本方案描述了一种从完整大豆根瘤中纯化真核多聚核糖体的方法。测序后，可使用标准的基因表达分析流程，鉴定转录组和翻译组水平上差异表达的基因。
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摘要
摘要
本实验方案旨在提供一种研究大豆（Glycine max）共生根瘤中真核生物转译组的策略。本文描述了优化的方法，用于分离植物来源的多核糖体及其相关mRNA，并通过RNA测序进行分析。首先，在保持多核糖体和RNA完整性的条件下，通过对整块冷冻的大豆根瘤进行匀浆，获得细胞质裂解物。随后，通过低速离心清除裂解物中的杂质，取上清液的15%用于总RNA（TOTAL）的提取。剩余的澄清裂解物则用于通过两层蔗糖垫（12% 和 33.5%）超速离心分离多核糖体。多核糖体沉淀经重悬后，提取与其结合的mRNA（PAR）。TOTAL和PAR均通过高灵敏度毛细管电泳进行质量评估，以确保达到RNA-seq测序文库的质量标准。作为下游应用的一个示例，在测序完成后，可使用标准的基因表达分析流程，获得转录组和转译组水平上的差异表达基因。总之，该方法结合RNA-seq技术，可用于研究共生根瘤等复杂组织中真核mRNA的翻译调控过程。
引言
豆科植物（如大豆（Glycine max））能够与一类称为根瘤菌的特定土壤细菌建立共生关系。这种互利共生关系会诱导植物根部形成一种新的器官——共生根瘤。根瘤是容纳细菌的植物器官，由宿主细胞组成，其细胞质中定殖着一种特化的根瘤菌形式，称为类菌体。这些类菌体可催化大气氮气（N2）还原为氨，氨随后被转移给植物，以换取碳水化合物1,2。
尽管这种固氮共生关系是研究最为深入的植物-微生物共生关系之一，但仍有许多方面有待进一步阐明，例如植物在不同非生物胁迫条件下如何调节其与共生伙伴的相互作用，以及这种调节如何影响根瘤的代谢过程。通过分析根瘤的翻译组（即正在被活跃翻译的信使RNA [mRNAs] 子集），可更深入地理解这些过程。多核糖体或多聚核糖体（polysomes）是与mRNA结合的多个核糖体形成的复合物，常用于翻译研究3。多聚核糖体分析法旨在分析与多聚核糖体结合的mRNA，已成功用于研究在多种生物学过程中调控基因表达的转录后机制4,5。
传统上，基因组表达分析主要集中在测定 mRNA 的丰度6,7,8,9。然而，由于基因表达在转录后调控（特别是翻译过程）的不同阶段，转录本水平与蛋白质水平之间缺乏相关性10,11,12。此外，转录组水平上的变化与翻译组水平上的变化之间并未观察到依赖关系13。直接分析正在被翻译的 mRNA 集合，能够比仅分析 mRNA 水平时更准确、更全面地测量细胞基因表达（其最终产物为蛋白质丰度）14,15,16。
本实验方案描述了如何通过在双层蔗糖垫中进行差速离心，从完整的大豆根瘤中纯化植物来源的多核糖体（图1）。然而，由于根瘤中也存在类菌体来源的核糖体，因此所获得的产物为核糖体与RNA组分的混合物，尽管真核生物来源的组分仍占主要部分（90%–95%）。本文还介绍了后续的RNA分离、定量及质量控制方法（图1）。该方案结合RNA-seq技术，可为共生根瘤等复杂组织中真核mRNA的翻译调控研究提供实验结果。
图 1：从共生根瘤中纯化真核多聚核糖体的拟议方法的示意图。 该示意图概述了本实验方案中的各个步骤，包括（1）植物培养和（2）根瘤收获，（3）制备胞质提取物、（3）获得总 RNA（TOTAL）样品和（4）多聚核糖体相关 mRNA（PAR）样品，以及（5）RNA 提取与质量控制。缩写：PEB = 多聚核糖体提取缓冲液；RB = 重悬缓冲液；TOTAL = 总 RNA；PAR = 多聚核糖体相关 mRNA。请点击此处查看本图的高清版本。
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方案
1. 植物培养与根瘤菌接种
- 为获得所需的根瘤，选择适宜的基质，在生长室的受控条件下播种大豆种子。
注意：本实验方案中，将种子播种于装有沙子与蛭石混合物（1:1）的 0.5 L 塑料瓶中。生长室设置昼夜温度分别为 28 °C /20 °C，光照与黑暗光周期分别为 16 h/8 h。光合有效辐射强度为 620 µmol·m−2·s−1。 - 提前配制液体酵母提取物甘露醇（YEM）培养基（见材料表），并进行高压灭菌。
- 在播种当天，将 Bradyrhizobium elkanii U1302 菌株接种至含有 100 mL YEM 培养基的三角瓶中，在 28 °C、100 rpm 的振荡条件下培养。
- 让根瘤菌生长 2 天后，取 2 mL 菌液接种幼苗。
2. 水分亏缺处理（可选）
注意：本方案概述了对大豆植株进行水分亏缺处理的方法。根据具体的研究问题，该部分内容可作相应修改或完全省略。
- 将大豆幼苗在无水分限制条件下培养19天（V2-3发育阶段）。用B保持基质处于田间持水量&D培养基17 添加 0.5 mM KNO₃3.
- 第20天停止浇水。
注意：此处，在植株生长和水分亏缺期间，每天通过称重法（水分重力含量）测定含水量。 - 每天使用孔隙计按照制造商说明在叶片远轴面测量气孔导度，每个样本重复三次（参见 材料表），从第20天持续至水分亏缺期结束。
注意：水分亏缺期的结束时间对每株植物 individually 确定，即当其气孔导度值约为播种后第20天测得值的50%时。
3. 根瘤收获
- 用洁净容器收集液氮，并标记15 mL离心管（每株植物一支）。
注意：操作液氮时需佩戴低温手套、面罩和护目镜。 - 逐一取出植物，剪除并丢弃地上部分，用清水彻底清洗根部以去除残留基质。
- 将每个根瘤从根部分离，并收集至预冷的15 mL离心管中。迅速冷冻离心管，并于−80 °C保存。
4. 细胞质提取物的制备
注意：本实验方案的最终目标是获得高质量的总RNA（TOTAL）和多聚核糖体相关RNA（PAR）。因此，操作过程中需采取防止RNA降解的条件，始终将样品保持在4 °C，并使用无RNase的实验器材和溶液。除非另有说明，所有溶液均使用无菌超纯水配制。
- 缓冲液母液的制备
- 制备 表1 中所列的可高压灭菌母液，高压灭菌15分钟，并在室温下保存。
- 制备 表1 中所列的可过滤灭菌母液，经滤膜过滤除菌后，置于 −20 °C 保存。
- 配制多聚核糖体提取缓冲液（PEB，见 表1），并将其置于冰上备用。
注意：所列体积适用于六个样品。 - 将离心机预冷至 4 °C，并将 2 mL 微量离心管置于冰上。
- 在称量皿中称取约 0.2 g 完整根瘤，转移至预冷的 2 mL 离心管中。
注意：此步骤应迅速操作，以避免样品解冻。也可使用约 0.4–0.5 mL 的根瘤体积代替 0.2 g 的质量。 - 加入 1.2 mL PEB，使样品在冰上解冻 2 分钟，然后使用组织研磨器充分匀浆，直至根瘤完全破碎并均匀悬浮。
注意：样品解冻后应立即研磨，此时根瘤组织已足够柔软，易于在微量离心管中使用组织研磨器（见 材料表）破碎。冷冻状态的根瘤难以研磨。建议将离心管置于台式冷却器（0 °C）中进行匀浆，以确保样品保持低温。 - 将样品置于冰上，轻柔振荡孵育 10 分钟，或直至所有样品处理完毕。
- 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 15 分钟，沉淀细胞碎片。小心收集上清液，并重复离心一次。
- 小心收集澄清的胞质提取液，取 200 µL 分装至洁净的 1.5 mL 微量离心管中，用于 TOTAL 样品的制备（见第7节）。
5. 蔗糖垫的制备
注意：本实验方案使用两层蔗糖垫（12% 和 33.5%），置于 13.2 mL 超速离心管中（参见材料表）。所有溶液均使用无菌超纯水配制。
- 配制蔗糖和盐的储备溶液。
- 配制 100 mL 的 2 M 蔗糖溶液（68.5%，表 1）。
- 配制 10 倍浓度的盐溶液（表 1）。
- 按照 表 2 所述配制蔗糖垫的两层溶液。抗生素（CHX 和 CHL）储备溶液的组成见 表 1。
注意：所列体积适用于制备六个蔗糖垫。 - 将 4.5 mL 的 33.5% 蔗糖层溶液加入离心管中。然后，使用 P1000 微量移液器小心缓慢地加入 4.5 mL 的 12% 层溶液。将离心管置于冰上，直至加入澄清的胞质提取物。
6. 多聚核糖体纯化
- 用移液器将1 mL澄清的胞质提取物（步骤4.8）小心地沿离心管管壁加至蔗糖垫上方。
- 将超速离心管转移至预冷的转子吊桶中，在4 °C条件下以217,874 × g （参考转子中为35,000 rpm [见材料表]）离心2小时。
- 弃去剩余的胞质提取物和蔗糖垫，用200 µL预冷的RB缓冲液（按表1预先配制）重悬多核糖体沉淀。
- 冰上孵育30分钟，然后将重悬的多核糖体溶液转移至1.5 mL预冷离心管中。随后进行RNA提取（PAR样品）。
7. RNA 提取与质量控制
注意：此步骤适用于总样本（步骤 4.8）和 PAR 样本（步骤 6.4）。
- 使用无菌超纯水配制75%乙醇，并将其冷却至−20 °C。同时，将氯仿和异丙醇也冷却至−20 °C。
- 用750 µL RNA提取试剂对样品进行匀浆处理，并在室温下孵育5分钟。
- 加入200 µL预冷的氯仿，剧烈振荡离心管15秒，然后在室温下孵育10分钟。
- 在4 °C下以12,000 × g离心15分钟以实现相分离。小心转移500 µL上层水相至新的洁净离心管中，避免扰动粉红色的有机相；加入375 µL预冷的异丙醇和0.5 µL无RNase的糖原（参见材料表）。通过移液器反复吹打充分混匀。
注：糖原是一种作为共沉淀剂的载体，用于提高从醇沉淀中回收核酸的效率。 - 在4 °C下孵育混合物10分钟，然后以12,000 × g离心15分钟，弃去上清液。
- 用1 mL预冷的75%乙醇洗涤RNA沉淀，短暂涡旋混匀。
注：此时样品可在−20 °C下保存过夜。 - 在4 °C下以7,500 × g离心5分钟，小心使用微量移液器移除上清液，并将RNA沉淀在空气中干燥。
- 将沉淀溶解于50 µL无RNase的水中，并在65 °C下孵育5分钟。
- 使用高灵敏度毛细管电泳18（参见材料表）和/或在2%无RNase的琼脂糖凝胶上进行电泳19（参见材料表）评估RNA浓度和完整性。
注：如果RNA样品不会立即使用，或需送往测序平台进行RNA-seq文库构建，建议使用乙醇将其沉淀保存。
8. RNA 沉淀
- 将离心机和乙醇预冷至 4 °C。
- 配制 3 M 醋酸钠溶液。
- 使用无菌超纯水配制 70% 乙醇，并将其冷却至 −20 °C。
- 估算样品体积。加入 0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠、3 倍体积的冷乙醇以及 0.5 µL 无 RNase 的糖原。充分混匀。
- 置于 −20 °C 保存，直至使用。
注意：沉淀后的 RNA 样品可在 −80 °C 下保存长达 1 年。
9. 基因表达分析的标准流程
- 进行平均约 4000 万条 Illumina 双端测序读长，读长长度需 >100 bp，以确保转录组和翻译组数据分析的可靠性。
注意：标准 RNA-seq 数据分析包括以下步骤 9.2–9.5。 - 使用 FastQC（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/） 或用于多样本分析的 MultiQC20 进行测序读长质量检查。
- 使用 Trimmomatic21、BBDuk（http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/）、cutadapt22、sickle23 或 Trim Galore（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）等工具去除接头序列和低质量序列。
- 若该物种有参考基因组，可使用 Bowtie224、TopHat225 或 Salmon26 进行测序读长比对至参考基因组，随后使用 featureCounts27 等开源工具进行丰度定量。
- 使用 edgeR28、DESeq229 或 limma30 等工具进行差异表达基因的统计分析。
注意：这些开源软件可通过命令行在本地运行，也可通过公共服务器（如 Galaxy31 或 GEOexplorer32）在网页浏览器中操作，后者提供图形用户界面，无需掌握命令行知识即可使用。
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结果
采用上述方法纯化的总RNA（TOTAL）和多聚体RNA（PAR）组分的得率与质量评估是判断实验成功与否的关键，因为对于大多数后续应用（如RNA测序）而言，高质量的样品是文库构建和测序的基础。此外，RNA分子的完整性能够真实反映样本采集时刻的基因表达谱状态18。在此背景下，使用Bioanalyzer进行检测时可获得RNA完整性数值（RIN）。RIN用于以一种稳健、可靠且不受人为因素影响的方式对RNA完整性进行评分，评分范围从10（完整）到1（完全降解）18。
图 2A、B 展示了高灵敏度毛细管电泳系统（Bioanalyzer）对多个 TOTAL 和 PAR 样品组分的标准输出结果。所有样品均表现出非常好的质量，因为可以清晰地观察到锐利的核糖体 RNA（rRNA）条带，无任何拖尾现象。然而，这并未体现在 RIN 值上，其范围在 5.9 至 7.5 之间，对应于非完整 RNA 样品。尽管如此，如
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讨论
在转译水平上研究基因表达调控对于深入理解各种生物学过程至关重要，因为细胞基因表达的最终产物是蛋白质的丰度13,14。可通过分析特定组织或生物体的转译组来实现这一目标，其中需纯化多聚核糖体组分，并分析其结合的mRNA3,4,34,35,36。
本文介绍了一种通过蔗糖垫纯化大豆共生根瘤多聚核糖体的方法，并随后进行TOTAL和PAR提取。该方案的一个关键点在于可同时获得两种RNA组分，以便后续开展RNA测序及标准基因表达分析流程。因此，可对根瘤的转录组和翻译组进行研究。
一种替代的多聚核糖体纯化...
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致谢
本研究由CSIC I+D 2020基金项目（编号282）、FVF 2017基金项目（编号210）以及PEDECIBA（María Martha Sainz）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 植物生长与根瘤菌接种 | |||
| 轨道摇床 | Daihan Scientific | 型号 SHO-1D | |
| YEM培养基 | Amresco | J850（酵母提取物）0122（甘露醇） | |
| 水分亏缺处理 | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| 气孔计 | Decagon Device | 型号 SC-1 | |
| 解剖刀 | |||
| 细胞质提取物的制备 | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| 离心机 | Sigma | 型号 2K15 | |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| 环己酰亚胺 | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| 脱氧胆酸钠（DOC） | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA） | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 塑料组织研磨器 | Fisher Scientific | 12649595 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| 磷酸三乙酯（PTE） | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| 吐温X-100（Triton X-100） | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 吐温20（Tween 20） | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 称量皿 | Deltalab | 1911103 | |
| 蔗糖垫层的制备 | |||
| 蔗糖 | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti 转子 | Beckman-Coulter | ||
| 超速离心机 | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| 超速离心管 | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL 离心管 |
| RNA提取与质量控制 | |||
| 琼脂糖 | Thermo scientific | R0492 | |
| 生物分析仪 | Agilent | 型号 2100，真核生物总RNA纳米检测 | |
| 氯仿 | DI | 41191 | |
| 乙醇 | Dorwil | UN1170 | |
| 异丙醇 | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| 糖原 | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| 其他 | |||
| 15 mL Falcon管 | Biologix | 10-0152 | |
| 10 µL 滤芯吸头 | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| 1000 µL 滤芯吸头 | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| 20 µL 滤芯吸头 | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| 200 µL 滤芯吸头 | Tarsons | 528104 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Tarsons | 500010-N | |
| 2.0 mL 微量离心管 | Tarsons | 500020-N | |
| 测序公司 | Macrogen | ||
| 无菌250 mL 锥形瓶 | Marienfeld | 4110207 |
参考文献
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