方法文章

大豆共生根瘤中多聚核糖体的纯化

DOI：

10.3791/64269

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2022年7月1日

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1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, 2Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology, University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

本文内容

摘要

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本方案描述了一种从完整大豆根瘤中纯化真核多聚核糖体的方法。测序后，可使用标准的基因表达分析流程，鉴定转录组和翻译组水平上差异表达的基因。

摘要

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本实验方案旨在提供一种研究大豆（Glycine max）共生根瘤中真核生物转译组的策略。本文描述了优化的方法，用于分离植物来源的多核糖体及其相关mRNA，并通过RNA测序进行分析。首先，在保持多核糖体和RNA完整性的条件下，通过对整块冷冻的大豆根瘤进行匀浆，获得细胞质裂解物。随后，通过低速离心清除裂解物中的杂质，取上清液的15%用于总RNA（TOTAL）的提取。剩余的澄清裂解物则用于通过两层蔗糖垫（12% 和 33.5%）超速离心分离多核糖体。多核糖体沉淀经重悬后，提取与其结合的mRNA（PAR）。TOTAL和PAR均通过高灵敏度毛细管电泳进行质量评估，以确保达到RNA-seq测序文库的质量标准。作为下游应用的一个示例，在测序完成后，可使用标准的基因表达分析流程，获得转录组和转译组水平上的差异表达基因。总之，该方法结合RNA-seq技术，可用于研究共生根瘤等复杂组织中真核mRNA的翻译调控过程。

引言

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豆科植物（如大豆（Glycine max））能够与一类称为根瘤菌的特定土壤细菌建立共生关系。这种互利共生关系会诱导植物根部形成一种新的器官——共生根瘤。根瘤是容纳细菌的植物器官，其内部由宿主细胞组成，细胞质中定殖着一种特化的根瘤菌形态，即类菌体。这些类菌体能够催化大气中的氮气（N2）还原为氨，并将氨转移给植物，以换取碳水化合物1,2。

尽管这种固氮共生关系是研究最为深入的植物-微生物共生关系之一，但仍有许多方面有待进一步阐明，例如植物在不同非生物胁迫条件下如何调节其与共生伙伴的相互作用，以及这种调节如何影响根瘤的代谢过程。通过分析根瘤的翻译组（即正在被活跃翻译的信使RNA [mRNAs] 子集），可更深入地理解这些过程。多核糖体或多聚核糖体（polysomes）是与mRNA结合的多个核糖体形成的复合物，常用于翻译研究3。多聚核糖体分析法旨在分析与多聚核糖体结合的mRNAs，已成功用于研究在多种生物学过程中调控基因表达的转录后机制4,5。

传统上，基因组表达分析主要集中在确定 mRNA 的丰度

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方案

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1. 植物培养与根瘤菌接种

  1. 为获得所需的根瘤，选择适宜的基质，在生长室的受控条件下播种大豆种子。
    注意：本实验方案中，将种子播种于装有沙子与蛭石混合物（1:1）的 0.5 L 塑料瓶中。生长室设置昼夜温度分别为 28 °C /20 °C，光照与黑暗光周期分别为 16 h/8 h。光合有效辐射强度为 620 µmol·m−2·s−1。
  2. 提前配制液体酵母提取物甘露醇（YEM）培养基（见材料表），并进行高压灭菌。
  3. 在播种当天，将 Bradyrhizobium elkanii U1302 菌株接种至含有 100 mL YEM 培养基的三角瓶中，在 28 °C、100 rpm 的振荡条件下培养。
    1. 让根瘤菌生长 2 天后，取 2 mL 菌液接种幼苗。

2. 水分亏缺处理（可选）

注意：本方案概述了对大豆植株进行水分亏缺处理的方法。根据具体的研究问题，该部分内容可作相应修改或完全省略。

  1. 将大豆幼苗在无水分限制条件下培养19天（V2-3发育阶段）。用B保持基质处于田间持水量&D培养基

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结果

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采用上述方法纯化的总RNA（TOTAL）和多聚腺苷酸化RNA（PAR）组分的产量与质量评估是判断实验成功与否的关键，因为对于大多数后续应用（如RNA测序）而言，高质量的样品是文库构建和测序的基础。此外，RNA分子的完整性能够真实反映样本采集时刻的基因表达谱状态18。在此背景下，使用生物分析仪（Bioanalyzer）进行检测时可获得RNA完整性数值（RIN）。RIN可用于以稳健、可靠且不受操作者主观影响的方式对RNA完整性进行评分，评分范围从10（完整）到1（完全降解）18。

图2A、B展示了高灵敏度毛细管电泳系统（Bioanalyzer）对多个TOTAL和PAR样品组分的标准输出结果。所有样品均表现出非常好的质量，因为可以清晰地观察到锐利的核糖体RNA（rRNA）条带，无任何拖尾现象。然而，这一结果并未反映在RIN值上，其范围在5.9至7.5之间，对应于非完整RNA样品。尽管如此，如

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讨论

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在转译水平上研究基因表达调控对于深入理解各种生物学过程至关重要，因为细胞基因表达的最终产物是蛋白质的丰度13,14。可通过分析特定组织或生物体的转译组来实现这一目标，其中需纯化多聚核糖体组分，并分析其结合的mRNA3,4,34,35,36。

本文介绍了一种通过蔗糖垫纯化大豆共生根瘤多聚核糖体的方法，并随后进行TOTAL和PAR提取。该方案的一个关键点在于可同时获得两种RNA组分，以便后续开展RNA测序及标准基因表达分析流程。因此，可对根瘤的转录组和翻译组进行研究。

一种替代的多聚核糖体纯化.......

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致谢

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本研究由CSIC I+D 2020基金项目（编号282）、FVF 2017基金项目（编号210）以及PEDECIBA（María Martha Sainz）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
植物生长与根瘤菌接种
轨道摇床Daihan Scientific型号 SHO-1D
YEM培养基AmrescoJ850（酵母提取物）0122（甘露醇）
水分亏缺处理
KNO3Merck221295
气孔计Decagon Device型号 SC-1
解剖刀
细胞质提取物的制备
Brij L23Sigma-AldrichP1254
离心机Sigma型号 2K15
氯霉素Sigma-AldrichC0378
环己酰亚胺Sigma-AldrichC7698
脱氧胆酸钠（DOC）Sigma-Aldrich30970
二硫苏糖醇（DTT）Sigma-AldrichD9779
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）Sigma-AldrichE3889
Igepal CA 360Sigma-AldrichI8896
KClMerck1.04936
MgCl2Sigma-AldrichM8266
塑料组织研磨器Fisher Scientific12649595
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-AldrichP7626
磷酸三乙酯（PTE）Sigma-AldrichP2393
TrisInvitrogen15504-020
吐温X-100（Triton X-100）Sigma-AldrichT8787
吐温20（Tween 20）Sigma-AldrichP1379
称量皿 Deltalab1911103
蔗糖垫层的制备
蔗糖Invitrogen15503022
SW 40 Ti 转子Beckman-Coulter
超速离心机Beckman-CoulterOptima L-100K
超速离心管Beckman-Coulter34405913.2 mL 离心管
RNA提取与质量控制
琼脂糖Thermo scientificR0492
生物分析仪Agilent型号 2100，真核生物总RNA纳米检测
氯仿DI41191
乙醇DorwilUN1170
异丙醇Mallinckrodt3032-06
糖原Sigma10814-010
TRIzol LSAmbion102960028
其他
15 mL Falcon管Biologix10-0152
10 µL 滤芯吸头BioPointe Scientific321-4050
1000 µL 滤芯吸头BioPointe Scientific361-1050
20 µL 滤芯吸头BioPointe Scientific341-4050
200 µL 滤芯吸头Tarsons528104
1.5 mL 微量离心管Tarsons500010-N
2.0 mL 微量离心管Tarsons500020-N
测序公司Macrogen
无菌250 mL 锥形瓶Marienfeld4110207

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377(2013).
  2. Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legu....

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RNA

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