使用单分子定位显微镜绘制细胞核中绝对 DNA 密度

Summary

本协议描述了一种使用单分子定位显微镜数据、已知体积、基因组大小和细胞周期阶段的Voronoi细分来测量贴壁细胞核内绝对DNA密度的方法。

Abstract

在细胞核内，沉默基因通常位于称为异染色质的高密度染色质区域，而活性基因主要位于染色质和称为常染色质的染色质间隙之间的界面。目前，真染色质和异染色质的表征主要基于组蛋白沿DNA序列的表观遗传修饰，而对整个细胞核的绝对DNA密度及其功能意义知之甚少。仅基于生化数据和染色质作为聚合物性质的假设的细胞核模型仍然与高分辨率显微镜生成的成像数据有根本的不同。这表明仍然缺少重要的结构相关信息。我们认为空间限制可能与基因调控有关，因此开发了一种方法，通过Voronoi细分将超分辨率定位数据转换为真实比例的密度图，从而测量哺乳动物细胞核中的绝对DNA密度。

Introduction

自细胞生物学早期以来，细胞核——遗传信息的所在地——就让生物学家着迷。在应用自主开发的细胞学染色方法后，Emil Heitz 于 1928 年发现了细胞核内不同、强烈染色的区域¹。他将染色更强烈、密度较高的区域称为“异染色质”，而他将染色强度较低、密度较低的区域命名为“常染色质”。随着时间的推移，很明显，活性基因主要位于常染色质中，而较密集的区域则发现富含重复元素和沉默基因。异染色质和常染色质这两个术语一直流传至今，尽管它们的定义已从结构特性变为分子特性（见下文）。今天我们知道细胞核分为两个主要阶段。一种液体（染色质间室），容纳核体、剪接室和核质，另一种固体、水凝胶状染色质结构域，包括染色体区域和核仁²。在染色质间空间的界面处，染色质密度较低，这是转录、复制和修复等遗传活性过程主要发生的地方 ^3,4,5，而在薄片附近，核仁周围和着丝粒附近，染色质显示出高压实水平，并且通常转录相当不活跃⁶。

在分子水平上，染色质是由包裹在核小体（核心组蛋白的八聚体）周围的 DNA 构建的。组蛋白具有内在无序的尾结构域，可以通过添加几个化学基团（甲基-、乙酰基、磷-、生物素）、氨基酸（精氨酸）甚至蛋白质（SUMO、泛^素）7 进行翻译后修饰。这些修饰可以被读取并吸引其他蛋白质（例如，染色质重塑蛋白，HP1，修复蛋白，RNA），从而定义DNA序列的生理状态（转录允许/限制），而无需直接改变其序列（因此是“表观”遗传）⁷。围绕特定序列的修饰类型和数量在细胞类型之间可能存在很大差异，是可逆的，并且可以在整个发育、衰老和疾病过程中发生变化 ^8,9,10。组蛋白尾部的修饰在高度转录的区域更为普遍，而修饰则在基因组中转录活性很少或没有转录活性的区域中占主导地位。

例如，富含 H3K4 修饰或组蛋白尾部乙酰化的高转录区域通常被描述为常染色质，而富含抑制性组蛋白修饰的区域（H3K9me3、H3K27me3 或 H4K20me3）被称为异染色质，进一步分为组成型异染色质（在所有细胞中转录无活性）（例如，H4K20me3）和兼性异染色质（根据细胞类型沉默的染色质， 例如，H3K27me3）⁶。尽管生化和分子生物学方法非常适合测量序列水平的化学变化，但使用它们来描述中尺度的空间特性更具挑战性。

例如，已经尝试使用来自Hi-C实验的邻近信息来重建基因组¹¹的空间模型，该信息检测和绘制序列区域之间DNA的接近程度。然而，与高分辨率光学和电子显微镜图像的直接比较表明，这只能在有限的范围内实现（图1）。尽管 Hi-C¹² 等方法可以将间期细胞中的染色体区域作为单独的实体正确检测，但这些模型相当“近视”，因为仅靠 DNA 序列接近性无法反映基因组更远部分之间的空间关系，因此不太适合正确的 3D 基因组重建。因此，密度差异也无法通过接触频率信息正确反映。这导致细胞核中基因组的“意大利面条化”表示（见 图 1B），这似乎发生在一个羊毛状、可自由访问的环球中。

为了将生化信息与生物物理和结构数据相结合，为核的综合、更真实的图景铺平道路，需要开发能够生成有关核组织不同方面的数据的方法。直到最近，从成像数据中确定细胞核中的绝对 DNA 密度也一直很困难。其原因是传统光学显微镜的分辨率有限，电子显微镜对DNA进行特异性染色的问题，以及电子显微镜的观察体积小。

传统荧光显微镜的分辨率受到光衍射的限制。点光源的图像由于衍射极限而扩散，可以用 点扩散函数 （PSF） 来描述。根据PSF，荧光团的图像可以很好地近似地被视为点光源，在其起源源（荧光团）¹³周围占据一定大小的体积。当许多彼此距离远近于其衍射极限图像尺寸的荧光团同时被激发时，成像的强度分布会叠加，并且无法解析单个荧光团的位置。荧光团的顺序随机光发射（闪烁）允许对单个分子进行光学隔离，从而通过确定其信号的强度重心来找到它们的确切位置。

这可用于通过从许多记录图像中积累荧光团定位数据来重建样品的结构信息。这种方法通常称为单分子定位显微镜（SMLM）（有关更多信息，请参见¹⁴）。荧光团在其“定时”期间发出的光子越多，确定强度重心的强度就越高。光束路径中的散光透镜将光学焦平面上方或下方的荧光团信号转换为椭圆，可用于确定它们沿光轴的位置。与源自焦平面上方荧光团的椭圆轴相比，源自焦平面下方荧光信号的椭圆的长轴旋转 90°。此外，这些椭圆的轴比允许确定分子在±300^nm15的范围内沿光轴相对于焦平面的位置。

通过重建随机闪烁事件生成的超分辨率图像的质量在很大程度上取决于标记密度和闪烁事件的数量。后者取决于荧光团的光稳定性和它们最终失效之前的闪烁事件的数量（开/关循环次数）。这里描述的获得核内DNA分布超分辨率图像的方法称为fBALM（DNA结构波动辅助结合激活定位显微镜）。它基于瞬时插入核酸的荧光团，只有在它们与 DNA^16,17 结合后才会发出荧光。由于其荧光二酯主链的带电残基，DNA 是一种带高负电荷的聚合物。活细胞中互补 DNA 链的稳定需要通过带正电的蛋白质（例如组蛋白）和离子进行中和。通过降低pH值，碱基互补配对的稳定性降低，以允许插层染料扩散进出^16,17。

根据插层荧光染料的不同，可以在一定的pH范围内达到这种状态。YoYo-1 和 SYTOX Orange 等荧光染料仅在与 DNA 结合时才会发出荧光，并且由于插层染料（与结合 DNA 小沟的染料（如 Hoechst 和 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]）通常以不依赖序列的方式结合，因此它们非常适合通过定位显微镜绘制细胞核内 DNA 的分布图。

Voronoi 细分是一种数学方法，允许根据点的位置将空间细分为不同的分区。在 2D-Space 中，生成的图块的大小反映了点¹⁸ 密度的倒数。由于定位显微镜将图像重建为一组代表荧光团位置的点，因此 Voronoi 细分可以帮助确定定位信号的密度（图 2）。因此，使用 DNA 特异性染料作为荧光团可以测量 DNA 密度。

对 DNA 含量（碱基对数）和细胞核空间维度的先验知识允许将相对 DNA 密度转换为绝对 DNA 密度。以下协议显示了使用SMLM以非常高的分辨率绘制贴壁细胞中绝对DNA密度的图谱，并证明这些密度会发生很大的变化。

Protocol

注意： 图 3 概述了本节中描述的工作流程。有关本协议中使用的试剂、材料、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表 。用于此出版物的代码可在此处查看和下载：https://github.com/irradiator/Mapping-absolute-DNA-density-in-cell-nuclei-using-SMLM-microscopy。

1. 细胞培养

1. 在补充有 10% 胎牛血清的 DMEM 中在补充有 5% CO₂ 的加湿气氛中，在 37°C 下培养 C3H10T1/2、HFB 和 HeLa 细胞。当细胞接近汇合时，分别以 1：3（C3H10T1/2，HFB）和 1：10（HeLa）的比例分裂细胞来传代培养。
2. 在进行测量的前一天，将指数生长培养物的细胞接种到35毫米网格培养皿上。确保观察天为荧光显微镜（厚度为170μm的玻璃底，#1.5）提供出色的光学质量，并具有明确定位细胞的网格。还要确保细胞处于单细胞悬浮液中，并且培养皿表面的整个区域都均匀地覆盖着细胞。
   注意：建议使用带有印记网格的培养皿，以再次找到分配给特定细胞周期阶段的确切细胞。
3. 如果实验需要，将 100 nM 曲霉抑素 A （TSA） 添加到细胞培养基中，并在步骤 1.1 中先前描述的条件下孵育细胞。

2. 样品制备

1. 在测量当天，用 1x DPBS 洗涤细胞一次，然后将它们固定在 1x DPBS 中的 4% 多聚甲醛 （PFA） 中 30 分钟。
   注意：为了获得可重复的结果，请确保每次都制备新鲜的 PFA 溶液，并特别注意 PFA 浓度准确。
2. 去除固定剂后，用 1x DPBS 再次洗涤细胞 2 次，然后在含有 0.4% Triton X-100 的 1x DPBS 中透化 20 分钟。
3. 用移液器去除透化缓冲液，并用 1x DPBS 执行额外的洗涤步骤，然后用 RNase 混合物（在 1x DPBS 中稀释 1：1,000）处理细胞。将细胞置于加湿室中以37°C的培养箱中30分钟。
4. 通过稀释具有 fBALM 功能的 SYTOX Orange 储备溶液（5 mM 在 1x DPBS 中，1：10,000 稀释度）来制备染色溶液。
5. 使用移液器去除 RNase 缓冲液，并在添加染色溶液之前使用 1x DPBS 进行额外的洗涤步骤。将细胞在室温下在加湿室中孵育5分钟。
6. 用移液器从细胞中取出 SYTOX Orange 染色溶液，用 1x DPBS 洗涤，并将细胞储存在 1x DPBS 中，避免强光照射。

3. 细胞术细胞周期测定

注意：对于此步骤，此处使用倒置高内涵筛选显微镜，但可以使用任何自动化的逆宽场荧光显微镜。整个细胞核的强度是其 DNA 含量的量度;因此，如果使用共聚焦系统，请确保完全打开针孔。低数值孔径 （NA） 物镜比油浸物镜更可取。

1. 将装有细胞的培养皿放在配备电动载物台和软件的逆荧光显微镜上，该显微镜通过将自动记录的图像拼接在一起来重建样品上的大面积区域。
2. 选择一个物镜，每个视场可以记录足够的细胞（总共至少900个单核[有关详细信息，请参阅Roukos^等人]），以便在合理的时间内进行细胞周期测定的图像采集。使用中心和边界之间强度差异不大的镜头。如果没有这样的镜头，请对图像应用平场校正（参见步骤 7）。要遵循此协议，请使用配备 20x NA 0.4空气透镜 的广视场荧光显微镜， 焦深= 8μm。
3. 在图像采集过程中，使用适合所用荧光团的滤光片覆盖培养皿的中心区域。在透射光模式下拍摄明场图像。
   注意：明场图像对于步骤4.6中网格上细胞的重新定位很重要。
4. 将装有细胞的培养皿放入4°C的冰箱中，直到步骤4.4。
5. 通过将记录的单张图像平铺在一起，从单个图像中重建扫描区域。
6. 将荧光DNA染色剂的图像数据传输到运行开源软件CellProfiler4.2.1²⁰的计算机上。
7. 如果需要对荧光图像进行平场校正，请从记录的图片中生成所用显微镜的参考图像。打开 Illumination Correction.cpproj 管道（作为 补充文件 1 包含）;请注意，管道在屏幕上显示为一个序列，可以在其中单击不同的步骤。将图像拖放到管道第一步 图像 中的指定字段中。
   注意：确保使用窗口下部的过滤器选项排除列出文件中的所有非图像数据。
8. 在光照校正管线的最后一步中，单击 “保存图像” 以定义参考图像的存储位置，然后单击“ 分析图像 ”按钮。
9. 打开管道 CellCycleAnalysis.cpproj （作为 补充文件 2 包含在内）。将步骤 3.3 中记录的图像（见 图 4A 作为示例），包括参考图像（步骤 3.8），拖放到第一步管道的 图像 中的指定字段中。
   注意：确保使用窗口下部的过滤器选项排除列出文件中的所有非图像数据。
10. 在管道的 CorrectIlluminationApply 步骤中，通过选择 Select the Illumination 函数，在下拉菜单中选择参考图像。
11. 在细胞周期分析管道的最后一步中，定义在步骤 3.7 中存储参考图像的位置，然后单击“ 分析图像” 按钮开始批量测量步骤 3.3 中记录的图像中所有细胞核的积分荧光强度。
    注意：CellProfiler4.2.1将生成一个文本文件“CellCycleAnalysis_Nuclei.txt”，其中包含CSV格式的每个测量细胞核的数据（图像，ObjectID，积分荧光强度，图像坐标）。
12. 确保管道的 DisplayHistogram 元素已选中为活动。
13. 注意 G₁ 和 G₂ 峰的直方图中的积分荧光强度（参见 图 4B 作为示例），并将它们周围的间隔输入到管道的 FilteredObjects 元素中。通过单击复选框激活管道元素。
14. 激活相应的 DisplayDataOnImage 管道元素以生成突出显示 G₁ 或 G₂ 阶段单元格的图像，并再次运行管道（参见 图 4C 作为示例）。
15. 从观察室标记区域的生成图像中选择最多五个代表所需细胞周期阶段的细胞，并尝试在SMLM显微镜上重新定位细胞。
    注意：由于此处使用了两种基因组大小未知的细胞系，因此通过将人成纤维细胞系的G₁ 峰与HeLa和C3H10T1/2细胞的G₁ 峰进行比较来确定基因组大小。直方图及其基因组大小之间的比例关系可以在 补充图S1中查看。

4. SMLM-fBALM

注意：虽然这些组合生化反应中的氧气净和为零，但建议在未密封的培养皿中进行反应，因为有限的氧气浓度会减慢 D-葡萄糖酸-1,5-内酯的产生。D-葡萄糖酸-1,5-内酯浓度的增加会逐渐降低pH值，这是必要的，因为立即降低pH值会改变样品的超微结构。

1. 通过混合以下成分制备 1 mL 成像缓冲液：900 μL 葡萄糖（1x DPBS 中的 1 g/mL 葡萄糖）、50 μL 葡萄糖氧化酶（1x DPBS 中的 0.5 mg/mL）和 50 μL 过氧化氢酶（1x DPBS 中的 40 μg/mL）。
2. 使用移液器从样品中取出 1x DPBS，并将 1 mL 成像缓冲液加入含有细胞的培养皿中。
3. 将培养皿安装到支持 SMLM 的显微镜的载物台上。使用高数值孔径物镜和高光学放大倍率。
4. 使用碟形天线的坐标系找到所选原子核之一（从步骤 3.15 中），并将其置于相机视野的中心。
   注意：酶促反应需要~60-180分钟，直到达到fBALM方法的正确pH值并促进适当的眨眼。建议尽快安装观察盘，以便为样品提供足够的时间适应仪器的温度，因为温度变化会导致轴向漂移。确保在整个测量过程中容纳 SMLM 显微镜的房间内的温度稳定。
5. 通过使用显微镜的 z 驱动改变焦点并记录上限和下限的位置来确定细胞核的高度。
6. 在不同的时间点，通过增加激光功率来检查 fBALM 过程产生的正确闪烁。一旦样本显示出适当的随机闪烁，就开始采集重建超分辨率 SMLM 所需的图像系列。
   注意：用于fBALM的显微镜应配备适合激发所用荧光团的激发激光器，并且可以产生足够高的光子密度以确保每帧有足够的光子计数。在所有其他实验之前，先在试点实验中测试这一点。
7. 一旦确保 fBALM 进程正确闪烁，即可使用 50 ms 的曝光时间开始采集图像系列，从而获得 ~20 fps 的帧速率。
8. 以 200 nm 步长间隔和每个光光学部分仅 500 帧穿过原子核（中间部分）的 z 堆栈。回到中间部分，拍摄 50,000 帧的图像系列，以收集足够的闪烁事件，以便以高定位精度很好地重建结构细节（这将需要 ~45 分钟）。
   注意：z-stack对于确定DNA信号的中间部分相对于整个细胞核的分数很重要。确保有效像素大小非常适合 SMLM²² ，并且相机上的信号不会使传感器饱和。
9. 确保满足以下要求
   1. 确保采集计算机包含足够的磁盘空间，因为根据 16 位图像的数量和大小，图像堆栈的文件大小可能会变得非常大。
   2. 确保运行采集软件的计算机能够处理所用存储设备上能够处理大文件大小（>4 GB）的文件系统，并且在直接将图像数据记录到存储设备时，到存储设备的传输速率足够高，可以实时写入文件。
   3. 图像采集后保存数据时，请确保计算机配备足够的 RAM（例如 64 GB）。

5. 准备和记录带有荧光珠的培养皿，用于 SMLM 显微镜的 z 校准

注意：为了正确校准显微镜的散光透镜以沿光轴分配正确的位置，应考虑记录荧光 100 nm 珠的 z 堆栈。

1. 在 1x DPBS 中以 1：10,000 的比例稀释珠子，并将 100 nm 珠子接种到用于 SMLM 测量的相同类型的培养皿上。
   注意： 仅使用最佳光学质量和规格，例如 #1.5 盖玻片。
2. 将校准皿安装到显微镜上;通过磁珠的焦平面记录图像堆栈（总共~1.5μm;此处使用的10nm步长）¹⁵。
3. 将数据传输到数据分析计算机。
   注意： 请勿长时间存放和使用校准载玻片。

6. SMLM数据处理

注意：ImageJ²³ 插件“ThunderSTORM”²⁴ 用于注册定位（例如，将图像堆栈中的闪烁点转换为包含定位坐标，帧号等的列表）。ImageJ 或 Fiji²⁵ 可在所有主要桌面作系统（Linux/Windows/macOS）上运行，可以免费下载和使用。

1. 要在斐济语中使用 ThunderSTORM，请务必在 HELP |更新 |管理更新站点，选中 Hohlbein 实验室的复选框，然后重新启动斐济。确保程序可以访问足够的内存。
   注意：图像数据需要采用 file ImageJ/Fiji 可以读取的格式。在标准商业系统上记录数据时，请使用 ImageJ 的 Bio-Formats 插件（斐济自动附带）直接打开数据。在本例中，使用MATLAB脚本h52tif.m（在协议开头提到的GitHub页面上提供）将我们的自定义设置记录的数据从hdf5格式转换为TIFF格式。
   1. 根据所用系统上可用的内存量和要记录的帧数，将数据拆分为多个子堆栈以避免内存不足。
      注意：在下文中，将使用用于提取结果部分中显示的数据的设置。有关 ThunderSTORM 设置的更详细说明，请参阅 ThunderSTORM 教程，该教程可以在线找到。
2. 通过根据所需的录制条件调整 ThunderSTORM 设置来优化闪烁信号检测的设置。点击 ThunderSTORM |运行分析，选择 相机设置 ，然后输入图像数据的正确 像素大小 、 A/D 计数、所用相机的 量子效率 、 基本电平和 EM 增益 （对于此设置， 像素大小：65 nm，A/D 计数：0.64，量子效率：0.8）。
3. 接下来，选择算法通过拟合闪烁信号来确定定位坐标。在“图像过滤”部分中，使用具有 B 样条阶数 3 和 B 样条比例 2.0 的小波滤波器（B 样条）。对于其他设置，将“分子近似定位方法”设置为“局部最大值”，将“峰强度阈值”设置为 2*std（Wave.F1），将“连通性”设置为“8 邻域”。在分子的子像素定位部分中，选择 PSF：积分高斯、拟合半径 [px]：3、拟合方法：最大似然和初始 sigma [px]：1.6。
4. 运行插件以创建一个表，其中包含检测到的每个本地化及其属性的条目。将表保存到硬盘驱动器。
5. 如果需要分析多个图像堆栈或必须将图像堆栈拆分为多个堆栈（例如，为了允许分析大型数据集或数据分析计算机中没有太多可用内存），请通过运行宏自动进行定位检测。
6. 如果采集数据必须分区到多个图像堆栈中，请通过导入一个文件一个文件来连接 ThunderSTORM 中的本地化表。确保“导入”菜单中的“追加到当前表”选项已激活，并且使用正确的起始编号以避免覆盖表中的本地化。
7. 生成完整的定位表后，通过从结果表中的位置重建图像来检查结果。按 ThunderSTORM 结果窗口中的 可视化 按钮，等待重建的图像（例如，定位的直方图）出现。
8. 检查重建的图片是否存在横向漂移和其他成像伪影等问题。通过确定数据堆栈的总和子部分（此处使用）的互相关性或在样本中使用基准标记，在“ 漂移 ”子菜单中测量和校正漂移。按下 >> 菜单后，输入 5 个箱 和 放大倍数 （本协议中为 6.5 ）。等待一个窗口出现，显示 x 和 y 漂移。
   注意：记录后的第一张图像可能仍会受到强烈背景荧光的影响（同时使荧光团进入暗状态）;因此，可能需要从分析中排除前几百张图像（例如，在 ThunderSTORM 主窗口的过滤器字段中键入“frame >500”）。
9. 为避免在多个连续帧中可见的信号过多计算，请使用考虑平均定位精度（此处为 20 nm ）、 1 个暗帧和 0 个最大帧 （对分子的最大导通时间没有限制）的半径对定位数据进行合并。
10. 如果只需要分析薄光光学超薄切片，请从数据集中排除焦平面上方和下方的所有定位。首先，通过在包含结果表的窗口中按“ 绘制直方图 ”来查找 z 中包含最多定位的点，然后使用过滤命令丢弃该点上方和下方 50 nm 的定位：
    z > “直方图峰值” - 50 & z < “直方图峰值” + 50
11. 为了确定记录切片中DNA的分数，请确定步骤4.7.1中记录的图像堆栈每个平面的定位（厚度200nm;每侧100nm）。通过选择插件打开堆栈的第一个本地化结果表 |雷霆风暴 |导入/导出 |导入结果并将每个记录的切片过滤至 200 nm。为此，请在过滤器字段中键入后单击“应用”：
    Z > -100 & Z < 100
12. 单击 “可视化” 并选择“ 直方图 ”选项以生成每个切片的图像。将生成的图像以 TIFF 格式保存在文件夹中。关闭所有打开的图像。对所有图像平面重复此作。
13. 打开所有切片并使用 Image |堆栈 |要堆叠的图像。选择图片 |堆栈 |Z-Project 并选择“总和”选项。在 ImageJ 中打开 ROI 管理器（分析 |工具 |ROI-经理）;然后，从 ImageJ 主窗口的 ImageJ 工具栏中选择多边形选择工具并勾勒出核心的轮廓。单击 ROI-Manager 中的添加。
    1. 单击分析 |设置测量值并选择积分密度。单击分析 |测量。在 ThunderSTORM 中，如上所述打开中心平面的结果表，并在滤波器字段中使用以下命令将其滤波到 100 nm 的厚度：
       z > -50 和 z < 50
14. 如上所述生成过滤后的本地化的直方图，通过在 ROI 管理器中选择定义的 ROI 来激活它，然后单击 Analyze |测量。
15. 通过除以测量的积分密度（步骤8.2中计算绝对DNA密度所需的转换系数），确定100nm厚的中间部分中定位相对于定位总数的比例。
    注意：DNA含量与定位数量成正比。因此，要估计成像的超分辨率图像（中间部分）中的 DNA 分数，只需确定整个细胞核体积中的定位总数并确定感兴趣部分的定位总数就足够了。这可以通过生成定位的 2D 直方图来实现。

7. SMLM显微镜的Z校准

1. 在斐济打开第 5 节中记录的图像堆栈。
2. 在 ThunderSTORM 插件菜单中，选择 3D 校准 子菜单 |柱面透镜校准。
3. 输入用于记录校准数据的 步长 （10 nm）并定义将用于校准的 图像堆栈区域 。
4. 指定保存校准文件的位置。
5. 通过在分子的子像素定位面板中选择 PSF：椭圆高斯（3D 散光）并调整第 5 节中创建的校准文件的文件路径，在“运行分析”对话框窗口中使用校准数据。

8. 沃罗诺伊镶嵌

注意：生成并修饰定位表后，继续进行图像分析的最后一步 - Voronoi 细分。此步骤使用 MATLAB 2021;MATLAB 脚本是“纳米级分布定位分析仪”（LAND） 软件包的一部分，可从 材料表中的链接下载。与数据记录和本地化表的生成类似，使用配备强大的内存和处理能力的系统非常重要。用于为本出版物生成图像的系统配备了 128 GB 的 RAM 和 9 核 Intel i9 CPU。

1. 通过运行 MATLAB 脚本“TS2Orte.m”，将 ThunderSTORM 定位表从 .csv 格式转换为 Orte 格式，该脚本将定位表转换为 MATLAB 矩阵并将其保存为“.mat”格式。
2. 一旦数据格式正确，就开始准备 Voronoi 细分和 DNA 密度计算。通过将细胞核中的碱基对数除以成像部分中相对于体积的相对定位数来计算转换因子（参见步骤 6.15）。进入 LAND-Voronoi 文件夹和 /coreAlgorithm 子文件夹，打开文件 voronoiCluster.m 并调整第 13 行绝对密度计算的 换算系数 。
   注意：有关G₁ HeLa细胞核的示例，请参见图5;测量的转换系数为 265。
3. 编辑启动分析“VonoRoi.m”的脚本。调整 Orte 本地化数据的文件路径和结果文件的输出文件夹。在坐标列表中，指定定义应在其中进行细分的区域的坐标。由于 Voronoi 细分的计算可能需要很长时间（取决于所用机器的规格），因此在同一输入数据集中定义要计算的多个区域。
4. 运行脚本后，查找显示绝对 DNA 密度的图像以及其他文件，其中包含显示面积分布直方图的图表和包含输出文件夹中每个计算出的 Voronoi 细胞密度的“densities.mat”文件。

Results

图5所示的HeLa细胞核是从第3节中CellProfiler4.2.1生成的表格中选择的，其积分荧光强度接近图5所示直方图中的第一个峰，该峰代表_G1相中的细胞核。鉴于其体积小且内部结构明显，它很可能是早期的 G₁ 细胞核，有丝分裂后仍处于去凝结染色质的过程中。位于 G₁ 中意味着可以假设 DNA 含量为 3N（~9 × 10⁹ bp）进行计算（参见补充图 S1）。由 50,000 帧组成的 fBALM 测量结果在 100 nm 厚的光学中段内检测到 2.68 ×^{10 6} 个定位（图 5A）。重建图像的定位精度为10 nm。本节中的定位代表 2.8 μm 高细胞核 （~321 Mbp） 中全基因组的 ~0.036 个。这导致计算 Voronoi 单元绝对...

Discussion

本文概述了如何使用SMLM测量哺乳动物细胞核中的绝对DNA密度。此外，我们还演示了如何确定培养细胞的细胞周期阶段，以及如何利用这些信息来估计光光学超薄切片中存在的DNA量。还详细描述了用于 fBALM SMLM 显微镜的贴壁细胞的制备，以及如何处理 SMLM 数据以生成细胞核中基因组 DNA 的超分辨率显微图像。最后，该协议展示了如何将SMLM数据的Voronoi细分与成像光光学切片的DNA估计相结合，以计算细胞核内的绝对DNA密度。

定位显微镜最近作为研究核结构的有力工具而广受欢迎，最近被用于解决有趣的问题——粘连蛋白和BRD2对基因组可及性及其聚类趋势的影响²⁹ 或组蛋白乙酰化对通过软骨迁移的细胞基因组可塑性的影响³⁰.fBALM 是一种依赖于荧光染料可逆嵌入 DNA 的方法。这在很大程度上取决于缓冲液的 pH 值。因此，这里使用的成像缓冲液由葡萄糖（作为底物）和葡萄糖氧化酶组成，葡萄糖氧化酶将β-D-葡萄糖和氧气代...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>细胞培养
µ-碟形35毫米，高格栅500玻璃底	伊比迪	81168
C3H 10T1/2	IMB（尼尔实验室）
DMEM	热扑鱼	12320032
dPBS	热扑鱼	14190144
FBS	生命科技	16000-044
HeLa	显微镜核心设施（IMB）
高频	IMB（库本实验室）
左旋谷氨酰胺	西格玛-奥尔德里奇	G7513
非必需氨基酸和维生素用于HFB
丙酮酸钠	S8636
<强>样品准备
过氧化氢酶	默 克	2593710
葡萄糖	热扑鱼	241922500
葡糖氧化酶	默 克	49180
对甲醛	西格玛-奥尔德里奇	158127
RNase鸡尾酒	热扑鱼	AM2286
SYTOX 橙色	热扑鱼	S11368
TetraSpeck 荧光微球采样套件	热扑鱼	T7284
特里顿 X-100	热扑鱼	327372500
<强>软件
生物格式	OpenMicroscopy.org		开源软件 https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/
CellProfiler v4.2.1	CellProfiler.org		开源软件 https://cellprofiler.org
斐济	nih.gov		开源软件 https://imagej.net/software/fiji/?Downloads
土地	nih.gov		开源软件 https://github.com/Jan-NM/LAND
MatLab 2021	数学著作		商业软件 - 需要“图像处理工具箱”
R第4条......0.3	r-project.org		开源软件 https://www.r-project.org
雷暴 v1.3			开源软件 https://zitmen.github.io/thunderstorm/
<强>显微镜：
AF 7000	徕卡
徕卡GSD	徕卡
SMLM 显微镜	克雷默实验室		由S-Y博士定制建造。陈