用于子宫内膜蜕膜化研究的去卵巢小鼠人工蜕膜化模型的建立

摘要

本文介绍了利用卵巢切除小鼠建立人工蜕膜化模型的方法，这是子宫内膜蜕膜化研究领域中一种经典的子宫内膜蜕膜化实验。

摘要

子宫内膜蜕膜化是一种独特的子宫内膜分化过程，与月经和妊娠密切相关。蜕膜化功能障碍可导致多种子宫内膜疾病，例如不孕、复发性流产和早产。在生殖研究中，子宫内膜蜕膜化模型的建立与应用长期以来一直是生殖领域研究者的关注重点。小鼠已被广泛用于生殖及蜕膜化研究。目前关于蜕膜化的研究已有三种成熟的小鼠模型，分别为自然妊娠蜕膜化（NPD）、人工蜕膜化（AD）和体外蜕膜化（IVD）。其中，AD 被认为是小鼠蜕膜化的一种可靠模型，具有操作简便且接近 NPD 的特点。本文重点介绍一种经过改良的小鼠人工蜕膜化模型构建与应用方法，该方法结合卵巢切除术以排除卵巢因素的影响，可获得组内变异小、高度可重复的实验结果。该方法为子宫内膜蜕膜化研究提供了一个良好且可靠的动物模型。

引言

随着人类辅助生殖技术的发展，目前临床妊娠率 体外 体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的妊娠率已达到甚至超过自然妊娠水平。然而，在辅助生殖临床实践中，仍有大量患者经历多次胚胎移植却未能成功妊娠。但其具体的分子机制尚不明确，导致临床干预效果不佳，这也是生殖医学领域面临的重要挑战之一。^1,2.

子宫内膜因素约占体外受精（IVF）失败原因的三分之二³。人类胚胎着床分为三个阶段：定位、黏附和侵入^4,5,6。母体子宫内膜会经历一系列变化，以迎接胚胎的到来。形成着床的"窗口期"，为胚胎着床提供有利条件^7,8。

在大多数哺乳动物中，囊胚附着于子宫腔上皮后，其周围的基质细胞迅速开始增殖和分化，间质发生快速重塑，从而改变其形态和功能，促进胚胎着床^5,9,10。着床部位体积和重量的迅速增加使囊胚得以嵌入子宫基质，这一过程称为蜕膜化¹¹。子宫内膜基质发生分化和重塑，为妊娠做好准备，而基质细胞的转变则为蜕膜细胞发挥功能提供了空间和新的信号连接^12,13。基质细胞转化为蜕膜细胞，并分泌多种标志性因子，如催乳素（PRL）、胰岛素样生长因子结合蛋白1（Igfbp1）等。研究表明，蜕膜化异常是导致胚胎着床失败的关键原因之一，但其具体成因尚不明确，仍需进一步阐明^1,14。

小鼠人工蜕膜化模型对于研究蜕膜化的生理过程及其分子机制至关重要。人工蜕膜化（AD）主要是指通过人工方法建立子宫内膜蜕膜化过程，以模拟妊娠或月经周期。在形态学上，妊娠相关的蜕膜化与人工蜕膜化之间整体差异甚微^15,16。蜕膜形成前，子宫腺体存在于子宫内膜中，而在蜕膜化后则消失。在基因表达方面，自然妊娠蜕膜化（NPD）与人工蜕膜化之间仅存在轻微差异¹⁵。因此，小鼠人工蜕膜化模型可用于模拟妊娠过程中的蜕膜化，进而探索人类生殖系统疾病未知的发病机制及新的治疗方法。

NPD、AD 和 体外 蜕膜化（IVD）是实现小鼠蜕膜化的三种方法。自然妊娠诱导的蜕膜化（NPD）模型依赖于自然妊娠，最接近母体生理状态，包含胚胎的影响。通过比较植入部位与非植入部位的差异，是研究蜕膜化更为生理化且便捷的方法。人工蜕膜化（AD）模型通过向假孕雌性小鼠子宫内注射芝麻油作为刺激物来诱导蜕膜化，该模型使用与输精管结扎雄鼠交配的雌鼠以避免胚胎影响。NPD和AD模型在不同研究目的中均发挥重要作用，但均无法避免因母体激素代谢活性差异所导致的交配失败和组内差异。IVD是一种在细胞水平上依赖联合雌激素和孕激素处理的方法，对实验条件和操作技术要求更为严格。然而， 体外 模型无法在生理条件下完全模拟蜕膜反应¹⁵因此，我们提出一种基于传统蜕膜化方法改进的简单且优化的诱导方法，以减少内源性激素对蜕膜化的影响。该方法在确保蜕膜化诱导成功的基础上，更接近生理状态，更适合需要排除胚胎因素干扰的实验。

方案

所有所述动物实验均经南京大学医学院附属鼓楼医院动物使用与护理委员会批准（编号：20171202）。所有操作均遵循相应的动物护理与使用机构及国家指南。

注意：小鼠饲养在特定病原体阴性（SPF）环境中，温度为 22 °C ± 1 °C，相对湿度为 50% ± 1%，光照/黑暗周期为 12 小时/12 小时，并可自由获取食物和水。

1. 小鼠卵巢切除术

1. 手术前1天使用高温高压灭菌器对手术器械进行灭菌。
2. 称重8周龄C57BL/6小鼠，并通过腹腔（i.p.）注射 根据需要注射1%戊巴比妥钠以麻醉小鼠，所用剂量为40 mg/kg¹⁷该剂量可提供40–60分钟的镇静作用，满足卵巢切除术的要求。术前镇痛可在小鼠皮下注射5 mg/kg美洛昔康。
   注意：小鼠麻醉成功的表现包括深部肌肉反射消失和呼吸平稳。麻醉成功的体征包括触碰内眦时不眨眼、拉出舌头时不吞咽、捏脚趾间皮肤时不屈腿，以及针刺尾巴时不弹跳。
3. 涂抹保护性眼膏于眼球表面，以防止麻醉期间眼球干燥。
4. 当小鼠完全麻醉后开始手术操作。将小鼠俯卧位固定于手术台面上，用肥皂水润湿背部后剃除毛发。剃毛后用70%乙醇消毒皮肤。
5. 在后肢大腿根部上缘距脊柱平行方向0.5 cm（或肋骨下方1.0 cm）处确定手术切口位置图1A).
   注意：正确的切口位置对于快速定位卵巢至关重要。
6. 以切口部位为中心，用碘伏对切口区域消毒3次，然后在切口周围铺无菌手术巾。
7. 使用剪刀做一个长约0.5–1.0 cm的纵向切口。切开筋膜，并用镊子被动分离肌肉。
8. 在切口区域中，透过薄层肌肉组织，在靠近肾脏下极的位置找到一块白色脂肪垫图1B).
   注意：白色脂肪垫是卵巢位置最明显的指示标志。
9. 用止血夹夹住脂肪团，将被脂肪垫包裹的卵巢从切口拉出。
10. 用弯头镊子夹住卵巢与输卵管连接处，沿卵巢蒂用剪刀切除卵巢。使用电凝笔或在酒精灯上加热的1 mL注射器针头止血。
    注意：务必保留输卵管，它是将芝麻油注入子宫角时的解剖学标志。
11. 用生理盐水冲洗手术切口以防止组织粘连，使用4-0缝线分别缝合肌肉和皮肤，并再次用碘伏对手术切口进行消毒。
12. 将小鼠俯卧置于笼中，在配备光源和通风系统的25 °C培养箱中复苏约2小时。
13. 术后注意观察小鼠，将其单独放回原来的饲养位置，直至完全恢复，并提供充足的水和食物。

2. 术后休息及雌激素和孕激素制剂

1. 小鼠在卵巢切除术后需静养 2 周。
2. 在超净工作台内，将雌激素（2 ng/µL）和孕酮（0.2 ng/µL）加入芝麻油中，置于无 RNA 酶的离心管内。
3. 将离心管放入 37 °C 恒温水浴中，并持续振荡以加速溶解。
4. 待完全溶解后，将芝麻油溶液分装为每份 100 µL，便于使用。将配制好的雌激素和孕酮溶液储存于 4 °C 冰箱中。

3. 人工诱导蜕膜化模型

1. 每只小鼠皮下（s.c）注射 100 ng 雌激素 溶于 50 µL 芝麻油中，连续注射 3 天，随后休息 2 天¹⁵。
   注意：确保雌激素和孕酮已分别配制并存放于不同位置。若雌激素被孕酮污染 ，可能导致实验失败。
2. 每只小鼠皮下（s.c.）注射 1 mg 孕酮和 10 ng 雌激素 溶于 50 µL 芝麻油中，连续注射 3 天¹⁵。
3. 在第三次雌激素-孕酮联合注射后 6 小时，对小鼠进行手术以建立人工蜕膜化模型¹⁵。
4. 在输卵管下端找到子宫角，沿子宫角缓慢注入 20 µL 芝麻油，将组织复位，缝合切口，并让小鼠恢复。手术方法与小鼠卵巢切除术相同¹⁵。 
   注意：仅在卵巢切除术成功的情况下才进行第二次手术（皮肤切口愈合良好，卵巢完全切除，输卵管残端未与周围组织粘连）。
   注意：诱导人工蜕膜化模型时，20 µL 芝麻油剂量适宜；超过 20 µL 易穿透至对侧。
5. 每只小鼠皮下（s.c.）注射含 1 mg 孕酮和 10 ng 雌激素的 50 µL 芝麻油（H.），连续注射 4 天。详见 图 2^15,18。

4. 样本采集

1. 使用二氧化碳窒息法处死小鼠（n = 6），取出子宫。观察双侧子宫的形态，拍照并称量子宫角的重量（图3A，B).
2. 用10%甲醛固定3-5 mm的子宫组织，经石蜡包埋后切片。切片经苏木精和伊红染色，以观察形态学变化¹⁹ (图4A).
3. 将另外3-5 mm的子宫组织包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中，置于液氮中冷冻后，储存于−80 °C冰箱。将组织冷冻切片至10 µm厚度，采用偶氮偶联法检测子宫组织中的碱性磷酸酶活性。²⁰ (图4B).
   注意：检测碱性磷酸酶（ALP）含量可使用冷冻切片，而非石蜡切片，即可获得满意结果。
4. 使用Trizol试剂提取子宫总RNA，并在实时PCR系统上进行定量实时PCR（qPCR）材料表) 与 qPCR 预混液（材料表检测催乳素家族8亚家族成员2（Prl8a2）、碱性磷酸酶肝/骨/肾型（Alpl）的相对mRNA表达水平, 胰岛素样生长因子结合蛋白1（Igfbp1）¹⁵ 通过归一化至18S mRNA水平（图 4C-）。按照以下PCR条件进行：第一阶段，95 °C 预变性30秒；第二阶段，95 °C 变性10秒，60 °C 退火延伸30秒，循环40次。全部引物序列列于 表1.
5. 使用2−ΔΔCt法分析qPCR数据^-ΔΔCT 方法和适当的软件中进行统计分析的t检验方法。在本研究中，p < 0.05 被视为具有统计学意义。

结果

小鼠蜕膜化模型的评价指标包括子宫的一般形态、蜕膜化与非蜕膜化子宫的质量比、子宫内膜的组织学形态以及蜕膜化标志分子的表达水平。经油诱导产生的小鼠人工蜕膜化子宫的一般形态更接近妊娠状态下的子宫，子宫体增厚，宫腔较未诱导侧缩小。诱导侧子宫角的体积和重量均显著高于未诱导侧。图3A,B）。子宫组织的HE染色显示，诱导侧腺体消失，子宫内膜间质细胞分化为体积大、圆形、胞质丰富且多核的蜕膜细胞，细胞边界不清。未诱导侧切片显示子宫内膜组织处于正常生理状态下的形态图4A）。偶氮偶联法结果显示，油诱导侧的碱性磷酸酶含量显著高于非诱导侧（图4B）。qPCR 结果显示，mRNA 表达水平 Prl8a2, Alpl，以及 Igfbp1 在诱导侧子宫角中的水平显著高于非诱导侧，表明油脂可诱导小鼠产生人工蜕膜化（图 4C-

讨论

小鼠的蜕膜化是一个依赖于胚胎存在的自发过程，这与人类不同。然而，研究发现，诸如向子宫内注射玻璃珠或造成子宫损伤等人工刺激可替代胚胎诱导子宫内膜发生蜕膜化。此外，研究人员发现许多因素能够诱导蜕膜形成或参与蜕膜化过程，例如向宫腔内注射类固醇激素、前列腺素和生长抑制因子²¹。与上述建模方法相比，本文所述的小鼠模型通过卵巢切除术并使用芝麻油作为刺激物，可排除内源性雌激素和孕激素的影响，因此具有经济且操作简便的优点。

应完整切除卵巢，以防止残留卵巢组织，否则会影响后续蜕膜化的诱导。此步骤旨在减少卵巢产生的内源性雌激素和孕激素的影响。应避免损伤输卵管，因为在将芝麻油注入子宫腔时，可利用输卵管作为寻找子宫的标志。如果发生腹腔粘连或输卵管切除，操作者必须注意区分子宫与肠管。

皮下注射过程中容易发生油剂渗漏。应选择腹部皮肤作为皮下注射部位，并避开乳头区域。注射油剂后应缓慢拔出针头。若小鼠活动导致无法顺利拔针，容易引起渗漏。应用棉球按压注射部位片刻，以防止渗漏。本操作中使用外源性雌激素和孕激素注射，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
雌激素	Sigma	E2758	激素补充剂
孕酮	Sigma	P0130	激素补充剂
芝麻油	Sigma	S3547	激素补充剂
戊巴比妥钠	Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.		麻醉剂
美洛昔康注射液	齐鲁动物保健品有限公司		镇痛剂
碱性磷酸酶染色试剂盒（Kaplow法/偶氮偶联法）	Solarbio	G1480	碱性磷酸酶染色
伊红	Servicebio	G1005-2	HE染色
苏木精	Servicebio	G1005-1	HE染色
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02	qPCR
70%乙醇	Lircon	ZH1120090	消毒剂
碘伏	润泽康	RZK-DF	消毒剂
红霉素眼膏	广州白云山		小鼠眼球保护
4-0缝线	Ethicon	W329	切口缝合
10%福尔马林	玉露	L25010118	组织固定
最佳切割温度化合物	Sakura	4583	切片
Trizol试剂	Ambion	15596018	qPCR