，确定了其基因组大小。直方图及它们基因组大小之间的比例关系可参见补充图S1。

4. SMLM-fBALM

注意：尽管这些组合生化反应中氧气的净消耗量为零，但仍建议在未密封的培养皿中进行反应，因为有限的氧气浓度会减缓 D-葡萄糖酸-1,5-内酯的生成。D-葡萄糖酸-1,5-内酯浓度的逐渐增加会逐步降低 pH 值，这是必要的，因为 pH 值的迅速下降会改变样本的超微结构。

  1. 通过混合以下成分制备1 mL成像缓冲液：900 µL葡萄糖（1 g/mL葡萄糖溶于1×DPBS）、50 µL葡萄糖氧化酶（0.5 mg/mL溶于1×DPBS）和50 µL过氧化氢酶（40 µg/mL溶于1×DPBS）。
  2. 用移液器吸除样品中的1×DPBS，并向含有细胞的培养皿中加入1 mL成像缓冲液。
  3. 将培养皿安装到具备SMLM功能的显微镜载物台上。使用高数值孔径（NA）物镜和高光学放大倍数。
  4. 利用培养皿的坐标系统定位一个选定的细胞核（来自步骤3.15），并将其置于相机视野中心。
    注意：酶促反应需要约60–180分钟才能达到fBALM方法所需的合适pH值，从而实现适当的荧光闪烁。建议尽早安装观察用培养皿，以便为样品适应仪器温度提供充足时间，因为温度变化可能导致轴向漂移。确保在SMLM显微镜所在的房间内，测量过程中温度保持稳定。
  5. 通过调节显微镜的z轴驱动装置改变焦距，记录细胞核上下边界的位置，以确定其高度。
  6. 在不同时间点，通过增加激光功率检查fBALM过程是否产生正常的荧光闪烁。一旦样品显示出适当的随机闪烁现象，即可开始采集用于超分辨SMLM重建所需的图像序列。
    注意：用于fBALM的显微镜应配备适合激发所用荧光染料的激发激光器，并能产生足够高的光子密度，以确保每帧获得足够的光子数。在进行所有其他实验之前，应在预实验中对此进行测试。
  7. 确认fBALM过程已实现正常荧光闪烁后，开始采集图像序列，曝光时间为50 ms，获得约20 fps的帧率。
  8. 以200 nm步长在细胞核区域（围绕中段）采集z轴层扫图像，每个光学切片仅采集500帧。返回中段位置后，采集50,000帧的图像序列，以收集足够多的闪烁事件，实现高定位精度下结构细节的良好重建（此过程约需45分钟）。
    ​注意：z轴层扫对于确定DNA信号在细胞核整体中段所占比例至关重要。确保有效像素尺寸适合SMLM22，且相机上的信号不会使传感器饱和。
  9. 确保满足以下要求：
    1. 确保采集计算机具有足够的磁盘空间，因为根据16位图像的数量和大小，图像堆栈的文件体积可能相当大。
    2. 确保运行采集软件的计算机所使用的存储设备文件系统能够处理大文件（>4 GB），并且数据传输速率足够高，以便在直接将图像数据实时记录到存储设备时能顺利完成写入。
    3. 在图像采集完成后保存数据时，确保计算机配备有足够的内存（例如64 GB）。

5. 为SMLM显微镜的z轴校准准备并记录含有荧光小球的培养皿

注意：为了对显微镜的像散透镜进行适当的轴向校准，以确定光学轴方向上的正确位置，应考虑记录荧光100 nm微球的z层扫描图像。

  1. 将珠子以1:10,000的比例稀释于1×DPBS中，并将100 nm的珠子接种到用于SMLM测量的同类型培养皿上。
    注意：仅使用最优质光学性能的材料，例如#1.5盖玻片。
  2. 将校准用培养皿安装至显微镜上；记录穿过珠子焦平面的图像堆栈（总计约1.5 µm，此处使用10 nm步长）15。
  3. 将数据传输至数据分析计算机。
    ​注意：不要长期保存或使用校准载片。

6. SMLM 数据处理

注意：使用 ImageJ23 插件 "ThunderSTORM"24 对定位结果进行配准（例如，将图像序列中的闪烁斑点转换为包含定位坐标、帧编号等信息的列表）。ImageJ 或 Fiji25 可在所有主流桌面操作系统（Linux/Windows/macOS）上运行，可免费下载和使用。

  1. 要在 Fiji 中使用 ThunderSTORM，请确保在 帮助 | 更新 | 管理更新站点 中添加 Hohlbein 实验室的更新站点，勾选 Hohlbein Lab 的复选框，然后重启 Fiji。确保程序能够访问足够的内存。
    注意：图像数据需为 ImageJ/Fiji 可读的文件格式。若在标准商用系统上记录数据，可直接使用 ImageJ 的 Bio-Formats 插件（Fiji 已自带）打开数据。 本实验中，使用了 MATLAB 脚本 h52tif.m（可在本方案开头提到的 GitHub 页面获取）将自建系统以 hdf5 格式记录的数据转换为 TIFF 格式。
    1. 根据所用系统可用内存及需记录的帧数，将数据拆分为多个子堆栈，以避免内存不足。
      注意：下文将采用用于提取结果部分所示数据的设置。有关 ThunderSTORM 设置的更详细说明，请参阅在线提供的 ThunderSTORM 教程。
  2. 通过调整 ThunderSTORM 的设置，优化对闪烁信号的检测，以适应所需的记录条件。点击 ThunderSTORM | 运行分析，选择 相机设置，并输入图像数据的正确 像素尺寸、A/D 计数、所用相机的 量子效率、基线水平 和 EM 增益（本实验设置为：像素尺寸：65 nm，A/D 计数：0.64，量子效率：0.8）。
  3. 接下来，选择用于通过拟合闪烁信号确定定位坐标的算法。在 图像滤波 部分，使用 小波滤波器（B样条），设置 B样条阶数为 3，B样条尺度为 2.0。其他设置中，将 分子近似定位方法 设为 局部最大值，峰值强度阈值 设为 2*std(Wave.F1)，连通性 设为 8-邻域。在 分子亚像素定位 部分，选择 点扩散函数：积分高斯函数，拟合半径 [px]：3，拟合方法：最大似然法，以及 初始 sigma [px]：1.6。
  4. 运行插件，生成一个包含每个检测到的定位及其属性的表格，并将该表格保存至硬盘。
  5. 若需分析多个图像堆栈，或需将图像堆栈拆分为多个部分（例如，为分析大型数据集或在数据分析计算机内存有限的情况下），可通过运行宏来自动化定位检测过程。
  6. 若采集数据已被划分为多个图像堆栈，请在 ThunderSTORM 中通过依次导入文件来合并定位表格。确保在 导入 菜单中启用了 追加到当前表格 选项，并使用正确的起始编号，以避免表格中的定位被覆盖。
  7. 当完整的定位表格生成后，通过从结果表中的位置重建图像来检查结果。在 ThunderSTORM 结果 窗口中点击 可视化 按钮，等待重建图像（例如定位的直方图）出现。
  8. 检查重建图像是否存在横向漂移或其他成像伪影等问题。在 漂移 子菜单中通过计算数据堆栈分段累加后的互相关（本实验采用此方法）或使用样品中的基准标记来测量并校正漂移。点击 >> 菜单后，输入 5 个分箱 和 放大倍数（本方案中为 6.5），等待显示 x 和 y 方向漂移的窗口出现。
    注意：记录后的最初几帧图像可能仍存在较强的背景荧光（荧光分子尚未完全进入暗态），因此可能需要从分析中排除最初的几百帧图像（例如，在 ThunderSTORM 主窗口的 筛选 字段中输入 "frame >500"）。
  9. 为避免对在连续多帧中可见的信号重复计数，应对定位数据应用合并处理，合并半径应考虑平均定位精度（本实验为 20 nm），设置 1 个暗帧 和 0 最大帧数（对分子发光持续时间无上限限制）。
  10. 若仅需分析薄层光学超薄切片，应从数据集中排除焦平面以上和以下的所有定位。首先，在包含结果表的窗口中点击 绘制直方图，查找 z 方向上定位数量最多的点，然后使用筛选命令排除该点上下各 50 nm 范围内的定位：
    z > "直方图峰值" - 50 & z < "直方图峰值" + 50
  11. 为确定所记录切片中 DNA 的比例，需分析第 4.7.1 步记录的图像堆栈中每一层的定位（厚度 200 nm，每侧 100 nm）。通过选择 插件 | ThunderSTORM | 导入/导出 | 导入结果 打开堆栈的第一个定位结果表，并将每层记录的数据筛选至 200 nm。具体操作为：在 筛选字段 中输入以下命令后点击 应用：
    z > -100 & z < 100
  12. 点击 可视化，选择 直方图 选项以生成每层的图像。将生成的图像以 TIFF 格式保存至文件夹。关闭所有已打开的图像。对所有图像平面重复此操作。
  13. 打开所有切片，并使用 图像 | 堆栈 | 图像合成为堆栈 将其合并。选择 图像 | 堆栈 | Z 投影，并选择 求和 选项。在 ImageJ 中打开 ROI 管理器（分析 | 工具 | ROI 管理器）；然后，在 ImageJ 主窗口的工具栏中选择 多边形选区工具，勾勒出细胞核轮廓。在 ROI 管理器 中点击 添加。
    1. 点击 分析 | 设置测量值，选择 积分密度。点击 分析 | 测量。在 ThunderSTORM 中，如上所述打开中心平面的结果表，并在筛选字段中使用以下命令将其筛选至 厚度 为 100 nm：
      z > -50 & z < 50
  14. 如上所述生成筛选后定位的直方图，在 ROI 管理器中选中已定义的 ROI 区域，然后点击 分析 | 测量。
  15. 通过将测得的积分密度相除，计算 100 nm 厚中心切片中定位数占总定位数的比例——该比值即为第 8.2 步计算绝对 DNA 密度所需的转换因子。
    ​注意：DNA 含量与定位数量成正比。因此，为估算成像的超分辨率图像（中心切片）中 DNA 的比例，只需确定整个细胞核体积内的总定位数，以及感兴趣切片内的总定位数即可。这可通过生成定位的二维直方图实现。

7. SMLM 显微镜的 Z 轴校准

  1. 在 Fiji 中打开第 5 节记录的图像堆栈。
  2. 在 ThunderSTORM 插件菜单中，选择 3D 校准 子菜单 | 柱面透镜校准。
  3. 输入用于记录校准数据的步长（10 nm），并定义将用于校准的图像堆栈区域。
  4. 指定保存校准文件的位置。
  5. 在运行分析对话窗口中，于分子亚像素定位面板中选择PSF：椭圆高斯函数（3D 像散），并调整文件路径以指向第 5 节中生成的校准文件。

8. 泰森多边形分割

注意：一旦生成并优化了定位表，即可进入图像分析的最后一步——Voronoi 分割。此步骤使用 MATLAB 2021 完成；MATLAB 脚本是该过程的一部分 "纳米级分布定位分析仪" （LAND）软件包，可从文中的链接下载 材料表与数据记录和定位表生成类似，使用具备充足内存和处理能力的系统非常重要。本出版物中图像生成所用的系统配置为 128 GB 内存和 9 核 Intel i9 CPU。

  1. 通过运行 MATLAB 脚本 "TS2Orte.m"，将 ThunderSTORM 定位表从 .csv 格式转换为 Orte 格式，该脚本会将定位表转换为 MATLAB 矩阵，并以 ".mat" 格式保存。
  2. 数据转换为正确格式后，开始准备进行 Voronoi 镶嵌和 DNA 密度计算。通过将细胞核中的碱基对数量除以成像区域相对于体积的定位点相对数量，计算转换因子（参见步骤 6.15）。进入 LAND-Voronoi 文件夹中的 /coreAlgorithm 子文件夹，打开文件 voronoiCluster.m，并在线 13 上调整绝对密度计算所用的 转换因子。
    注意：G1 期 HeLa 细胞核的示例见 图 5；测得的转换因子为 265。
  3. 编辑启动分析的脚本 "VonoRoi.m"，调整指向 Orte 定位数据的文件路径以及结果文件的输出文件夹。在坐标列表中，指定定义 Voronoi 镶嵌计算区域的坐标。由于 Voronoi 镶嵌的计算可能耗时较长（取决于所用设备的配置），可在同一输入数据集中定义多个区域以并行计算。
  4. 运行脚本后，在输出文件夹中查找显示绝对 DNA 密度的图像，以及其他包含面积分布直方图的图表文件，以及一个名为 "densities.mat" 的文件，该文件包含每个计算出的 Voronoi 单元的密度值。

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结果

所示的 HeLa 细胞核 图5 从第3节中由CellProfiler 4.2.1生成的表格中选择，其积分荧光强度接近直方图中第一个峰 图5 代表处于G期的细胞核1 期。由于其体积较小且内部结构明显，它很可能是早期G1 有丝分裂后染色质仍处于去凝集过程中的细胞核。处于G期1 意味着DNA含量为3N（约9 × 109 bp）可用于计算（参见 补充图 S1). 由 50,000 帧组成的 fBALM 测量结果为 2.68 × 106 在100 nm厚的光学中段检测到的定位图 5A）。重建图像的定位精度为10 nm。本节中的定位点代表了高度为2.8 µm的细胞核中约0.036倍的全基因组（约321 Mbp）。这使得用于计算Voronoi细胞绝对密度的MATLAB脚本的转换系数为265。

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讨论

本文概述了如何利用单分子定位显微镜（SMLM）测量哺乳动物细胞核中的绝对DNA密度。此外，我们还展示了如何确定培养细胞的细胞周期阶段，并利用该信息估算光學超薄切片中所含DNA的量。文中还详细描述了贴壁细胞用于fBALM SMLM显微成像的制备方法，以及如何处理SMLM数据以生成细胞核内基因组DNA的超分辨率显微图像。最后，该实验方案展示了如何将SMLM数据的Voronoi图分割与成像光學切片的DNA含量估算相结合，以计算细胞核内的绝对DNA密度。

定位显微镜技术近年来作为一种研究细胞核结构的有力工具而日益受到关注，最近已被用于探讨一些重要的科学问题，例如黏连蛋白（cohesin）和BRD2对基因组可及性及其聚集倾向的影响29，以及组蛋白乙酰化在软骨迁移细胞基因组可塑性中的作用30。fBALM是一种依赖于荧光染料可逆插入DNA的成像方法，其效果高度依赖于缓冲液的pH值。因此，本实验所用成像缓冲液包含葡萄糖（作为底物）以及两种酶：葡萄糖氧化酶（可将β-D-葡萄糖和氧气代谢为D-葡萄糖酸-1,...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 Sandra Ritz 博士允许我们使用 IMB 成像核心设施，感谢 Shih-Ya Chen 博士允许我们使用她自行搭建的单分子定位显微镜，感谢 Leonard Kubben 博士（IMB）提供人成纤维细胞，感谢 Christof Niehrs 博士（IMB）提供 C3H10T1/2 细胞系，以及感谢 Jan Neumann 博士提供的 MATLAB 脚本，我们已针对本研究对其进行了修改。我们还要感谢 Marion Cremer 博士、Thomas Cremer 博士和 Christoph Cremer 博士富有成效的讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞培养
µ-Dish 35 mm, high Grid-500 玻璃底培养皿Ibidi81168
C3H 10T1/2IMB (Niehrs 实验室)
DMEMThermoFisher12320032
dPBSThermoFisher14190144
FBSLife Technologies16000-044
HeLa显微成像核心设施 (IMB)
HFBIMB (Kubben 实验室)
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG7513
用于 HFB 的非必需氨基酸和维生素
丙酮酸钠S8636
样品制备
过氧化氢酶Merck2593710
葡萄糖ThermoFisher241922500
葡萄糖氧化酶Merck49180
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
RNase 混合酶ThermoFisherAM2286
SYTOX OrangeThermoFisherS11368
TetraSpeck 荧光微球样品试剂盒ThermoFisherT7284
Triton X-100ThermoFisher327372500
软件
BioFormatsOpenMicroscopy.org开源软件 https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1CellProfiler.org开源软件 https://cellprofiler.org
FiJInih.gov开源软件 https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
LANDnih.gov开源软件 https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021Math Works商业软件 - 需要 "图像处理工具箱"
R v.4.0.3r-project.org开源软件 https://www.r-project.org
ThunderSTORM v1.3开源软件 https://zitmen.github.io/thunderstorm/
显微镜：
AF 7000Leica
Leica GSDLeica
SMLM 显微镜Cremer 实验室由陈思远博士定制搭建

参考文献

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