福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀免疫组化对照的标准化处理

免疫组织化学（IHC）是调查和诊断病理学中最常用的检测方法之一。根据上下文和测定，IHC用于协助癌症诊断¹，2，^预测治疗反应3，4，^鉴定病原体⁵，表征患病组织中的细胞类型6，以及研究生物学途径和^{组织反应7，8}。在所有情况下，IHC测定的基本原理是抗体特异性结合目标靶标，最常见的是蛋白质，并且该结合事件随后在组织切片⁹中可视化。然而，任何IHC检测的最大挑战之一是确保抗体特异性检测目标靶标¹⁰。抗体特异性在大多数免疫测定中是一个挑战，但免疫组织化学提供了独特的挑战，因为没有二级指标（如分子量）来区分特异性和非特异性标记。在评估表征不良或普遍表达且缺乏明确定义的细胞定位模式的靶标时，这尤其麻烦。因此，在开发新的IHC检测方法¹⁰时，有助于表征结合特异性的稳健质控至关重要。

对于具有特征性细胞表达模式的明确定义的靶标，组织对照经常用于IHC方法开发。基于丰富的先前数据，可以确定抗体是否标记了已知表达的组织、细胞和亚细胞区室，并且它没有标记不应存在的组织成分¹¹。然而，组织对照对于表征不良、没有已知表达模式的新靶标或广泛表达且缺乏独特表达模式的蛋白质的用途有限。在这两种情况下，由于缺乏明确的表达模式，因此无法区分组织中的特异性和非特异性标记。在这些情况下，细胞沉淀提供了一种有价值的替代IHC对照。细胞沉淀对照可以包括:癌症或其他细胞系，这些细胞系具有目标蛋白的内源性或内在/非诱导表达水平，其蛋白表达可以通过蛋白质印迹、流式细胞术分析或转录分析推断;过度表达目的蛋白或目的编码基因被删除的工程细胞系;或在特定条件下处理以诱导感兴趣的蛋白质表达或信号传导事件（例如磷酸化）^{的细胞10，12}。细胞系中表征良好的蛋白质表达水平还允许通过使用一组具有高、中、低和不存在蛋白质表达的细胞系来评估测定的灵敏度。此外，工程细胞沉淀可能是兽医物种有价值的物种特异性对照，其表征或可用的组织对照可能有限¹³。虽然细胞沉淀有其局限性，例如细胞系中存在的蛋白质组有限，无法反映组织中的多样化蛋白质组，但它们可作为合适的对照，用于确认抗体可以检测目标靶标，并排除一抗、二抗或其他受体的不加选择的结合¹⁰。

诊断和研究病理学中的大多数组织固定在中性缓冲福尔马林中，在一系列醇中脱水，在二甲苯中清除，并在石蜡中加工和包埋。福尔马林固定交联蛋白质，固定和组织处理中的每一个附加步骤都可以直接影响蛋白质和抗体检测它们的能力^9，14。因此，重要的是，IHC测定中使用的任何对照都要经过相同的固定、组织处理和包埋程序。本文介绍了处理和包埋培养细胞的独特注意事项，以作为在福尔马林固定石蜡包埋组织中开发IHC测定的对照，该方法主要侧重于在组织学实验室中处理和处理细胞沉淀。

1. 细胞沉淀制备

1. 在四到八个150mm² 或八个x T175烧瓶中，在推荐用于细胞系的培养基和条件下将细胞生长至80%-90%汇合。例如，在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中用10%胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺¹⁵培养293T细胞。
   注意:应使用感兴趣的细胞系所需的条件和培养基生长细胞¹⁶。这些条件可能因细胞系而异，但下游沉淀方法应适用于独立于培养条件的细胞系。
2. 一旦细胞接近汇合（80%-90%），用真空移液管吸出生长培养基，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞。
3. 向每个烧瓶中加入5mL的5-10mM EDTA，并将烧瓶在37°C孵育5-10分钟。轻轻敲击烧瓶的侧面以移开细胞。
   注意:不要使用胰蛋白酶，因为这会裂解表面表位，从而对某些抗原产生不利影响。
   1. 细胞脱落后，向每个烧瓶中加入 5 mL 用于细胞系的生长培养基（例如，用于 293T 细胞的 DMEM），然后将细胞转移到 50 mL 锥形管中。
4. 在室温下以930× g 离心锥形管5分钟。离心后，通过真空移液器抽吸除去培养基和EDTA。
5. 在 10-20 mL 的 1x PBS 中洗涤细胞沉淀，如果使用多个板或烧瓶，则将板或烧瓶中的细胞（ 图 1 中描述的实验中大约六个 T175 烧瓶）汇集到单个 50 mL 锥形管中。
6. 将试管以930 x g 离心5分钟。用真空移液器离心后吸出PBS。
7. 将细胞沉淀管放在湿冰上直至固定。
   注意:保持细胞冷却以限制降解酶活性并最大限度地减少细胞的自溶和相关蛋白质变化，包括蛋白质定位的变化。

2. 细胞沉淀的固定

1. 通过将 30 mL 的 10% 中性缓冲福尔马林添加到 3 mL 细胞沉淀中来执行固定，以产生 10:1（体积:vol）的固定剂与细胞的比例。
2. 反复倒置紧密盖的 50 mL 管，直到细胞完全悬浮。
   注意:在完全固定之前形成缩合细胞沉淀会导致固定不均匀，导致在以后的染色和免疫标记过程中出现伪影。
3. 让细胞悬液在室温下沉降过夜。
4. 第二天重新倒置试管以重悬细胞，增加表面体积比以改善固定。
   注意:不需要也不建议涡旋细胞沉淀，因为它可能会导致细胞损伤。

3. 细胞沉淀的修剪和加工

1. 固定24小时后，将50mL锥形管在5°C下以930× g 离心10-15分钟。确保试管盖紧，均匀分布并在离心机中平衡。
   注意:可以修改固定时间以反映实验室使用的组织固定时间或特定实验条件的要求。
2. 离心后，确保细胞形成可见的沉淀。通过倾析和/或使用无菌转移移液器小心吸出来去除固定剂。
3. 将熔融（40-60°C）羟乙基琼脂糖基凝胶（参见 材料表）以1:4（vol:vol）凝胶与细胞沉淀的比例添加到细胞沉淀中。
4. 使用干净的 5 英寸、2 mm 尖端 Sterling 探头，用自来水冲洗眼睛，将熔融凝胶轻轻搅拌到固定细胞沉淀中，在 50 mL 锥形管底部的熔融凝胶中产生固定细胞的均匀悬浮液（图 1A）。
5. 将带有熔融凝胶与固定细胞沉淀混合的盖盖50mL锥形管放在湿冰上5-10分钟以固化凝胶细胞沉淀。
6. 使用干净的微型刮刀，沿着管子的侧面放置刮刀并轻轻地利用颗粒而不刺穿它，小心地从锥形管中取出颗粒。将颗粒放在活检纸上。
7. 使用干净的微型刮刀，将细胞沉淀切成4-5毫米厚的切片，因此每片可以放入26 mm x 26 mm x 5 mm组织盒中（图1B）。
8. 将单个凝胶颗粒切片放在一张活检纸的中心。将活检纸的两个相对端折叠在颗粒上，将其包裹起来。将包裹的颗粒放入26 mm x 26 mm x 5 mm组织盒中。关闭盖子，用组织盒盖卷曲活检包装的展开侧（图1C）。
9. 将修剪好的细胞沉淀盒放入装有10%中性缓冲福尔马林的组织处理器蒸馏器中，并以较短的处理计划运行。
   注意:短处理计划包括每个蒸馏器中的30分钟，从10%中性缓冲福尔马林开始，通过一系列逐渐分级的醇脱水，在三次二甲苯变化中清除，并在两次变化中以石蜡渗透结束60°C熔融渗透/包埋石蜡（56°C熔点）。

4. 细胞沉淀的包埋

1. 将处理好的盒放入包埋中心的保持区域。
2. 打开组织盒盖，小心地展开活检纸。
3. 将细胞沉淀放入一个小的 15 mm x 15 mm 一次性包埋模具中，切面朝下。
   注意:一个小包埋模具允许最多三个细胞沉淀切片安装在一个未染色的组织载玻片上，用于IHC测定。
4. 同时用镊子轻轻地将细胞沉淀保持在模具底部，将62°C的组织浸润/包埋石蜡加入模具中，覆盖细胞沉淀。
5. 将模具移动到冷块上，开始固化石蜡。在石蜡凝固时调整细胞沉淀，以将它们固定在模具底部的适当位置。
6. 从盒中取下盖子。将暗盒自下朝下放在包埋模具的顶部，并添加额外的熔融石蜡以覆盖暗盒。
7. 当石蜡填充在组织盒上时，将模具放回冷块中以固化^17，18。

5. 细胞沉淀切片

1. 使用切片厚度为20μm的旋转切片机修剪细胞沉淀块，直到石蜡块的整个表面和细胞沉淀被捕获在石蜡切片带中。这称为"面向"块。
2. 冷却并将面孔块浸泡在冰浴托盘上5-15分钟，以在切片前冷却和保湿块。
   注意:当块水合时，细胞沉淀将在石蜡带中半透明。如果不透明，则需要更多浸泡，并且可能存在伪影。
3. 使用旋转切片机在连续切割模式下以4μm或其他所需厚度切片细胞颗粒块的石蜡带。
4. 将石蜡带放在设置为42°C的水浮浴上。
5. 将使用旋转切片机制备的石蜡切片从浮选浴中拾取到带正电的载玻片上。
   1. 将第一部分放在载玻片顶部的盖玻片和染色边界内，将第二部分放在其下方，将第三个细胞沉淀部分放在其下方（图1D）。
   2. 切片后，将载玻片在室温（约23°C）下干燥24小时，然后在60°C下干燥30分钟。
      注意:在60°C下烘烤载玻片后，细胞沉淀切片可与任何标准IHC方案一起使用，包括使用热诱导和基于酶的抗原检索的方案⁹。

加入琼脂糖基凝胶后，细胞沉淀应形成易于处理的固体凝胶状物质（图1B）。一旦嵌入，颗粒将具有类似于固体组织的稠度，并且应该相对容易在切片机上常规切片。一旦细胞沉淀被嵌入，它们就可以以与福尔马林固定、石蜡包埋组织相同的方式用于组织学和IHC实验。这包括使用热诱导表位或酶促抗原修复与间接显色检测方法（例如，使用具有辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺检测的二抗，如图2和图3所示）使用商业IHC平台9。在组织学上，细胞应均匀分散在整个切片中，细胞聚集最少，尽管贴壁细胞可能在沉淀中维持其细胞间相互作用。这种分散体允许区分单个细胞，尽管这种区分会受到凝胶沉淀内细胞大小和相对密度的显着影响。细胞核、细胞质和细胞膜在分散时更清晰，更容易可视化（图 2）。在图2中，三个细胞系被免疫标记为TEAD转录因子。用棕色二氨基联苯胺 （DAB） 显色原观察免疫标记。细胞系具有不同水平的TEAD转录因子表达，从无表达（图2A）到弱表达（图2B），再到强表达（图2C）。在本例中，在细胞核中观察到标记，正如转录因子所预期的那样，并且在细胞质和细胞膜中不存在标记，它们是可见的，但缺乏标记（图2）。细胞沉淀可以掺入标准23 mm x 75 mm x 1 mm载玻片上的细胞沉淀微阵列（图3）。将细胞沉淀掺入微阵列中可以评估同一载玻片中具有不同表达水平的对照。在本例中，PEG10缺陷小鼠胚胎干细胞（左）作为阴性对照，过表达PEG10的293T细胞（右，棕色免疫标记）作为微阵列中的阳性对照（图3）。将包含在微阵列中的细胞沉淀的组织和包埋程序没有变化，并且可以使用类似于用于组织的方法生成微阵列19。

图 1:细胞沉淀处理。 （A） 将细胞沉淀在 50 mL 锥形管中并与凝胶混合。（B）凝固后，将颗粒连续切片以适合26 mm x 26 mm x 5 mm组织盒。（C）细胞沉淀在放入组织处理器之前用活检纸包裹。（D）在单个25 mm x 75 mm玻璃组织学载玻片上最多可以连续收集三个细胞沉淀。请点击此处查看此图的大图。

图 2:具有不同水平蛋白质或转录本表达的细胞沉淀可用于评估测定的动态范围。 细胞沉淀被免疫标记为TEAD转录因子，并显示出不同水平的TEAD表达。（A）DAUDI细胞缺乏TEAD表达，在细胞质或细胞核中没有免疫标记。蓝色染色是苏木精核的复染剂。（B）293T细胞表现出TEAD转录因子的弱核标记（棕色二氨基联苯胺（DAB）色原）。（C）底特律562细胞强烈表达TEAD如细胞核中强烈的棕色标记所示。在细胞核内标记，但未标记细胞质（棕色细胞核周围的灰白色至灰色区域），表明免疫组织化学测定的适当标记。请注意，在所有三种细胞系中，细胞都是分散的，允许可视化单个细胞，包括它们的核和细胞质形态。比例尺 = 25 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:使用具有不同蛋白表达水平的多个细胞沉淀创建的细胞沉淀微阵列允许在单个载片中同时评估对照。 PEG10缺陷小鼠胚胎干细胞（左）和过表达PEG10的293T细胞（右）被免疫标记为PEG10。虽然在过度表达PEG10的293T细胞中观察到强标记（棕色DAB显色原），但在PEG10缺陷细胞中没有明显的标记。蓝色代表苏木精复染。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。

所有作者都是基因泰克/罗氏的员工，因此是罗氏的股东。