用于临床前心脏风险评估的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞结构与收缩变化的杂交细胞分析系统

摘要

分析人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞收缩功能和细胞完整性的变化，对于非临床药物开发具有重要意义。一种混合式96孔细胞分析系统能够以实时且符合生理条件的方式同时检测这两个参数，从而获得可靠且与人体相关的结果，为安全进入临床阶段提供必要支持。

摘要

心脏收缩力评估对于新疗法的开发及其安全地进入临床阶段具有重要意义。尽管人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）有望在药物发现和安全性药理学的临床前阶段提供一种与人体相关性较高的模型，但其成熟度在科学界仍存在争议，并处于持续优化之中。本文介绍一种结合收缩力与阻抗/细胞外场电位（EFP）的混合技术，可在行业标准的96孔平台上显著增强心肌细胞的成熟特征。

阻抗/场电位（EFP）系统可实时监测细胞功能。除了检测收缩细胞的搏动频率外，电学阻抗谱读数还可识别化合物诱导的形态学变化，如细胞密度以及细胞单层完整性的改变。在该混合细胞分析系统的另一组成部分中，细胞被培养在生物相容性膜上，此类膜可模拟真实心肌组织的机械环境。这种生理环境有助于人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）的成熟。 体外，从而产生更接近成人的收缩反应，包括在异丙肾上腺素、S-Bay K8644 或 omecamtiv mecarbil 处理后的正性肌力效应。收缩力幅度等参数（mN/mm）²以及搏动持续时间还可揭示影响电生理特性和钙处理化合物的下游效应。

该混合系统为全面的细胞分析提供了理想工具，能够实现超越当前基于人类相关细胞检测方法的临床前心脏风险评估。

引言

现代药物研发的主要目标之一是提高新药在药物发现流程中从实验室到临床应用的成功率。这些新药的安全药理学测试常常揭示出对心血管系统的不良反应，此类反应几乎占到了临床前阶段药物淘汰率的四分之一¹。新方法学（NAMs）的开发与整合在临床前评估现代化进程中发挥着关键作用，尤其是针对心脏等核心测试器官。由于这些方法不依赖动物实验，过去十年中，基于诱导多能干细胞（iPSC）来源的心肌细胞（CMs）等人源细胞模型已成为现代安全药理学和毒理学评估的主要工具²。目前广泛使用的检测系统包括微电极阵列（MEA）和基于电压敏感性染料的实验方法³。

然而，该细胞类型所声称的表型和功能上的不成熟性，为建立理想的人源细胞模型带来了障碍，有可能加大非临床研究与临床研究之间的转化差距⁴。

多年来，研究人员开展了大量工作，以探究人类诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）呈现未成熟表型的原因，并寻求促进其成熟进程的方法。 体外.

缺乏心脏成熟信号（如延长的细胞培养时间、周围缺乏其他细胞类型或缺乏激素刺激）已被证明会影响成熟过程⁵。此外，常规细....

方案

注意：收缩力和阻抗/场电位（EFP）测量的工作流程见补充图2。

1. 包被平板

1. 打开真空密封包装，取出96孔板。两个模块的96孔板操作流程相同。在收缩力检测模块中测量前，保持收缩板由额外提供的膜保护层覆盖。
2. 包被柔性96孔板，用于接种心肌细胞。
   1. 在无菌离心管中加入2.75 mL即用型EHS凝胶溶液，再加入8.25 mL含Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS，配制稀释的EHS凝胶包被溶液，并轻轻混匀。
      注：也可选择使用纤连蛋白进行孔板包被：在无菌离心管中，将650 µL纤连蛋白储存液（1 µg/mL）用13 mL含Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS稀释，配制成13 mL、50 µg/mL的工作液，并轻轻混匀。
3. 将包被溶液转移至放置在实验室自动化机器人中的无菌试剂储液槽中。
4. 使用实验室自动化机器人运行程序"ADD100µL"，每孔加入100 µL包被溶液。将盖子重新盖回96孔板，并在37 ˚C孵育3小时。
   ​注：实验室自动化机器人的程序需预先手动设置。

2. 将人iPS....

结果

厄洛替尼（一种激酶抑制剂）对hiPSC-CMs收缩功能的影响如图1所示。细胞经10 nM至10 µM浓度范围的药物处理5天，每日记录搏动参数。厄洛替尼是一种表皮生长因子受体（EGFR）和酪氨酸激酶抑制剂，其心脏毒性风险相对较低，在微摩尔浓度范围内仅对hiPSC-CMs产生轻微的剂量和时间依赖性影响。在最低浓度（10 nM）下，药物处理后1小时的首次测量中，厄洛替尼引起振幅出现统计学上不显著的下降；而在后续所有测量时间点，该浓度下均未观察到类似效应。这种短暂的下降可能是药物作用的结果，也可能是加药过程中由于温度或机械因素导致搏动模式短暂干扰所致。厄洛替尼在微摩尔浓度下表现出轻微但显著的时间和剂量依赖性心脏毒性效应。使用1 µM厄洛替尼处理96小时后开始观察到效应，而10 µM浓度则在加药后24小时即引起显著的抑制作用。

化疗药物表柔比星对hiPSC-CMs具有时间和剂量依赖性效应（图2）。在加入10 µM表柔比星后24小时内，细胞停止搏动。使用1 µM时，24小时后.......

讨论

阻抗/EFP/收缩力混合系统是一种综合性方法，可用于临床前药物开发中心脏毒性的高通量安全性药理学和毒理学评估。该系统提供了一种无需使用动物模型的现代临床前安全性测试方法，且具备更高的通量能力，可显著缩短时间和降低成本。该系统有望作为兰格多夫心脏模型及其他动物模型的补充方法，用于临床前功能性和结构性毒性评估。

作为一种无动物实验的方法，人源iPSC-CMs被用于该杂交系统²⁰。在此，具有促进人源iPSC-CMs成熟效应的特殊柔性96孔板相较于其他基于细胞的检测方法具有重要优势^21,22，因为该系统将高通量与生理环境独特地结合，从而实现更接近成人心脏表型的人源心脏风险评估^6,15。

该实验方案中最关键的步骤是化合物的施加，尤其是在需要检测急性效应时。由.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
商用的人iPSC来源心肌细胞	Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)	R1059
离心机（50 mL 管）	Thermo Fisher Scientific	15878722
12通道可调移液器（100–1250 μL）	Integra Biosciences	4634
含Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS	GE Healthcare HyClone	SH304264.01
96孔深孔板	Thermo Fisher Scientific	A43075
EHS胶			细胞外基质胶
FLEXcyte 96/CardioExcyte混合设备	Nanion Technologies	19 1004 1005	混合细胞分析系统
FLX-96 FLEXcyte传感器板	Nanion Technologies	20 1010
纤连蛋白储存液（可选，替代Geltrex）	Sigma Aldrich	F1141
Geltrex hESC认证、即用型、低生长因子基底膜基质	ThermoFischer Scientific	A1569601
人iPSC来源心肌细胞铺板与维持培养基	FCDI	R1059
培养箱（37 °C，5% CO₂）	Thermo Fisher Scientific	51023121
层流罩	Thermo Fisher Scientific	51032678
NSP-96 CardioExcyte 96传感器板 2.0 mm透明型	Nanion Technologies	20 1011
移液器吸头（1250µL）	Integra Biosciences	94420813
试剂储液槽	Integra Biosciences	8096-11
刻度移液管（例如 25 mL）	Thermo Fisher Scientific	16440901
单通道可调移液器（例如 100–1000 μL）	Eppendorf	3123000063
真空抽吸系统	Thermo Fisher Scientific	15567479
可选：VIAFLO ASSIST	Integra Biosciences	4500	实验室自动化机器人
水浴锅（37 °C）	Thermo Fisher Scientific	15365877