在此，我们描述了一种用于可视化水母中具有干细胞特性的增殖细胞的实验方案 枝螅整体荧光标记 原位 利用干细胞标志物进行杂交可检测类干细胞，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记则可用于鉴定增殖细胞。结合两种方法，可检测处于活跃增殖状态的类干细胞.
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
刺胞动物门包括海葵、珊瑚和水母，表现出多样的形态和生活方式，体现在固着生活的水螅体和自由游动的水母体中。这一点在已建立的模式生物中尤为明显，例如 水螅 和 Nematostella，干细胞和/或增殖细胞参与刺胞动物水螅体的发育与再生。然而，大多数水母（尤其是其水母体阶段）中这些过程的潜在细胞机制仍不明确，因此，建立一种可靠的特定细胞类型鉴定方法至关重要。本文介绍了一种用于可视化水螅水母中具有干细胞特征的增殖细胞的实验方案 Cladonema pacificum. 枝螅 水母具有分枝的触手，这些触手在整个成体阶段持续生长并保持再生能力，为研究由增殖细胞和/或干细胞样细胞调控的细胞机制提供了一个独特的平台。整体荧光标记 原位 利用干细胞标记物进行荧光原位杂交（FISH），可检测类干细胞；通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）脉冲标记（S期标记物），可识别增殖细胞。结合FISH与EdU标记技术，我们能够在固定样本动物中检测处于活跃增殖状态的类干细胞，该方法可广泛应用于其他动物，包括非模式水母物种。
引言
刺胞动物门被认为是一个基底分支的多细胞动物门类，其动物具有神经和肌肉组织，这使其在理解动物发育和生理进化方面处于独特地位1,2。刺胞动物分为两大类：珊瑚虫纲（例如海葵和珊瑚）仅具有浮浪幼虫和固着生活的水螅体阶段；而水母亚门（包括水螅纲、十字水母纲、钵水母纲和立方水母纲的成员）通常具有自由游泳的水母体，即水母，同时也具有浮浪幼虫和水螅体阶段。刺胞动物通常表现出很强的再生能力，其潜在的细胞机制，特别是成体干细胞和增殖细胞的存在，已受到广泛关注3,4。最初在Hydra中发现的水螅纲干细胞位于外胚层上皮细胞之间的间隙区域，通常被称为间质细胞或i细胞3。
水螅类i-细胞具有一些共同特征，包括多能性以及广泛保守的干细胞标志物的表达（例如， Nanos、Piwi、Vasa）以及迁移潜能3,5,6,7,....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 探针合成
- RNA 提取
- 使用剪去尖端的 3.1 mL 转移移液管，将三只在人工海水（ASW）中培养的活体 Cladonema 水母放入 1.5 mL 离心管中，并尽可能去除多余的 ASW。
注：ASW 是通过将矿物盐混合物溶解于添加了氯中和剂的自来水中制备而成；最终比重（S.G.）为 1.018，或千分比（ppt）约为 27。 - 将 1.5 mL 离心管置于液氮中冷冻，以抑制 RNase 活性。加入已添加 2-巯基乙醇（每 100 µL 裂解缓冲液中加入 1 µL）的总 RNA 提取试剂盒中的裂解缓冲液 30 µL，并使用匀浆器在裂解缓冲液中充分匀浆样品。
注：为避免缓冲液和样品从管中溢出，建议使用少量裂解缓冲液进行匀浆。 - 加入 570 µL 裂解缓冲液，并按照总 RNA 提取试剂盒的操作说明提取总 RNA（图 1）。
- 使用分光光度计测定所提取 RNA 的浓度，并于 −80 °C 保存直至使用。
- 使用剪去尖端的 3.1 mL 转移移液管，将三只在人工海水（ASW）中培养的活体 Cladonema 水母放入 1.5 mL 离心管中，并尽可能去除多余的 ASW。
- cDNA 合成
- 使用试剂盒，以从水母中提取的....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
Cladonema 触手已被用作研究形态发生和再生过程中细胞活动的模型15,16,17触手结构由一个上皮管构成，其中干样细胞或称i-细胞位于近端区域，称为触手球；新的分支沿球体远端区域的近轴侧后端依次添加图3A)15先前的报道表明，通过EdU或BrdU标记，细胞增殖在触手基部和新的分枝位点均较为活跃。16,17。然而，由于分辨率的 原位 杂交，目前尚不清楚干细胞样细胞是否真正具有增殖活性。为了在细胞水平上同时可视化干细胞样细胞和增殖细胞，我们对干细胞标志物进行了荧光原位杂交（FISH）Nanos1 或 Piwi以及对同一样本中S期细胞进行EdU标记。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
增殖细胞和干细胞在形态发生、生长和再生等多种过程中是重要的细胞来源21,22。本文描述了一种在枝螅水母（Cladonema）中通过FISH对干细胞标志物Nanos1进行染色并结合EdU标记的共染方法。以往利用EdU或BrdU标记的研究表明，增殖细胞主要定位于触手 bulbs16,17，但其分子特征尚不明确。本研究实现了增殖细胞分布与Nanos1+类干细胞定位的同步检测（图4）。结果显示，部分增殖细胞表达Nanos1，而另一些细胞仅被EdU标记且不表达Nanos1，提示存在干细胞异质性，或可能存在其他类型的增殖细胞。未来进一步解析在枝螅（Cladonema）的不同生物学过程（包括触手分支、组织稳态、器官再生以及生殖细胞维.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由日本医疗研究开发机构（AMED）资助，资助编号为JP22gm6110025（受资助人：Y.N.），以及日本学术振兴会（JSPS）科研费资助，资助编号为22H02762（受资助人：Y.N.）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL 移液管 | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-Gal） | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 正向引物 | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ | ||
| Cladonema pacificum Nanos1 反向引物 | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi 正向引物 | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi 反向引物 | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ | ||
| Click-iT EdU 细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 488 染料 | Invitrogen | C10337 | EdU 试剂盒 |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | 氯中和剂 |
| DIG 核酸检测试剂盒封闭试剂 | Roche | 11175041910 | 封闭缓冲液 |
| DIG RNA 标记混合物 | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS 感受态细胞 DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | 感受态细胞 |
| Fast gene 凝胶/PCR 提取试剂盒 | Fast gene | FG-91302 | 凝胶提取试剂盒 |
| Fast gene 质粒小提试剂盒 | Fast gene | FG-90502 | 质粒小量制备 |
| 甲酰胺 | Wako | 068-00426 | |
| 猪来源肝素钠盐 | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| 异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | Wako | 096-05143 | |
| LB 琼脂 | Invitrogen | 22700-025 | 琼脂平板 |
| LB 肉汤基础 | Invitrogen | 12780-052 | LB 培养基 |
| 马来酸 | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA 柱 | Roche | 11814427001 | 纯化柱 |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC 微量紫外-可见分光光度计（带 Wi-Fi） | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | 分光光度计 |
| 聚氧乙烯（20）失水山梨醇单月桂酸酯（Tween-20） | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | 匀浆器 |
| 蛋白酶 K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase 抑制剂 | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74004 | 总 RNA 提取试剂盒 |
| RQ1 无 RNase 的 DNase | Promega | M6101 | |
| 20 倍盐溶液柠檬酸钠缓冲液粉末（20x SSC） | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | 矿物质盐混合物 |
| T3 RNA 聚合酶 | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA 聚合酶 | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | 杂交孵育器 |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA 聚合酶 |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st 链 cDNA 合成试剂盒 | TaKaRa | 6210A | cDNA 合成试剂盒 |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 载体 |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus 花青素 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | 酪胺信号放大（TSA）技术 |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | 激光共聚焦扫描显微镜 |
参考文献
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
